專利名稱：：一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量pcr試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
,更具體涉及一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒，同時還涉及熒光定量PCR試劑盒的用途，適用于對血清制品中的呼腸孤病毒污染進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，同時廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
：呼腸孤病毒屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)，具分節(jié)段的雙鏈RNA基因組，無囊膜，有雙層衣殼，其宿主范圍廣，能感染人、脊椎動物、昆蟲、植物的5個屬。在牛群中主要引起幼年動物腹瀉、脫水而死亡，是奶牛和肉牛群的常發(fā)病。牛群中的抗體檢出率極高，急性發(fā)作時，死亡率甚高，給畜牧業(yè)、國際貿(mào)易出口和食品安全等帶來嚴(yán)重的問題。由于Reovims的組織培養(yǎng)宿主范圍相當(dāng)廣，常導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞污染來自血清的Reovirus，且常常不易引起注意，給細(xì)胞培養(yǎng)以及相關(guān)基礎(chǔ)研究帶來一定的問題。呼腸孤病毒的快速檢測是控制和消滅該病的前提，但其常規(guī)檢測方法有一些不足之處，檢測技術(shù)一般來說有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類1.血清學(xué)診斷技術(shù)包括補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)、凝集實(shí)驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、沉淀實(shí)驗(yàn)、免疫電泳技術(shù)、免疫熒光染色、雙抗體夾心ELISA和免疫電鏡技術(shù)等。在這些方法中得到普遍承認(rèn)且廣泛應(yīng)用的有補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)。但由于所有實(shí)驗(yàn)均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間長，材料多，準(zhǔn)備周期長，檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。2.生物學(xué)試驗(yàn)包括動物實(shí)驗(yàn)、雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品中存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測效果。動物實(shí)驗(yàn)成本高，周期長，浪費(fèi)生物資源和人力物力。3.分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括核酸雜交實(shí)驗(yàn)、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、負(fù)染電鏡檢測等。核酸雜交、聚丙烯酰胺凝膠電泳等檢測方法更適合于對病毒特性進(jìn)行更加深入的研究，由于整個系統(tǒng)操作復(fù)雜，過程繁多，成本高，不適宜同時進(jìn)行大批量檢測，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。樣品可以是器官、組織、細(xì)胞中的Reovirus，并可與不同的Reovirus株與輪狀病毒、邊界病毒相區(qū)別，這是免疫學(xué)方法無法替代的。但這種傳統(tǒng)的定量方法測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA或RNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA或RNA拷貝數(shù)。因此，如何快速、準(zhǔn)確測定呼腸孤病毒是面臨的主要難題之一。近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(FluorogeneticQuantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析(NellemannC，VinggaardAM，DalgaardM,etal.QuantificationofAntiandrogenEffectDeterminedbyLightCyclerTechnology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原體的定性(BhudeviB,WeinstockD.FluorogenicRT-PCRassay(TaqMan)forDetectionandClassificationofBovineViralDiarrheaVirus[J].Vet.Microbiol.，2001，83:1-10.)和定量檢觀ij(KathyF.J.Tang,JunWang,DonaldV.Lightner.QuantitationofTaurasyndromevirusbyreal-timeRT-PCRwithaTaqManassay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;BirgitLiss.Improvedquantitativereal-timeRT-PCRforexpressionprofilingofindividualcells[J].NucleicAcidsRes.,2002,Vol.30No.17e89.;FranckHousseaua,limberlyR丄indseya，etal.Quantitativereal-timeRT-PCRasamethodformonitoringTlymphocytereactivitytofull-lengthtyrosinaseproteininvaccinatedmelanomapatients[J].J.Immunol.Methods266(2002)87-103.;DesireN,DeheeA,SchneiderV,etal.QuantificationofHumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralLoadbyaTaqManReal-TimePCRAssay[J].J.Clin.Microbiol,2001,39:1303-1310;MartellM,GomezJ，EstebanJI，etal.High-ThroughputReal-TimeReverseTmnscription-PCRQuantitationofHepatitisCVirusRNA[J].J.Clin.Microbiol,1999,37:327-332;GallagherEM,MargolinAB.Developmentofanintegratedcellculture—Real-timeRT-PCRassayfordetectionofreovirusinbiosolids[J].J.Virol.Methods,2007，139(2):195-202;FlorenceKP,GlauciaPB,MireilleS,etal.QuantitationofHCVRNAusingreal-timePCRandfluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量主要方法，國內(nèi)目前也已有關(guān)于丙肝、乙肝、支原體、愛滋病、結(jié)核定量檢測的試劑盒上市。