專利名稱：一種活體磁性微生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物和生物制造領(lǐng)域，具體涉及微生物磁化技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
生物制造是將生命科學(xué)、材料科學(xué)以及生物技術(shù)融入到制造學(xué)科中，是微納米制 造技術(shù)和生命科學(xué)交叉產(chǎn)生的一門新興學(xué)科。它包括仿生制造、生物質(zhì)和生物體制造，運(yùn)用 現(xiàn)代制造科學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，通過細(xì)胞或微生物的受控三維加工和組裝，制造 新材料、器件及生物系統(tǒng)。生物制造為微納制造技術(shù)提供了一類全新的制造手段，擴(kuò)展了傳 統(tǒng)制造領(lǐng)域的邊界和范疇。生物制造的本質(zhì)是以生物作為完成制造過程的主體，在微納米尺度通過生物的受 控自組裝自裝配構(gòu)成各種微結(jié)構(gòu)。主要包括對DNA、蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子進(jìn)行有序操 縱；對微生物定向誘導(dǎo)或有序排列，利用其天然結(jié)構(gòu)及功能開發(fā)新型功能材料；以及通過 細(xì)胞受控組裝，完成具有新陳代謝特征的生命體成型和制造。微生物是地球上最古老的生命體，包括細(xì)菌、真菌、病毒等，種類繁多，形態(tài)與生物 學(xué)功能各異，其個(gè)體大小從幾十納米到微米級，具有極強(qiáng)的生命力和適應(yīng)性，能夠以較低成 本進(jìn)行大批量培養(yǎng)，在微納米加工領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。另外，利用微生物進(jìn)行材料 加工是低能耗、節(jié)約土地及自然資源、保護(hù)環(huán)境的綠色工藝過程，還可定向培育新品種，因 此是天然的可用于納米、微米及多層次跨尺度加工的“基本單元”。以微生物為分子組裝的 機(jī)器，以微納米尺度的過程控制方法對其進(jìn)行二維數(shù)字定位以及圖案化排列或者三維微操 縱，由此可設(shè)計(jì)創(chuàng)制出具有特定功能的新材料。其關(guān)鍵是以合適的方法控制微生物群體的 定向運(yùn)動與有序排列，進(jìn)而才能夠利用其天然生物學(xué)功能完成自裝配、有序組裝等過程。目前能夠用于生物制造過程控制的微納米制造方法主要有機(jī)械作用噴射技術(shù)、直 寫技術(shù)、電紡絲技術(shù)等。而這其中大多數(shù)方法不能應(yīng)用于對微生物活細(xì)胞的控制，主要是因 為其控制條件不夠溫和，不能保證在整個(gè)控制過程中微生物個(gè)體的存活以及生物學(xué)功能的 完整。發(fā)明人提出了活體磁性微生物的新概念，是指人工構(gòu)建的在外加磁場下可以進(jìn)行 趨磁性運(yùn)動的活性微生物。它將可用于建立一種用磁場來控制微生物的生物制造過程控制 方法，這在生物制造領(lǐng)域尚屬空白。磁控方法相較于其他過程控制方法具有條件溫和、可操 作性強(qiáng)、精細(xì)程度高、能進(jìn)行定向或定域控制、可以進(jìn)行動態(tài)控制以及容易與其它過程控制 方法結(jié)合使用等優(yōu)點(diǎn)。趨磁細(xì)菌是天然的磁性微生物。專利號US2006073540-A1的美國專利 "Controlling of micro-object (s)involves modifying the orientation of magneticfield to modify the displacement path of magnetotactic bacterium，，曾 涉及到一種通過改變磁場取向從而對微米級的物體進(jìn)行控制的方法，該發(fā)明建立了一種 基于趨磁細(xì)菌的系統(tǒng)，即通過將微米級的物體與趨磁細(xì)菌偶聯(lián)從而使該系統(tǒng)具有磁響應(yīng)， 進(jìn)而運(yùn)用磁場控制。但是趨磁細(xì)菌生物量小，必須在苛刻的條件下培養(yǎng)，并且不同生物
