專利名稱：：一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量pcr試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒，同時(shí)還涉及熒光定量PCR試劑盒的用途，適用于對(duì)血清制品中的牛腺病毒3型污染進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，同時(shí)廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)査，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
：牛腺病毒3型屬于腺病毒屬腺病毒科，基因組是雙鏈的DNA分子，主要引起牛的呼吸道和腸道疾病。其主要特征為肺炎、腸炎、結(jié)膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，是犢牛死亡的重要原因之一，病和隱性感染的牛均可排毒，并能使與其接觸的易感牛感染。其易感和潛伏性給畜牧業(yè)及其國(guó)際貿(mào)易帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，該病歷來(lái)都是國(guó)際社會(huì)最為關(guān)注的傳染病之一。牛腺病毒的快速檢測(cè)是控制和消滅該病的前提，但腺病毒的常規(guī)檢測(cè)方法有一些不足之處，檢測(cè)技術(shù)一般來(lái)說(shuō)有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類1.血清學(xué)診斷技術(shù)包括補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)、凝集實(shí)驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、沉淀實(shí)驗(yàn)、免疫電泳技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫試驗(yàn)和免疫電鏡技術(shù)等。在這些方法中得到普遍承認(rèn)、采用并且廣泛應(yīng)用的有補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、間接血凝實(shí)驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)。但由于所有實(shí)驗(yàn)均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，材料多，準(zhǔn)備周期長(zhǎng)，檢測(cè)具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。2.生物學(xué)試驗(yàn)包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。這種檢測(cè)方法存在不敏感問(wèn)題，而且有些樣品中存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測(cè)效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本高，周期長(zhǎng)，浪費(fèi)生物資源和人力物力。3.分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括核酸雜交、等電點(diǎn)聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、單克隆抗體技術(shù)等。核酸雜交、等電點(diǎn)聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳等檢測(cè)方法更適用于對(duì)病毒特性進(jìn)行更加深入的研究，由于整個(gè)系統(tǒng)操作復(fù)雜，過(guò)程繁多，成本高，不適宜同時(shí)迸行大批量檢測(cè)，因而受到很大限制。相比之下，普通PCR方法特異性好，檢測(cè)靈敏度高，不但可以檢測(cè)活病毒核酸，也能直接檢測(cè)滅活的核酸片段。樣品可以是牛血清，也可以是扁桃體、淋巴結(jié)、脊髓、肌肉和皮膚等組織，這是免疫學(xué)方法無(wú)法替代的。但這種傳統(tǒng)的定量方法測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。因此，如何快速、準(zhǔn)確測(cè)定牛腺病毒是面臨的主要難題之一。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR(FluorogeneticQuantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析(NellemannC,VinggaardAM，DalgaardM，etal,QuantificationofAntiandrogenEffectDeterminedbyLightCyclerTechnology[J].Toxicology,2001，163:29-38)、病原體的定性(McGoldrickA,LowingsJP,IbataG，etal.ANovelApproachtotheDetectionofClassicalSwineFeverVimsbyRT-PCRwithaFluorogenicProbe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods,1998，72:125-135.;BhudeviB，WeinstockD.FluorogenicRT-PCRassay(TaqMan)forDetectionandClassificationofBovineViralDiarrheaVirus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量檢測(cè)(KathyF丄Tang,JunWang,DonaldV丄ightner.QuantitationofTaurasyndromevirusbyreal-timeRT-PCRwithaTaqManassay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;MichaelaSchwaiger,PascalCassinotti.Developmentofaquantitativereal-timeRT-PCRassaywithinternalcontrolforthelaboratorydetectionoftickborneencephalitisvirus(TBEV)RNA[J].J.Clin.Microbiol"27(2003)136-145.;R.FrankCook"，S丄Cooka,etal.Developmentofamultiplexreal-timereversetranscriptase-polymerasechainreactionforequineinfectiousanemiavirus(EIAN)[J].丄Virol.Methods,105(2002)171-179.;BirgitLiss*.Improvedquantitativereal-timeRT-PCRforexpressionprofilingofindividualcells[J].NucleicAcidsRes"2002，Vol.30No.17e89.;FranckHousseaualimberlyR丄indseya,1，etal.Quantitativereal-timeRT陽(yáng)PCRasamethodformonitoringTlymphocytereactivitytofull-lengthtyrosinaseproteininvaccinatedmelanomapatients[J].J.Immunol.Methods266(2002)87-103.;DesireN，DeheeA，SchneiderV，etal,QuantificationofHumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralLoadbyaTaqManReal-TimePCRAssay[J].J.Clin.Microbiol,2001,39:1303-1310.;MartellM，GomezJ,EstebanJI,etal.High-ThroughputReal-TimeReverseTranscription-PCRQuantitationofHepatitisCVirusRNA[J].J.Clin.Microbiol,1999,37:327-332.;KearnsAM,TurnerAJL,EltringhamGJA，etal.RapidDetectionandQuantificationofCMVDNAinUrineusingLightcycler-basedReal-timePCR[J].J.Clin.Virol,2002,24:131-134;FlorenceKP,GlauciaPB,MireilleS，etal.QuantitationofHCVRNAusingreal-timePCRandfluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119;ZakhartchoukA,ConnorsW,vanKesselA，etal.Bovineadenovirustype3containingheterologousproteinintheC-terminusofminorcapsidproteinIX.Virology,2004,320(2):291-300.