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前市場上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測范圍廣、穩(wěn)定性好。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染呼腸孤病毒流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用，可高效方便地對血清制品中的呼腸孤病毒污染進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，同時可廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒它包括a)RNA抽提液、b)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、c)RNA酶抑制劑、d)逆轉(zhuǎn)錄酶、e)引物和熒光探針(TaqMan)、f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、g)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于采用傳統(tǒng)的兩歩法擴(kuò)增(Two-StepRT-PCR)，即第一步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時引入標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA樣品定量檢測未知樣品。用DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，使得定量反應(yīng)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，并大大增加了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，減少誤差。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液，RNA酶抑制劑，熒光定量反應(yīng)液含有引物和熒光探針，引物序列分別為正義引物(FP)5'-TGCGCCTATCCTTGAGTTGA-3'(SEQIDNO:l)，反義引物(RT):5'-TTGCCAGGAAATACGGGTCT-3'(SEQIDNO:2)，擴(kuò)增子大小為138bp。熒光探針序列為5'-FAM-TCAAAATGGTGGACTTCAGTTTCGATTT-TAMRA-3'(SEQIDNO:3)，探針的5'端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM(6—羧基熒光素)，3'端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入呼腸孤病毒是Sl蛋白區(qū)361bp片段的pGEM-T載體(購自Promega公司)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購自Iiwitrogen公司)，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測A26o定量并10倍梯度稀釋。所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液是由5xbuffer，10nmol/L的反義引物，逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，10mMdNTPs和無RNA酶的滅菌雙蒸水組成；熒光定量PCR反應(yīng)液是由2xPremix，10pmol/L的正義引物和反義引物，10pmol/L熒光探針和無菌雙蒸水組成。所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板DNA核苷酸序列為CACCATTTTGAATATTCAGACCCGTATTTCCTGGCAA在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，采用傳統(tǒng)的兩步法擴(kuò)增(Two-StepRT-PCR)，即第一步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時引入標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA樣品定量檢測未知樣品。用DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，使得定量反應(yīng)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，并大大增加了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，減少誤差。在本發(fā)明的一個具體方案中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液由反義引物(RT)，逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，5xbuffer溶液，10mMdNTPs和無RNA酶的滅菌雙蒸組成；熒光定量PCR反應(yīng)液由正義引物(FP)，反義引物(RT)，熒光探針(TaqMan)，2xbuffer溶液和滅菌雙蒸水組成；在本發(fā)明的一個具體方案中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液由5xbuffer溶液5pl，10nmol/L的反義(RT)引物2.5^1，10mMdNTPsl.5nl，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑各1^1，無RNA酶的滅菌雙蒸水9pl組成；熒光定量反應(yīng)液由2xbuffer溶液12.5|al，10pmol/L正義(FP)、反義(RT)引物各3pl，10pmol/L熒光探針0.75^1，滅菌雙蒸水0.75pl組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(購自Promega公司)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測A260定量并10倍梯度稀釋。實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品制備過程為PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體(購自Promega公司)4'C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR鑒定陽性后送博亞生物工程有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨卞的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)Omega公司的凝膠純化試劑盒純化后于紫外分光光度計(jì)測A細(xì)定量，并稀釋至梯度109-102拷貝/10^1，-70"保存。