5制造過程對微生物功能和形態(tài)的要求各異，因此需要建立簡便易行而又對不同菌種有廣 泛適用性的方法，來人工構(gòu)建磁性微生物。申請日2002. 10. 11，申請?zhí)?2130836. 5的中 國專利申請文件“以微生物細(xì)胞為模板的空心金屬微粒及其制備方法”曾涉及到一種以 微生物細(xì)胞為模板的空心金屬微粒及其制備方法，它是利用不同幾何外形的微生物細(xì)胞 為模板，通過化學(xué)鍍方法在其表面沉積金屬層或合金鍍層，來制備成輕質(zhì)空心金屬導(dǎo)電 或磁性微粒，但是這種方法將使微生物致死，且其所制備的只能是金屬微粒，而不能在生 物制造領(lǐng)域進(jìn)一步應(yīng)用于組裝生物材料、生物器件。專利號JP2005349254-A的日本專 利“Moving a minuteobject(e. g. a microorganism)bound to or containing magnetic microparticles， comprises moving a magnetic probe to move the object on a substrate”曾涉及到一種利用磁針引導(dǎo)結(jié)合或含有磁性微粒的微小物體進(jìn)行重排列的方 法，該發(fā)明可用于研究細(xì)胞的行為或細(xì)胞與微生物間的相互作用等，但該發(fā)明沒有涉及到 在微生物表面或內(nèi)部導(dǎo)入磁性微粒的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種活體磁性微生物的制備方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種活體磁性微生物的制備方法，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法活化培養(yǎng)待磁化微生物。(2)對于細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的微生物，將聚陽離子和聚陰離子交替吸附在經(jīng)活化 培養(yǎng)的微生物細(xì)胞表面，并使微生物細(xì)胞最外層為聚陰離子；對于細(xì)胞表面帶正電荷的微 生物，則將聚陰離子和聚陽離子交替吸附在經(jīng)活化培養(yǎng)的微生物細(xì)胞表面，并使微生物細(xì) 胞最外層為聚陰離子，得到細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液，所用的聚陽離子和聚 陰離子為對所選待磁化微生物代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成破壞的聚陽離子和聚陰離子。(3)在細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液中加入CaCl2溶液和磁性納米顆粒 水溶液，然后，再用NaOH溶液使微生物菌懸液的pH維持在弱酸性的條件下緩慢滴加Na2HPO4 溶液，使反應(yīng)生成的磷酸鈣沉淀均勻的沉積在微生物細(xì)胞表面，同時(shí)使磁性納米顆粒也均 勻地?fù)饺氲搅姿徕}的沉積層中。在上述步驟(2)和(3)中為使微生物細(xì)胞不至吸水漲破，涉及到的全部操作應(yīng)在 0 4°C條件下進(jìn)行；在上述步驟(2)和(3)中所使用的全部試劑包括去離子水、聚陽離子 溶液、聚陰離子溶液、CaCl2溶液、磁性納米顆粒水溶液、Na2HPO4溶液及NaOH溶液，在配制時(shí) 應(yīng)加入NaCl，根據(jù)所處理的微生物細(xì)胞選擇適當(dāng)?shù)臐舛?，以維持細(xì)胞滲透壓；在上述步驟 (2)和(3)中所使用的全部試劑在使用前須經(jīng)過高溫高壓滅菌。上述步驟(1)所述的活化培養(yǎng)待磁化微生物的方法是選取待磁化微生物菌種， 按常規(guī)方法接種至液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)至微生物培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度為IO6 IO8Hir1 ；待 磁化微生物，可以是真菌或細(xì)菌，其形態(tài)可以是球狀、桿狀或螺旋狀，其表面可以是帶有正 電荷，也可以是帶負(fù)電荷?；罨囵B(yǎng)待磁化微生物的常規(guī)方法可參見周德慶主編的《微生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》，高等教育出版社2006年第二版。上述步驟(2)所述的將聚陽離子和聚陰離子交替吸附在經(jīng)活化培養(yǎng)的帶負(fù)電荷 的微生物表面，并使微生物細(xì)胞最外層為聚陰離子的具體方法包括以下步驟