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量主要方法，國(guó)內(nèi)目前已有關(guān)于丙肝、乙肝、支原體、艾滋病、結(jié)核定量檢測(cè)的試劑盒上市。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒適用于目前存在市場(chǎng)上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測(cè)范圍廣，穩(wěn)定性好。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染腺病毒3型流行病學(xué)調(diào)査中的應(yīng)用，可高效方便地對(duì)血清制品中的牛腺病毒3型污染進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，同時(shí)可廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，該熒光定量PCR試劑盒包括a)DNA提取試劑，b)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板，e)PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征在于引物序列分別為正義引物(FP):5'-CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA-3'，反義引物(RT):5'-CCTACCGAACCGACGCAGAT-3'，擴(kuò)增子大小為100bp，熒光探針序列為5'-FAM-TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA-TAMRA-3'(SEQIDNO:3)，探針的5'端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM,靠近3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入腺病毒3型pol蛋白100bp片段的pGEM-T載體(購(gòu)自Promega公司)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購(gòu)自Invitrogen公司，普通大腸桿菌DH5a)，增殖后提取質(zhì)粒制備，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26o定量并10倍梯度稀釋。所述的PCR熒光定量反應(yīng)液由10xbuffer、10pM的正義引物和反義引物、l(HiM的熒光探針和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、無(wú)核酸酶的無(wú)菌水組成。所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板DNA序列為GGTAG。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，熒光定量反應(yīng)液由正義引物(FP)，反義引物(RT)，熒光探針(TaqMan),10xbuffer溶液，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，無(wú)核酸酶的滅菌雙蒸水組成；在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，熒光定量反應(yīng)液由10xbuffer溶液2.5pl,10pmol/L正義(FP)、反義(RP)引物各3nl，10(imol/L熒光探針0.75|nl，dNTPs(10mM)1^1，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.25|nl，Mg2SO4(50mM)0.5^1，無(wú)核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(購(gòu)自Promega公司)載體制備，于紫外分光光度計(jì)測(cè)A，定量并10倍梯度稀釋。實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品制備過(guò)程為PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體(購(gòu)自promega公司)4'C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR鑒定陽(yáng)性后送英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果將篩選的陽(yáng)性克隆菌接種到含氨卞的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，用SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)Omega公司的凝膠純化試劑盒純化后，于紫外分光光度計(jì)測(cè)A260定量，并稀釋至梯度109-102拷貝/&，一7(TC保存，所用一切物品均無(wú)核酸酶。在本發(fā)明提供檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒中，有一條一端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)另一端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒(méi)有熒光信號(hào)的變化。在PCR退火和延伸過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5'-3'外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán)之間的FRET，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對(duì)一的關(guān)系，所以熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)BAV-3的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出。Ct值是PCR過(guò)程中，熒光量的積累超過(guò)基底熒光量的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)牛腺病毒3型的基因組的耙片段特殊性，將反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg^濃度、擴(kuò)增程序等)的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)和定量檢測(cè)系統(tǒng)(包括LigthCycler系統(tǒng)，Roche，ABIPrism系統(tǒng)，PEAppliedBioasystems)相結(jié)合，將其用于各種來(lái)源的牛腺病毒3型樣品的定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，以及與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行比較，建立了定量檢測(cè)BAV-3的方法，并研制出牛腺病毒3型的定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出100個(gè)水平的病毒基因拷貝數(shù)，檢測(cè)范圍可以達(dá)到八個(gè)數(shù)量級(jí)，是其它任何方法無(wú)法比擬的。