在本發(fā)明提供檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有一條一端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)另一端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時，6兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5'-3'外切活性對探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán)之間的FRET，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi)的熒光探測器檢測，模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系，所以熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對呼腸孤病毒的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對呼腸孤病毒的基因組的靶片段中核苷酸排列的特殊性，將反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、擴(kuò)增程序等)的優(yōu)化，并將Q-PCR技術(shù)和定量檢測系統(tǒng)(包括LigthCycler系統(tǒng)，Roche，ABIPrism系統(tǒng)，PEAppliedBiosystems)相結(jié)合，將其用于各種來源的呼腸孤病毒樣品的定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，以及與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行比較，建立了定量檢測呼腸孤病毒的方法，并研制出呼腸孤病毒的定量檢測試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出100個以下的病毒基因拷貝數(shù)，檢測范圍可以達(dá)到八個數(shù)量級。在本發(fā)明的另外一個方面，本發(fā)明還提供了一種熒光定量PCR試劑盒對呼腸孤病毒進(jìn)行檢測的方法，該方法包括下列步驟A)用f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(購自promega公司)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，增殖后提取質(zhì)粒，并用紫外分光光度計(jì)定量；B)用a)RNA抽提液從待測標(biāo)本中提取RNA,然后加b)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，c)RNA酶抑制劑，d)逆轉(zhuǎn)錄酶，e)反義引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；C)熒光定量PCR由e)引物和熒光探針(TaqMan)，g)PCR熒光定量反應(yīng)液，f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物組成，已加入了標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的熒光定量反應(yīng)液PCR反應(yīng)體系上機(jī)，用熒光定量檢測儀進(jìn)行PCR檢測；D)通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明中提供的檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒可對各種來源的呼腸孤病毒樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，并可對牛血液制品和牛血清進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控，同時可廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)査，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.與傳統(tǒng)定量方法相比，此實(shí)時熒光定量PCR具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，直接對PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實(shí)時擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始RNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上核酸定量。2.與一步法相比，本實(shí)驗(yàn)采用的兩步法擴(kuò)增(Two-StepRT-PCR)，用已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品使得定量反應(yīng)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，并大大增加了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，減少誤差。3.檢測范圍廣，在109-102copies/reaction濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系(R=0.999)，檢測范圍可以達(dá)到八個數(shù)量級，已達(dá)到國際先進(jìn)水平，其靈敏度可檢測100copies以下，是其它任何方法無法比擬的。4.適用于各種型號的熒光定量擴(kuò)增儀，一次實(shí)驗(yàn)中三個重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于2%，說明其極高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。5.該實(shí)時熒光定量PCR利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線，是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；D丄.斯佩克特等主編，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；F.M.奧斯伯等主編，科學(xué)出版社，2005，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，或按照制造廠商建議的條件。