a)清洗微生物細(xì)胞表面取一定體積的活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心 管中，通常取5 IOmL活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，用合適的離心轉(zhuǎn)速及 離心時(shí)間離心，離心轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間根據(jù)所選微生物菌種確定，棄上清液，加入與所取活化 培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液等體積的去離子水，搖勻使微生物細(xì)胞形成菌懸液，將該步驟中的 離心、棄上清液、加入等體積的去離子水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；b)細(xì)胞表面聚陽離子的吸附將菌懸液離心，棄上清后加入與步驟a)中所加去離 子水等體積的質(zhì)量百分比為0. 01 0. 5%的聚陽離子稀溶液，搖勻后靜置10 30分鐘；c)除去菌懸液中未吸附的聚陽離子將步驟b)處理過的菌懸液離心，棄上清，加 入與步驟a)中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加入去 離子水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；d)細(xì)胞表面聚陰離子的吸附將步驟C)處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與步 驟a)中所加去離子水等體積的質(zhì)量百分比為0.01 0.5%的聚陰離子稀溶液，搖勻后靜置 10 30分鐘；e)除去菌懸液中未吸附的聚陰離子將步驟d)處理過的菌懸液離心，棄上清，加 入與步驟a)中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加入去 離子水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；f)聚陽離子和聚陰離子在微生物細(xì)胞表面的交替吸附將步驟b)、c)、(！)、e)依次 重復(fù)進(jìn)行1 4次，得到細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液。上述步驟(2)所述的將聚陰離子和聚陽離子交替吸附在細(xì)胞表面帶正電荷的微 生物表面，并使微生物細(xì)胞最外層為聚陰離子的具體方法包括以下步驟a’ )清洗微生物細(xì)胞表面取一定體積的活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心 管中，通常取5-10mL活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，用合適的離心轉(zhuǎn)速及離 心時(shí)間離心，離心轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間根據(jù)所選微生物菌種確定，棄上清液，加入與所取活化培 養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液等體積的去離子水，搖勻使微生物細(xì)胞形成菌懸液，將該步驟中的離 心、棄上清液、加入等體積的去離子水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；b’ )細(xì)胞表面聚陰離子的吸附將菌懸液離心，棄上清后加入與步驟a’ )中所加 去離子水等體積的質(zhì)量百分比為0. 01 0. 