專利名稱：展示表達(dá)甘露聚糖酶的酵母工程菌及其全細(xì)胞甘露聚糖酶制劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是酵母基因工程菌，特別是一種展示表達(dá)甘露聚糖酶的酵母及其 全細(xì)胞甘露聚糖酶制劑的生產(chǎn)方汰是甘露聚糖酶的一種新劑型。
背景技術(shù)：
甘露聚糖酶在造紙帝蝶、食品、紡織、飼料、會^源工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。 在食品行業(yè)，P -甘露聚糖酶能水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖生成甘 露低聚糖，低聚糖作為雙歧桿菌的增殖因子，可有效使體內(nèi)有益菌自然增殖，改善腸道 菌群結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)腸道消化系統(tǒng)功能。因此，甘露低聚糖具有保肝，抗腫瘤，增強(qiáng)免疫 力，加強(qiáng)腸^動，降低膽固醇及抗衰，生理活性。在制皿紙工業(yè)，P-甘露聚 糖酶和0 -木聚糖酶等半纖維素隨酶類協(xié)同作用,用于紙漿漂白和廢紙脫墨，達(dá)到良 好的效果，能明顯改善紙質(zhì)，而且可以M^氯的用量，從而降低生產(chǎn)成本，減輕漸
境的污染。在飼3M4亍業(yè)中，P-甘露聚糖酶被用來分解豆類、谷，其副產(chǎn)品中普遍
存在的一種抗?fàn)I養(yǎng)因子P-D"甘露聚糖，降低消化道內(nèi)容物黏度，破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)， 使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)能與消化酶充分接觸，提高動物內(nèi)源酶(如淀粉酶、胰蛋白W口脂肪酶等) 的活性，改善腸道微生物菌群及提高腸黏膜的完整性等功能。Dvorak試ME實，甘露 寡糖能提高仔豬日增質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率(X4"/m&/2002.80:2887-2894)。在紡織印 染方面，能有效去除產(chǎn)品上黏附的多余染料，降低倉號和環(huán)境污染。同時，在能源工 業(yè)也有不錯的表現(xiàn)，作為油井石油壓裂液的優(yōu)質(zhì)生物破膠劑，中科院微生物所、遼河 油田井下公司和山東沂水酶制劑廠聯(lián)合開發(fā)，將此酶制劑用于低溫油井破膠，為國內(nèi) 外首創(chuàng)，該項目為國家"八五"攻關(guān)計劃(蔡發(fā)國等，新型酶制齊卜e-甘露聚糖酶的研，展，飼料添加劑，2007， 11: 15-22)。
目前，國內(nèi)有關(guān)禾4ff單位廣Sia行了甘露聚糖酶及其相關(guān)內(nèi)容的石開究。如中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼米輛開究所的喬宇等人從枯草芽孢桿菌泡ci""s s"Z^7is中克隆的甘露 聚糖酶在巴斯德畢氏酵母尸ic力is; astoris中泰逸，獲得酶活高達(dá)1102IU/ml (見中國 生物工程雜志，2006， 26(7): 52-56)，該酶:ftSpH為6.0,最適反應(yīng)溫度為55。C。國 夕卜W. H. van Zyl等(JIndMicrobiolBiotechnol (2009) 36:611 - 617)報道了在黑曲霉 中生產(chǎn)甘露聚糖酶，最高酶活達(dá)到了16,596nkat/ml。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是通過基因工程的手段構(gòu)建能高效展示表達(dá)甘露聚糖酶的酵母基因工程 菌，并通過從培養(yǎng)基中離心分離展示表達(dá)甘露聚糖酶活性的工禾呈菌，從而能高效、經(jīng) 濟(jì)的制備可反復(fù)利用的固定化的甘露聚糖酶。