實(shí)施例1呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒組成及其反應(yīng)條件8A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))RNA提取液A(4ml/管)RNA提取液B(800|al/管)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(90pl/管)逆轉(zhuǎn)錄酶(10pl/管)RNA酶抑制劑(400U/管)強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(100倍稀釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)DEPCH20(2ml/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50|^1/管)臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)熒光定量PCR反應(yīng)液(125pl/管)(RNA提取液A為Invitrogen公司產(chǎn)品。b)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，d)逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，g)熒光定量PCR反應(yīng)液和RNA酶抑制劑(40U/pl)購自TAKARA公司。)B).逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25pl):由5xbuffer溶液5(^1，10pmol/L的反義引物RT(SEQIDNO:2)2.5^1，10mMdNTPs1.5^1，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑各1^1，無RNA酶的滅菌雙蒸水9^1和待測樣品5^1組成；熒光定量反應(yīng)液由2xbuffer溶液12.5|al，10nmol/L正義引物FP(SEQIDNO:l)、反義引物RT各3pl，10nmol/L熒光探針0.75^1，滅菌雙蒸水0.75^1，待測樣品的cDNA或標(biāo)準(zhǔn)品組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(釆用兩步法)cDNAsynthesis:70°C1Omin0°C2min0。Cpause42。C50min70°ClOminPCR:95°C，2min94°C，15s60°C，60s40cycles在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行熒光檢測。對Reovirus的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。D).熒光定量PCR試劑盒檢測呼腸孤病毒的靈敏度、檢測范圍及穩(wěn)定性取轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)品RNA10、10^/r濃度范圍，每個濃度三個重復(fù)，加RNA裂解液400^1充分混勻，室溫(20-25°C，以下相同)靜置10分鐘，加80pl氯仿，室溫靜置3分鐘，于4"12000g/min離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管，加200nl異丙醇，室溫沉淀10分鐘，4'C12000g/min離心IO分鐘，輕輕倒出上清，力niml75。/。(體積比)乙醇充分吹散，于4。C7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥，加無RNA酶水25^160°C10min溶解。E).取D)步所提RNA5]ul，然后加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液5xbuffer5pl，反義引物RT(SEQIDNO:2)2.5nl(10阿ol/L)，10mMdNTPsL5nl,RNA酶抑制劑(40U/^il),逆轉(zhuǎn)錄酶lpl，分別加入對應(yīng)編號的PCR反應(yīng)管，在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為70°C10min，0°C2min，42°C50min，70°C10min。熒光定量PCR反應(yīng)液12.5pl，1Onmol/L正義引物FP(SEQIDN0:1)、反義引物RT(SEQIDN0:2)各3|al，熒光探針0.75pl(10pmol/L)，待測樣品cDNA或標(biāo)準(zhǔn)品DNA5pl，分別加入對應(yīng)編號的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為95'C預(yù)變性2min;94°C15s，60°C60s，擴(kuò)增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行，檢測波長為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶分析軟件(E卯endorf熒光定量PCR儀，型號:Mastercylereprealplex，軟件realplex)，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上結(jié)果表明該試劑盒檢測范圍廣，在109-102(^濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.999其檢測范圍可以達(dá)到九個數(shù)量級，其靈敏度可檢測100c叩ies以下，且穩(wěn)定性好，一次實(shí)驗(yàn)中三個重復(fù)樣品相應(yīng)的變異系數(shù)(CV)小于1%，說明其極高的重復(fù)性，適用于各種型號的熒光定量擴(kuò)增儀，是其它任何方法無法比擬的。實(shí)施例2:呼腸孤病毒熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染呼腸孤病毒流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用。a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))RNA提取液A(4ml/管)RNA提取液B(800pi/管)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(90pl/管)逆轉(zhuǎn)錄酶(lOitil/管)RNA酶抑制劑(400U/管)強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(100倍稀釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)DEPCH20(2ml/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50)Lil/管)臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)熒光定量PCR反應(yīng)液(125pl/管)(RNA提取液A為Invitrogen公司產(chǎn)品。b)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，d)逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，g)熒光定量PCR反應(yīng)液和RNA酶抑制劑(40Ul)購自TAKARA公司。)