5%的聚陰離子稀溶液，搖勻后靜置10 30分 鐘；c’)除去菌懸液中未吸附的聚陰離子將步驟b)處理過的菌懸液離心，棄上清，加 入與步驟a’ )中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加入 去離子水、搖勻的過程反復(fù)進(jìn)行1 3次；d’ )細(xì)胞表面聚陽離子的吸附將步驟C’ )處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與 步驟a’)中所加去離子水等體積的質(zhì)量百分比為0.01 0.5%的聚陽離子稀溶液，搖勻后 靜置10 30分鐘；e’ )除去菌懸液中未吸附的聚陽離子將步驟d’ )處理過的菌懸液離心，棄上清， 加入與步驟a’ )中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加 入去離子水、搖勻的過程反復(fù)進(jìn)行1 3次；f')將上述步驟b，)、c，)、d，)、e，)依次重復(fù)進(jìn)行1 4次，并在最后一次重復(fù) 時(shí)，只依次進(jìn)行步驟b’)、c’)，使細(xì)胞最外層為聚陰離子，得到細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液。上述步驟(2)所述的對所選待磁化微生物代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成破壞的聚 陽離子可以是聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚丙烯氯化銨或陽離子聚丙烯酰胺，所述的對所 選待磁化微生物代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成破壞的聚陰離子可以是聚丙烯酸鈉、聚苯乙烯 磺酸鈉、陰離子聚丙烯酰胺或海藻酸鈉。上述步驟(3)所述的在細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液中加入CaCl2溶液 和磁性納米顆粒水溶液，然后，在用NaOH溶液使微生物菌懸液的pH維持在弱酸性的條件下 緩慢滴加Na2HPO4溶液，使反應(yīng)生成的磷酸鈣沉淀均勻的沉積在微生物細(xì)胞表面，同時(shí)使磁 性納米顆粒也均勻地?fù)饺氲搅姿徕}的沉積層中的具體方法包括以下步驟g)加入待反應(yīng)的CaCl2 將經(jīng)過上述步驟(2)處理后的菌懸液離心，棄上清，加入 與前述清洗微生物細(xì)胞表面步驟中所加去離子水等體積的濃度為0. 005 0. 05mol/L的 CaCl2溶液，搖勻；h)加入磁性納米顆粒向步驟g)處理過的菌懸液中加入濃度為0. 01 0. lg/L的 磁性納米顆粒的水溶液，其體積為步驟g)所加CaCl2溶液的1/20 1/5，搖勻。所用磁性 納米顆粒水溶液中的磁性納米顆?？梢允荈e3O4或γ -Fe2O3，平均粒徑小于50nm，磁性納米 顆粒的水溶液的制備方法可參考文獻(xiàn)“New technique for synthesizing iron ferrite magnetic nanosized particles, Langmuir,1997,13(15) :3927_3933，，或"Synthesis and surface engineering ofiron oxide nanoparticles for biomedical applications, Biomaterials,2005，26 (18) :3995_4021”。i)向經(jīng)過步驟h)處理過的含有磁性納米顆粒的菌懸液中緩慢滴加與步驟g)所加 CaCl2溶液體積相同的濃度為0. 005 0. 05mol/L的Na2HPO4溶液，并不停搖勻，同時(shí)用濃度 為0. 005 0. 05mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使Na2HPO4溶液的整個(gè)滴加過程中pH維持在 6. 7 6. 8 ；j) Na2HPO4與NaOH溶液全部滴加完畢后，繼續(xù)搖勻10 60min ；k)除去過量而未反應(yīng)的試劑將步驟j)處理后的菌懸液離心，棄上清，加入與前 述清洗微生物細(xì)胞表面步驟中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、 棄上清、加入去離子水、搖勻的過程反復(fù)進(jìn)行1 3次，即制得磁性微生物?；诒景l(fā)明方法，本發(fā)明提供了一種人工制備的活體磁性微生物，該微生物細(xì)胞 的表面有以人工方法附著的磁性納米顆粒，附著的磁性納米顆粒是平均粒徑小于50nm的 Fe3O4 Y-Fe2O30實(shí)驗(yàn)資料1.對實(shí)施例1制得的磁性酵母菌趨磁性的觀察制備的磁性酵母菌樣品用濃度為0.05g/L的鹽酸四環(huán)素對表面Ca2+離子進(jìn)行熒光 染色，并用光學(xué)顯微鏡(Olympus 1X71)在360 370nm紫外光下進(jìn)行熒光觀察。