使用的微生物:本發(fā)明涉及的酵母基因工程菌(解脂耶氏酵母K mw^ /^/jyric" HBYnl)，具有高效展示表達(dá)甘露聚糖酶的特性。
該菌株于2009年5月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC No: M209111 ，名稱為解脂耶氏酵母HBYnl (!^WH^/zjw/Wa HBYnl)(以下簡 稱HBYnl)。
HBYnl菌株的菌學(xué)特性
a、 形態(tài)特征解脂耶氏酵母是一種半子囊的異宗交配型酵母，屬于雙態(tài)性真菌， 依據(jù)生長斜牛的不同可以形成酵母或菌絲和假菌絲。
b、 生理生化特征解脂耶氏酵母能利用許多有機(jī)物質(zhì)為原料生長，如n-石蠟， 烷烴類，脂肪酸等。而且，解脂耶氏酵母還被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)為 GRAS(Generally Regarded As Safe)。
HBYnl菌株除具有解脂耶氏酵母的生理生化特 征，同時因插入了甘露聚糖麟因，具有高效展示表達(dá)甘露聚糖酶的特性。
本發(fā)明實現(xiàn)過禾呈將啤酒酵母(51ce^vis^ATCC60715)來源的絮凝蛋白
4(GenBank Accession No.NCJX)l 133)的N端部分基因序列與來源于枯草芽孢桿菌
(^7d〃ws s"6ft7is HB002)的甘露聚糖,因(GenBank Accession No.AF324506)連接，再
將該融合基因插入到解脂耶氏酵母整合皿載體pINA1296 (Journal of Biotechnology
109(2004)63-81)中，構(gòu)建過程如圖l所示。再將重纟!M粒pINA1296-FHM轉(zhuǎn)化解脂
耶氏酵母，從中篩選出高效皿甘露聚糖酶的重組菌株HBYnl。該工程菌產(chǎn)生的甘露
聚糖酶展示于菌體表面，利用搖瓶發(fā)酵至菌液OD6oo達(dá)40以上，其間以粗魔芋粉為底
物，菌體作為酶液，觀啶酶活變化曲線，菌體密度和酶活變化曲線如圖2所示，所得
最高酶活性為62.311;成細(xì)胞干重。領(lǐng)!|定菌體產(chǎn)甘露聚糖酶的驗反應(yīng) 11為5.5-6.5之
間，最適反應(yīng)溫度為50-6(TC之間。由于該工程菌受體菌株為GRAS，被認(rèn)為是安全菌
株，所以該工程菌生產(chǎn)的酶制劑不用除菌體，可直接用于食品，醫(yī)藥。
具體做法通過PCR的方法，用Scem^oe ATCC60715的總基因組作為模板
擴(kuò)增絮凝蛋白(Flocculation)的N端部分基因，并在其反向弓l物引入EcoR I酶切，
用丑^Mfo HB002的總基因組作為模板擴(kuò)增甘露聚糖酶基因，并在其正向引物引入
EcoRI酶切，通過EcoRI酶切，再用T4DNA連接酶將絮凝蛋白的3 '端與甘露聚糖
酶的5'繊接，然后插入到解脂耶氏酵母polg整合表達(dá)載體pINA1296的多克隆位
點，再用NotI把載體線性化后，通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入解脂耶氏酵母polg中，
再將酵母轉(zhuǎn)化子點種在含魔芋粉的底物平板上(2% glucose, 0.132% yeast extract
0. 132% ammonium chloride, 0.032% potassium dihydrogen phosphate, 0.024%
magnesium sulphate heptahydrate， 0.033% vitamine Bb 20mM sodium phosphate
dibasid-citric acid buffer, l%Konjac flour, p朋.O)，篩選出最大水解圈的一株產(chǎn)甘露聚糖
酶的重組菌株HBYnl。
將高效表達(dá)的甘露聚糖酶的酵母基因工程菌經(jīng)固體培養(yǎng)基YPD (1.0% (w/v)