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面，還提供了一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染腺病毒3型流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用，熒光定量PCR試劑盒對(duì)牛腺病毒3型進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法包括下列步驟A)用e)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(購(gòu)自Promega公司)載體制備，并用紫外分光光度計(jì)定量；B)用a)DNA抽提液從待測(cè)標(biāo)本和陰陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品中提取DNA，然后加C)e)PCR熒光定量反應(yīng)液及其優(yōu)化試劑，b)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針；D)將C)步中已加入了標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的熒光定量反應(yīng)液PCR反應(yīng)體系上機(jī)，用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；E)通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。7在本發(fā)明中提供的檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒可對(duì)各種來(lái)源的牛血清樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)，從而可對(duì)疫情進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，可廣泛用于動(dòng)物產(chǎn)品的進(jìn)出口及動(dòng)物食品的安全檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控，可為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.與傳統(tǒng)定量方法相比，此實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，直接對(duì)PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定Ct値，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上DNA定量。2.檢測(cè)范圍廣，在10M0Vr濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系(R=0.999)，檢測(cè)范圍可以達(dá)到八個(gè)數(shù)量級(jí)，已達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，其靈敏度可檢測(cè)100copies水平，是其它任何方法無(wú)法比擬的。3.適用于各種型號(hào)的熒光定量擴(kuò)增儀，一次實(shí)驗(yàn)中三個(gè)重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于2%，說(shuō)明其極高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。4.該實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線，是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，廣泛用于血清制品中的病毒污染、流行病檢査和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如精編分子生物學(xué)指南，F(xiàn).M.奧斯柏等主編，科學(xué)出版社，1995，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；D丄.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒組成及其反應(yīng)條件A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(衡l滑)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(220nl/管)強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(IOO倍稀釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50)tU/管)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(2.75(il/管)PCR反應(yīng)管(無(wú)菌、無(wú)RNA酶和DNA酶)無(wú)核酸酶H20(2ml/管)臨界陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(50)il/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產(chǎn)品。b)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(2UV1)、c)PCR反應(yīng)液購(gòu)自Takara公司)B).熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25pl):10xbuffer2.5pl，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10nmol/L)，熒光探針0.75nl(10nmol/L)，dNTPs(10mM)1^1，Mg2SO4(50mM)0.5|ul，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品均為5|_U，無(wú)核酸酶的滅菌雙蒸水9nl組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)PCR:94。C2min在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)。對(duì)BAV-3的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct,ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。D).熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)腺病毒3型的靈敏度、檢測(cè)范圍及穩(wěn)定性的用途取標(biāo)準(zhǔn)品DNA109-1020/^d濃度范圍，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)，分別加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為94'C預(yù)變性5min;94°C30s，60°C90s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為Cycle<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>100copies，且穩(wěn)定性好，一次實(shí)驗(yàn)中三個(gè)重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于2%，說(shuō)明其極高的重復(fù)性，適用于各種型號(hào)的熒光定量擴(kuò)增儀，是其它任何方法無(wú)法比擬的。實(shí)施例2熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染腺病毒3型流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(220ili1/管)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(2.75pl/管)強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(100倍稀PCR反應(yīng)管(無(wú)菌、無(wú)RNA酶和DNA酶)釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)無(wú)核酸酶H20(2ml/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)臨界陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產(chǎn)品。b)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(2U/pl)、c)PCR反應(yīng)液購(gòu)自Takara公司)B).熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25pl):10xbuffer2.5(il，正義引物FP(SEQIDN0:1)和反義引物RP(SEQIDN0:2)各3pl(10pmol/L)，熒光探針0,75pl(10^miol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5nl，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品均為5pl，無(wú)核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)PCR:94。C2min94°C30s}4060°C90sCycle在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)。對(duì)BAV-3的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。D).熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)腺病毒3型(1)不同來(lái)源的奶牛血清原料樣本，經(jīng)0.2pM濾器過(guò)濾后，分別配制成5%(體積比)FBSMEM的培養(yǎng)基(lmlFBS加入19mlMEM)，分別編號(hào)為A卜A25;(2)將狀態(tài)良好的原代牛腎細(xì)胞BKC接入6孔板，匯合度約25%,待細(xì)胞貼壁后(約6h)，更換為待檢的5。/。FBSMEM樣本，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37°C，5%(體積比)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天；2000rpm離心5min收集細(xì)胞；(3)上述收集得到的細(xì)胞，倒盡上清，加入20(HdDNA提取液A，振蕩至徹底懸浮，加入4plRNaseA(100mg/ml)，振蕩15s，室溫(20~25°C)5min;(4)加入20nl蛋白酶K，混勻(5至20次)；7(TC放置10min，至溶液變清亮，瞬時(shí)離心，去除管內(nèi)壁的水珠；(5)加入200pd無(wú)水乙醇，充分混勻15s，瞬時(shí)離心；(6)將上一步溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，12000rpm離心30s，棄廢液；(7)吸附柱中加入500nlDNA提取液C(使用前加入3.4ml無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(8)吸附柱中加入70(^1DNA提取液D(使用前加入10ml無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(9)吸附柱中加入500^1DNA提取液D，12000rpm離心30s，棄廢液；(10)空離吸附柱，12000rpm離心2min，涼干；(11)20(^1無(wú)核酸酶水加入吸附柱，室溫2-5min,12000rpm離心2min;(12)得到的DNA用于下游的FQ-PCR實(shí)驗(yàn)。E)取D步所提DNA5^1,熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25^1):10xbuffer2.5^1，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3|^1(10pmol/L)，熒光探針0.75pl(10pmol/L)，dNTPs(10mM)l|al，Mg2SO4(50mM)0.5pl，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.25|il，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品均為5pl，無(wú)核酸酶的滅菌雙蒸水9pl，分別加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為94。C預(yù)變性2min;94。C30s，60°C90s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行,檢測(cè)波長(zhǎng)為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(copies/ml)Al6-905-A24-042-A32-082-A403-6116-A56-730-A62-147-A7114-A82-009-A96-065-A102-034-All7-021-A126-256-A135-189-A145-148-A157-134-A166-312(L69士0.54)x1050.30A175-177-A182-149-A19106-A205-188-A216-248-A222-067-A236-237C2.05士1.27)x1052.01A242-257-A25601-陰性對(duì)照-陽(yáng)性對(duì)照(3.90士1.05)x10100.19以上結(jié)果表明，奶牛編號(hào)為6-312，6-237的奶牛血清中含有BAV-3，表明13牛攜帶BAV-3,同時(shí)證實(shí)了牛腺病毒3型熒光定量PCR試劑盒能成功應(yīng)用于BAV-3流行病學(xué)調(diào)査，牛血清以及牛血液制品的監(jiān)測(cè)，重復(fù)性好，CV值均小于2X。實(shí)施例3熒光定量PCR試劑盒在市售牛血清產(chǎn)品中質(zhì)量監(jiān)測(cè)的應(yīng)用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(220pl/管)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(2.75^/管)強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(IOO倍稀PCR反應(yīng)管(無(wú)菌、無(wú)RNA酶和DNA酶)釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)無(wú)核酸酶H20(2ml/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)臨界陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(50nl/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產(chǎn)品。b)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(2U/pl)、c)PCR反應(yīng)液購(gòu)自Takara公司)B).熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25iil):10xbuffer2.5pl，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10pmol/L)，熒光探針0,75|il(10|imol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5^1，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品均為5pl，無(wú)核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)PCR:94°C2min94。C30s}4060。C90sCycle在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)。對(duì)BAV-3的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。D).熒光定量PCR試劑盒檢Gibco、Hyclone、杭州四季青、武漢三利生物技術(shù)有限公司四個(gè)產(chǎn)家的血清是否污染有牛腺病毒3型:1)待檢血清的批號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2)實(shí)驗(yàn)方法(1)培養(yǎng)的原代牛腎細(xì)胞鋪制6孔板x4塊，2ml/L，50%(面積比)匯合度；(2)待檢血清用MEM配制為5%(體積比)工作濃度；(3)細(xì)胞貼壁后，更換為待檢血清配制的培養(yǎng)基，2ml/孔；(4)同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照加含有BAV的5%(體積比)FBSMEM;(5)37°C，5%(體積比)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察是否有CPE的產(chǎn)生。