B).逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25(il):由5xbuffer溶液5^1，lOpmol/L的反義引物RT(SEQIDN0:2)2.5pl，10mMdNTPsl.5pl，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑各1^1，無RNA酶的滅菌雙蒸水9^1和待測樣品5)^1組成；熒光定量反應(yīng)液由2xbuffer溶液12.5^1，10nmol/L正義引物FP(SEQIDN0:1)、反義引物RT各3pl，1Onmol/L熒光探針0.75nl，滅菌雙蒸水0.75^，待測樣品的cDNA或標(biāo)準(zhǔn)品組成。其中熒光探針為(SEQIDN0:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)cDNAsynthesis:70°C10min0°C2min0°Cpause42°C50min70°ClOminPCR:95°C，2min94°C，15s60°C，60s40cycles在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行熒光檢測。對Reovirus的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。D)實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞培養(yǎng)12O培養(yǎng)的非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)鋪制12孔板，lml/孑L，50%匯合度；2)待檢血清用MEM配制為5%(體積比)濃度；3)細(xì)胞貼壁后，更換為待檢血清配制的培養(yǎng)基，lml/孔；4)同時設(shè)陰性和陽性對照，陽性對照加含有Reovirus的5。/。(體積比)FBSMEM;5)37°C，5%(體積比)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察是否有CPE的產(chǎn)生。6)72h后，收集細(xì)胞，2000rpm離心5min暫存于-80。C。其余樣品同樣方法處理。提取細(xì)胞的總RNA，作為RT的模板。2.細(xì)胞中總RNA的提取每個樣品加入RNA提取液A400pl，室溫(20-25°C)放置10min，加入RNA提取液B80^1，劇烈震蕩15s,室溫(20-25°C)放置23min;4°C，12000rpm離心15min，取上清200^1，移入一個新的EP管，再加入異丙醇200^1，室溫下靜置10min;4'C，12000卬m離心15min;棄上清，沉淀加入75%(體積比)冷乙醇400^1，渦旋，4'C，7500rpm離心5min，棄上清留沉淀，于室溫靜置5~10min晾干乙醇，加入25plDEPC水溶解沉淀。3.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)按B),C)所示進(jìn)行。E).奶牛血清中呼腸孤病毒的檢測將不同來源的25份奶牛血清按D)所示的處理方法獲得病毒RNA，分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應(yīng)(按B)，C)步驟所示進(jìn)行(依次進(jìn)行一次，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng))。每個樣品重復(fù)兩次，循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶分析軟件(Eppendor淡光定量PCR儀，型號Mastercylereprealplex，軟件realplex)，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>以上結(jié)果表明，奶牛編號為7-021的牛血清中含有呼腸孤病毒，表明奶牛群中存在少量的奶牛攜帶Reovirus，同時證實(shí)了呼腸孤病毒熒光定量PCR試劑盒能成功應(yīng)用于Reovirus流行病學(xué)調(diào)査，牛血清以及牛血液制品的監(jiān)測，重復(fù)性好，CV值均小于1X。實(shí)施例3:呼腸孤病毒熒光定量PCR試劑盒在市售牛血清檢測中的應(yīng)用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應(yīng))RNA提取液A(4ml/管)RNA提取液B(800pl/管)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(90nl/管)逆轉(zhuǎn)錄酶(10(il/管)RNA酶抑制劑(400U/管)強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(100倍稀釋定值準(zhǔn)品20pl/管，共四管)PCR反應(yīng)管(無菌、無RNA酶和DNA酶)DEPCH20(2ml/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl滑)熒光定量PCR反應(yīng)液(125pl/管)(RNA提取液A為Invitrogen公司產(chǎn)品。b)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，d)逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，g)熒光定量PCR反應(yīng)液和RNA酶抑制劑(40U/pl)購自TAKARA公司。)B).逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(反應(yīng)總體積是25pl):由5xbuffer溶液5pl，1Opmol/L的反義引物RT(SEQIDNO:2)2.5pl，10mMdNTPsl.5pl，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑各1^1，無RNA酶的滅菌雙蒸水9^1和待測樣品5^1組成；熒光定量反應(yīng)液由2xbuffer溶液12.5^d，10(jmoI/L正義引物FP(SEQIDNO:l)、反義引物RT各3pl，10pmol/L熒光探針0.75pl，滅菌雙蒸水0.75(il，待測樣品的cDNA或標(biāo)準(zhǔn)品組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。C).反應(yīng)條件如下(采用兩步法)cDNAsynthesis:70。C1Omin0°C2min0。Cpause42°C50min70°C10minPCR:95。C，2min94°C，15s60°C,60s40cycles在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行熒光檢測。對Reovirus的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。