yeast extract, 2.0% (w/v) peptone, 2.0% (w/v) glucose, pH 6.0， 2.0%(w/v) agar)
斜面培養(yǎng)24-36小時后轉(zhuǎn)接至YPD液體i咅養(yǎng)基(1.0% (w/v) yeast extract, 2.0% (w/v)
pq5tone， 2.0% (w/v) glucose, pH 6. 0)中，20-30°C，經(jīng)90—120小時培養(yǎng)，每隔12小時取樣一次并進(jìn)行分析，酶活達(dá)到60 IU/克細(xì)胞干重以上，菌體密度達(dá)到OD600 為40以上，停止培養(yǎng)，離心收集菌體，用0.2M的磷酸鹽緩沖液(pH6.0)清洗2次， 再次離心收集菌體，所得菌體冷凍干燥即得甘露聚糖酶制劑產(chǎn)品。該法生產(chǎn)的甘露聚 糖酶制劑回收率接近100%,且操作簡單，不需復(fù)雜的設(shè)備，大大減少了甘露聚糖酶 的回收工序和成本。
絮凝蛋白(Flo)用于在畢氏酵母中展示表達(dá)有報道(Zhengbing Jiang等，Efficient display of active lipase LipB52 with a /Vc/^ /pos/cWs cell surface display system and comparison with the LipB52 displayed on 5bcc/k raw^yces cerevisiflre cell surface ， BMC BiOtechnol.2008;8:4.)，但是用于解脂耶氏酵母尚未見報道。解脂耶氏酵母展示皿 目前用的;^haemolysin展示表達(dá)(ZhenmingChi等，The Surface Display of the Alginate Lyase on the Cells of Kwrowia /—/Wca for Hydrolysis of Alginate, Marine Biotechnology,
10.1007/sl0126-009-9178-l )。
本發(fā)明率先采用了絮凝蛋白(Flo)用于解脂耶氏酵母的展示表達(dá)，達(dá)到了本發(fā)
明的目的。
本發(fā)明生產(chǎn)的甘露聚糖酶能明顯的降低產(chǎn)品的回收成本，酶經(jīng)過細(xì)胞固定化能反
復(fù)利用，具有更高的市場價值。具體體現(xiàn)如下1)該工程菌能高密度發(fā)酵，搖瓶OD,
達(dá)40以上；2)發(fā)酵過程不需添加誘導(dǎo)物，且能嚴(yán)格地頓駄期高效親；3)酶 學(xué)性質(zhì)好，ffi31細(xì)胞固定化后酶解產(chǎn)物容易分離。在6(TC的半衰期達(dá)65分鐘，另有 很寬的pH值范圍，4)后處理簡單，只需將發(fā)酔液離心或過濾即得到固定化的甘露聚 糖酶。其它甘露聚糖酶后處理精制成本高，相應(yīng)的價格要高，利用酵母基因工程菌 HBYnl生產(chǎn)的活細(xì)胞可直接用于酶的催化，生產(chǎn)成^g對較低。5)該工程菌受體菌 株為GRAS，可用于食品和藥品的生產(chǎn)。
附圖及說明


圖1是本發(fā)明解脂耶氏酵母甘露聚糖酶展示皿，
圖2是本發(fā)明重組菌株HBYnl發(fā)酵生長和酶活變化曲線。
具體實施方式
實施例l
通過GeneBank上公布的序列設(shè)計引物，分別以Scwevis/ae ATCC60715的總基 因組作為模板擴(kuò)增絮凝蛋白N端部分基因和以5. HB002的總基因組作為模板
擴(kuò)增甘露聚糖酶基因，采用酶切連接的方式將以上兩個基因連接，插入解脂耶氏酵母 整合型載體上，化學(xué)法轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母，再將轉(zhuǎn)化子點種在含魔芋粉的底物平板上， 篩選出最大水解圈的一種產(chǎn)甘露聚糖酶的重組菌株HBYnl 。 實施例2