另外準(zhǔn)備 對照組酵母菌，按照實(shí)施例1方法制備，但在制備過程中不添加磁性納米顆粒Y-Fe2O3，同 樣用鹽酸四環(huán)素進(jìn)行熒光染色后觀察。用小磁針測試酵母細(xì)胞的趨磁性。結(jié)果顯示加入小磁針后，磁性酵母菌在小磁針 附近大量聚集，呈現(xiàn)明亮熒光效果(圖Ic)，說明該酵母菌具有良好的趨磁性；對照組酵母 菌則不會聚集于小磁針周圍(圖2c)。兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明磁性納米顆粒成功搭載于酵母菌表面，并使酵母菌具有趨磁性。2.對實(shí)施例1制得的磁性酵母菌存活性的證明將由實(shí)施例1制得的磁性酵母菌用小磁鐵進(jìn)行磁性分離純化，4°C條件下保存于 7g/L的NaCl溶液中。存放一周后，用0. 01mol/L的鹽酸溶液將磁性酵母菌懸浮液調(diào)pH值 至6，接種至液體培養(yǎng)基，30°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果證明酵母菌能夠良好生長，并且 在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特征與普通接種的酵母菌一致。3.對實(shí)施例1制得的磁性酵母菌表面微觀結(jié)構(gòu)的觀察用掃描電子顯微鏡(QUANTA200)觀察磁性酵母菌的表面形貌，樣品經(jīng)過冷凍干燥 處理。用透射電子顯微鏡(FEI Tecnai G2 20 TWIN)觀察磁性酵母細(xì)胞切面形貌，采用戊 二酸——鋨酸雙重固定法固定后進(jìn)行超薄切片，以醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后觀察。圖3顯 示出了掃描電鏡觀察到的磁性酵母菌的整體形貌，表面有連續(xù)褶皺起伏結(jié)構(gòu)。天然的酵母 菌細(xì)胞壁表面平整無褶皺(圖4b)。經(jīng)過實(shí)施例1處理后的酵母菌表面有明顯的“鋸齒”狀 結(jié)構(gòu)(圖4a)，且細(xì)胞壁最外層部分厚度明顯增加，該部分結(jié)構(gòu)分布連續(xù)，較為均勻。由此可 以推斷出磁性納米顆粒已牢固附著于酵母細(xì)胞表面，這也是使細(xì)胞有趨磁性的原因。本發(fā)明公開了一種在活的微生物表面高效導(dǎo)入磁性納米顆粒，獲得活體磁性微生 物的制備方法。本發(fā)明方法可操作性強(qiáng)，對不同微生物菌種有良好的廣泛適用性，制備的微 生物具有趨磁性，并且可以保持存活?；铙w磁性微生物是由本發(fā)明提出的新概念，活體磁性微生物是指人工構(gòu)建的在外 加磁場下可以進(jìn)行趨磁性運(yùn)動的活性微生物。由本發(fā)明制得的磁性微生物雖然磁性不可 遺傳，同時(shí)細(xì)胞的分裂增值受到了限制，但可保持活性，這為進(jìn)一步探索基于微生物活細(xì)胞 的，能夠發(fā)揮微生物整體生物學(xué)功能及優(yōu)勢的生物制造磁控過程工藝奠定了基礎(chǔ)。通過生 物技術(shù)與微納米技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，以磁性微生物為微納米機(jī)器人，用磁場控制的方法在微 納米尺寸范圍內(nèi)定位操縱和有序排列活性微生物，誘發(fā)其特有的生物學(xué)功能，進(jìn)行受控自 組裝等生物制造過程，由此有望設(shè)計(jì)和創(chuàng)制一系列新型特殊功能材料和器件。


圖1為試驗(yàn)1中所述在光學(xué)顯微鏡下對實(shí)施例1制得的磁性酵母菌趨磁性的觀察 結(jié)果，未加磁針時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察磁性酵母菌，圖a)、b)分別為同一視野下拍攝的熒 光結(jié)果及普通結(jié)果；加入磁針后，在光學(xué)顯微鏡下觀察磁性酵母菌，圖c)、d)分別為同一視 野下拍攝的熒光結(jié)果及普通結(jié)果，結(jié)果顯示加入小磁針后，磁性酵母菌在小磁針附近大量 聚集，呈現(xiàn)明亮熒光效果，說明該酵母菌具有良好的趨磁性；圖2為試驗(yàn)1中所述對照實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果，未加磁針時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察對照 