D)實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞培養(yǎng)1)培養(yǎng)的非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)鋪制12孔板，lml/孔，50%匯合度；2)待檢血清用MEM配制為5%(體積比)濃度；3)細(xì)胞貼壁后，更換為待檢血清配制的培養(yǎng)基，lml/孔；4)同時設(shè)陰性和陽性對照，陽性對照加含有REOVIRUS的5%(體積比)FBSMEM;5)37°C，5%(體積比)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察是否有CPE的產(chǎn)生。6)72h后，收集細(xì)胞，2000rpm離心5min暫存于-8(TC。其余樣品同樣方法處理。提取細(xì)胞的總RNA，作為RT的模板。2.細(xì)胞中總RNA的提取每個樣品加入RNA提取液A40(Hd,室溫放置10min，加入RNA提取液B80^1，劇烈震蕩15s，室溫(20-25。C)放置23min;4。C，12000rpm離心15min，取上清200pl，移入一個新的EP管，再加入異丙醇200^1，室溫下靜置10min;4。C，12000rpm離心15min;棄上清，沉淀加入75%(體積比)冷乙醇400nl，渦旋，4"C，7500rpm離心5min,棄上清留沉淀，于室溫靜置5~10min晾干乙醇，加入25jnlDEPC水溶解沉淀。3.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)按B)，C)步驟所示進(jìn)行。(依次進(jìn)行一次，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng))。E).實(shí)驗(yàn)結(jié)果公司名稱血清批號REOVIRUS-copies/mlGibco749154-949184-719321-719351-7685959D-HycloncNSF0081-NSF0071-NSF0061-NSF0051-NSF0021-16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上結(jié)果表明以上待檢批號的血清均表現(xiàn)為呼腸孤病毒陰性，同時表明該試劑盒能用于檢測細(xì)胞樣品中的病毒。SEQUENCELISTING<110>武漢三利生物技術(shù)有限公司<120〉一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用<130>—種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>1TGCGCCTATCCTTGAGTTGA20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>2TTGCCAGGAAATACGGGTCT20<210>3<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>3TCAAAATGGTGGACTTCAGTTTCGATTT2818權(quán)利要求1、一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)RNA抽提液、b)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液、c)逆轉(zhuǎn)錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物和TaqMan探針、f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、g)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于引物序列分別為正義引物5′-TGCGCCTATCCTTGAGTTGA-3′，反義引物5′-TTGCCAGGAAATACGGGTCT-3′，擴(kuò)增子大小為138bp，熒光探針序列為5′-FAM-TCAAAATGGTGGACTTCAGTTTCGATTT-TAMRA-3′，探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入呼腸孤病毒S1蛋白區(qū)361bp片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測A260定量并10倍梯度稀釋。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征是所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液是由5xbuffer、1(Hmiol/L的反義引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、10mMdNTPs和無RNA酶的滅菌雙蒸水組成。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述的熒光定量PCR反應(yīng)液是由2xPremix、lOpmol/L的正義引物和反義引物、10pmol/L熒光探針和無菌雙蒸水組成。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征是所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板DNA核苷酸序列為CACCATTTTGAATATTCAGACCCGTATTTCCTGGCAA。5、權(quán)利要求1所述的一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染呼腸孤病毒流行病學(xué)調(diào)査中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有a)RNA抽提液、b)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液、c)逆轉(zhuǎn)錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物和TaqMan探針、f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、g)PCR熒光定量反應(yīng)液，其特征是引物序列分別為正義引物5′-TGCGCCTATCCTTGAGTTGA-3′，反義引物5′-TTGCCAGGAAATACGGGTCT-3′，擴(kuò)增子大小為138bp，熒光探針序列為5′-FAM-TCAAAATGGTGGACTTCAGTTTCGATTT-TAMRA-3′，探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入呼腸孤病毒S1蛋白區(qū)361bp片段的pGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測A₂₆₀定量并10倍梯度稀釋。高效方便地對血清制品中的呼腸孤病毒的污染進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，可廣泛用于該病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查，還能為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。文檔編號C12Q1/70GK101565757SQ20091006239公開日2009年10月28日申請日期2009年6月2日優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日發(fā)明者張國榮,鄭從義,佳郭申請人:武漢三利生物技術(shù)有限公司