(6)細(xì)胞收集72h后，觀察到陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生了顯著的CPE，收集細(xì)胞，包括脫壁的細(xì)胞，2000rpm離心5min暫存于-8(TC。其余樣品同樣方法處理。提取細(xì)胞的總DNA，作為FQ-PCR的模板。3)細(xì)胞中總DNA的提取(1)上述收集得到的細(xì)胞，倒盡上清，加入200^1DNA提取液A，振蕩至徹底懸浮，加入4nlRNaseA(100mg/ml)，振蕩15s，室溫(20~25°C)5min;(2)加入20pl蛋白酶K，混勻(5至20次)；7(TC放置10min，至溶液變清亮，瞬時(shí)離心，去除管內(nèi)壁的水珠；(4)加入200^1無(wú)水乙醇，充分混勻15s，瞬時(shí)離心；(5)將上一步溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，12000rpm離心30s，棄廢液；(6)吸附柱中加入500plDNA提取液C(使用前加入3.4ml無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(7)吸附柱中加入700^dDNA提取液D(使用前加入10ml無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(8)吸附柱中加入50(^1DNA提取液D，12000rpm離心30s，棄廢液；(9)空離吸附柱，12000rpm離心2min，涼千；(10)20|_U無(wú)核酸酶水加入吸附柱，室溫2-5min，12000rpm離心2min;(11)得到的DNA用于下游的FQ-PCR實(shí)驗(yàn)。E)取D步所提DNA5pl，熒光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25^1):10xbuffer2,5nl，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10(imol/L),熒光探針0.75pl(10[imol/L)，dNTPs(10mM)l|il，Mg2SO4(50mM)0.5^1，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品均為5pl，無(wú)核酸酶的滅菌雙蒸水9pl，分別加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為94。C預(yù)變性2min;94。C30s，60°C卯s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行,檢測(cè)波長(zhǎng)為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為公司名稱血清批號(hào)BAV-3(copies/ml)Gibco749154-949184-719321-719351-7685959D-HycloneNSF0081-NSF0071-NSF0061-NSF0051-NSF0021-杭州四季青0803045.65x105080504-080426-080228-080408-武漢三利20080701-060604-16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上結(jié)果表明杭州四季青公司，批號(hào)為080304的血清中污染了少量的BAV-3，其它公司待檢批號(hào)的血清均表現(xiàn)為BAV-3陰性，同時(shí)表明該試劑盒能用于檢測(cè)細(xì)胞樣品中的病毒。SEQUENCELISTING<110>武漢三利生物技術(shù)有限公司<120>—種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用〈130〉一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用〈160>3<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉22<212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉1CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA22〈210〉2<2U>20〈212〉腿〈213>人工合成<400〉2CCTACCGAACCGACGCAGAT20〈210〉3<211>28<212〉DNA〈213〉人工合成<400〉3TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA28權(quán)利要求1、一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)DNA提取試劑，b)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板，e)PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征是引物序列分別為正義引物5′-CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA-3′，反義引物5′-CCTACCGAACCGACGCAGAT-3′，擴(kuò)增子大小為100bp，熒光探針序列為5′-FAM-TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA-TAMRA-3′，探針的5′端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入腺病毒3型pol蛋白100bp片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒制備，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A260定量并10倍梯度稀釋。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述的PCR熒光定量反應(yīng)液由10xbuffer、10|iM的正義引物和反義引物、10pM的熒光探針和熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、無(wú)核酸酶的無(wú)菌水組成。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板DNA序列為GGTAG4、權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染腺病毒3型流行病學(xué)調(diào)査中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)牛腺病毒3型的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有a)DNA提取試劑，b)熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板，e)PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征是引物序列分別為正義引物5′-CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA-3′，反義引物5′-CCTACCGAACCGACGCAGAT-3′，擴(kuò)增子大小為100bp，熒光探針序列為5′-FAM-TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA-TAMRA-3′，探針的5′端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，靠近3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入腺病毒3型pol蛋白100bp片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒制備，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A₂₆₀定量并10倍梯度稀釋。高效方便地對(duì)血清制品中的牛腺病毒3型污染進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，可廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查，還能為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101560573SQ20091006209公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年5月15日優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日發(fā)明者張國(guó)榮,鄭從義,佳郭申請(qǐng)人:武漢三利生物技術(shù)有限公司