組酵母菌，圖a)、b)分別為同一視野下拍攝的熒光結(jié)果及普通結(jié)果；加入磁針后，在光學(xué)顯 微鏡下觀察對照組酵母菌，圖c)、d)分別為同一視野下拍攝的熒光結(jié)果及普通結(jié)果，結(jié)果 顯示對照組酵母菌不會聚集于小磁針周圍，與圖1結(jié)果對比，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明磁性 納米顆粒成功搭載于酵母菌表面，并使酵母菌具有趨磁性；圖3為試驗(yàn)3中所述由實(shí)施例1制得的磁性酵母菌的掃描電鏡圖，顯示出了掃描 電鏡觀察到的磁性酵母菌的整體形貌，表面有連續(xù)褶皺起伏結(jié)構(gòu)；圖4為試驗(yàn)3中所述由實(shí)施例1制得的磁性酵母菌的透射電鏡圖(a)，與對照組天
9然酵母菌的透射電鏡圖(b)，圖中顯示出天然的酵母菌細(xì)胞壁表面平整無褶皺，經(jīng)過實(shí)施例 1處理后的酵母菌表面有明顯的“鋸齒”狀結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞壁最外層部分厚度明顯增加，該部分 結(jié)構(gòu)分布連續(xù)，較為均勻，由此可以推斷出磁性納米顆粒已牢固附著于酵母細(xì)胞表面，這也 是使酵母菌有趨磁性的原因。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。以下實(shí)施例1所述步驟(2)、(3)和實(shí)施例2所述步驟(2)、(3)中涉及到的全部操 作在0 4°C條件下進(jìn)行。實(shí)施例1(1)選取待磁化微生物釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，接種至YPD液體 培養(yǎng)基(蛋白胨2%，酵母粉1 %，葡萄糖2% )后30°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)48h。(2)微生物細(xì)胞表面的改性處理用去離子水配制濃度為7g/L的NaCl溶液，再用 該溶液配制所有制備過程中將使用到的其他溶液，高溫高壓滅菌；取IOmL培養(yǎng)后的酵母培 養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，5000rpm離心6min(實(shí)施例1中所有離心都采用此條件)，棄上清液， 加入IOmLNaCl溶液，搖勻成菌懸液，將離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻的過程反復(fù)進(jìn)行 2次；將酵母菌懸液離心，棄上清后加入IOmL質(zhì)量百分比為0. 的聚二烯丙基二甲基氯化 銨溶液，搖勻后靜置20分鐘；將菌懸液離心，棄上清，加入IOmLNaCl溶液，搖勻；將菌懸液 離心，棄上清，加入IOmL質(zhì)量百分比為0. 1 %的聚丙烯酸鈉溶液，搖勻后靜置20分鐘；將菌 懸液離心，棄上清，加入IOmLNaCl溶液，搖勻；將上述步驟離心、棄上清、加入聚二烯丙基二 甲基氯化銨溶液、搖勻、靜置，離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻，離心、棄上清、加入聚丙 烯酸鈉溶液、搖勻、靜置，離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻，依次重復(fù)再進(jìn)行1次。(3)磁性納米顆粒在酵母細(xì)胞表面的附著將步驟(2)處理后的菌懸液離心，棄上 清，加入IOmL濃度為0. 01mol/L的CaCl2溶液，搖勻；向其中加入濃度為0. lg/L的磁性納 米顆粒Y-Fe2O3的水溶液lmL，搖勻，所用磁性納米顆粒水溶液中的Y-Fe2O3平均粒徑為 20nm 30nm ；向含有磁性納米顆粒的菌懸液中緩慢滴加IOmL濃度為0. 01mol/L的Na2HPO4 溶液并不停搖勻，同時(shí)用濃度為0. 01mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使Na2HPO4溶液的整個(gè)滴 加過程中PH維持在6. 8 ；Na2HPO4與NaOH溶液全部滴加完畢后，繼續(xù)搖勻60min ；將處理后 的菌懸液離心，棄上清，加入IOmLNaCl溶液，搖勻，將離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻的 過程再進(jìn)行2次，即制得磁性酵母菌。