將實施例1得到的重組菌株HBYnl經(jīng)3(TC斜面培養(yǎng)24小時后，轉(zhuǎn)接至50 ml 的YPD液體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)90小時，其間每隔12小時取樣一次并進(jìn)行分析， 菌體密度達(dá)到OD600為40以上，酶g到60IU/克細(xì)胞干重以上，停止培養(yǎng)，收集 菌體，用0，2摩爾的磷酸鹽緩沖液洗2次，再次離心收集菌體，所得菌體冷凍干燥即 得甘露聚糖酶制劑。將，菌體用0.2摩爾的磷,緩沖液配制濃度1%的粗魔芋粉 作為底物，測得甘露聚糖酶的顧反應(yīng)PH為6.0，驗反應(yīng)溫度為55"C， 6(TC的半 衰期為65射中。在55X:反應(yīng)15分鐘，測得甘露聚糖酶酶活為62 .3IU/克細(xì)胞干重， 細(xì)胞的回收率約為100%。 實施例3:
將實施例1得到的重組菌株HBYnl經(jīng)25。C斜面培養(yǎng)36小時后，轉(zhuǎn)接至100 ml 的YPD液體培養(yǎng)基中，2(TC培養(yǎng)120小時，其間每隔12小時取樣一次并進(jìn)行分析， 菌體密度達(dá)到OD600為40以上，酶活達(dá)到60IU/克細(xì)胞千重以上，停止培養(yǎng)，收集 菌體，用0.2摩爾的磷酸鹽緩沖液洗2次，再次離心收集菌體，所得菌體冷凍干燥即 得甘露聚糖酶制劑。將上述菌體用0.2摩爾的磷酸鹽緩沖液配制P/。的M芋粉作為 底物，測得甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH為6. 0，最適反應(yīng)鵬為55"C， 6(TC的半衰期 為65分鐘。在55"反應(yīng)15分鐘，測得甘露聚糖酶酶活為62 JU/克細(xì)胞干重，細(xì)胞 的回收率約為100%。
權(quán)利要求
1、一種展示表達(dá)甘露聚糖酶的酵母工程菌，保藏號為CCTCC NO209111。
2、 一種全細(xì)胞甘露聚糖酶制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于將權(quán)利要求一所述的高 效表達(dá)甘露聚糖酶酵母工程菌HBYnl在YPD固體培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)24-36小時后轉(zhuǎn)接 至YPD液體培養(yǎng)基中，20-30°C，培養(yǎng)9(M20小時，其間每隔12小時取樣一次并進(jìn) 行分析，菌體密度達(dá)到OD600為40以上，酶活達(dá)到60IU/克細(xì)胞干重以上，停止培 養(yǎng)，離心收集菌體，用0,2摩爾pH6.0的磷麟緩沖液清洗2次后，再次離心收集菌 體，所得菌體冷凍干燥即得全細(xì)胞甘露聚糖酶制劑。
3、 一種展示表達(dá)甘露聚糖酶的酵母工程菌，其特征在于^l過S"m;&^絮凝 蛋白N端部分基因在解脂耶氏酵母中展g達(dá)的方法和絮凝蛋白N端部分基因與甘露 聚糖酶基因融合在解脂耶氏酵母中展示表達(dá)的方法完成。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種產(chǎn)甘露聚糖酶的酵母基因工程菌HBYn1和利用HBYn1生產(chǎn)全細(xì)胞甘露聚糖酶制劑的方法，它是將來自B.subtilis HB002的甘露聚糖酶基因和來自S.cerevisiae ATCC60715的絮凝蛋白基因，通過在解脂耶氏酵母中融合表達(dá)將有活性的甘露聚糖酶展示在解脂耶氏酵母的細(xì)胞表面，通過酶學(xué)性質(zhì)分析，在pH6.0，溫度為55℃時有最佳的酶活，該基因工程菌酶活可達(dá)62IU/g(細(xì)胞干重)。利用該菌發(fā)酵培養(yǎng)、離心收集菌體，生產(chǎn)全細(xì)胞甘露聚糖酶，產(chǎn)品回收成本低，環(huán)保無污染，安全，效益好，可用于食品。
文檔編號C12N9/42GK101560474SQ20091006224
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者張桂敏, 楊曉松, 馬立新 申請人:湖北大學(xué)