實(shí)施例2(1)選取待磁化微生物大腸桿菌(Escherichia coli)，接種至LB液體培養(yǎng)基(蛋 白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%,ρΗ 7. 4)后37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h。(2)微生物細(xì)胞表面的改性處理用去離子水配制濃度為5g/L的NaCl溶液，再用 該溶液配制所有制備過程中將使用到的其他溶液，高溫高壓滅菌；取IOmL培養(yǎng)后的大腸桿 菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，6000rpm離心IOmin (實(shí)施例2中所有離心都采用此條件)，棄上 清液，加入IOmLNaCl溶液，搖勻成菌懸液，將離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻的過程反復(fù) 進(jìn)行1次；將大腸桿菌菌懸液離心，棄上清后加入IOmL質(zhì)量百分比為0. 05%的聚丙烯氯化 銨溶液，搖勻后靜置10分鐘；將菌懸液離心，棄上清，加入IOmLNaCl溶液，搖勻；將菌懸液
10離心，棄上清，加入IOmL質(zhì)量百分比為0. 05%的聚苯乙烯磺酸鈉溶液，搖勻后靜置10分鐘； 將菌懸液離心，棄上清，加入IOmLNaCl溶液，搖勻；將上述步驟離心、棄上清、加入聚丙烯氯 化銨溶液、搖勻、靜置，離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻，離心、棄上清、加入聚苯乙烯磺 酸鈉溶液、搖勻、靜置，離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻，依次重復(fù)再進(jìn)行2次。(3)磁性納米顆粒在大腸桿菌細(xì)胞表面的附著將步驟(2)處理后的菌懸液離心， 棄上清，加入IOmL濃度為0. 005mol/L的CaCl2溶液，搖勻；向其中加入濃度為0. 01g/L的 磁性納米顆粒Fe3O4的水溶液0. 5mL，搖勻，所用磁性納米顆粒水溶液中的Fe3O4平均粒徑為 IOnm 20nm ；向含有磁性納米顆粒的菌懸液中緩慢滴加IOmL濃度為0. 005mol/L的Na2HPO4 溶液并不停搖勻，同時(shí)用濃度為0. 005mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使Na2HPO4溶液的整個(gè)滴 加過程中PH維持在6. 75 ；Na2HPO4與NaOH溶液全部滴加完畢后，繼續(xù)搖勻30min ；將處理后 的菌懸液離心，棄上清，加入IOmLNaCl溶液，搖勻，將離心、棄上清、加入NaCl溶液、搖勻的 過程再進(jìn)行1次，即制得磁性大腸桿菌。實(shí)施例3對實(shí)施例1制得的磁性酵母菌趨磁性的觀察制備的磁性酵母菌樣品用濃度為0.05g/L的鹽酸四環(huán)素對表面Ca2+離子進(jìn)行熒光 染色，并用光學(xué)顯微鏡(Olympus 1X71)在360 370nm紫外光下進(jìn)行熒光觀察。另外準(zhǔn)備 對照組酵母菌，按照實(shí)施例1方法制備，但在制備過程中不添加磁性納米顆粒Y-Fe2O3，同 樣用鹽酸四環(huán)素進(jìn)行熒光染色后觀察。用小磁針測試酵母細(xì)胞的趨磁性。結(jié)果顯示加入小磁針后，磁性酵母菌在小磁針 附近大量聚集，呈現(xiàn)明亮熒光效果，見圖lc，說明該酵母菌具有良好的趨磁性；對照組酵母 菌則不會聚集于小磁針周圍，見圖2c。兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明磁性納米顆粒成功搭載于酵 母菌表面，并使酵母菌具有趨磁性。實(shí)施例4對實(shí)施例1制得的磁性酵母菌存活性的證明將由實(shí)施例1制得的磁性酵母菌用小磁鐵進(jìn)行磁性分離純化，4°C條件下保存于 7g/L的NaCl溶液中。存放一周后，用0. 01mol/L的鹽酸溶液將磁性酵母菌懸浮液調(diào)pH值 至6，接種至液體培養(yǎng)基，30°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果證明酵母菌能夠良好生長，并且 在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特征與普通接種的酵母菌一致。實(shí)施例5對實(shí)施例1制得的磁性酵母菌表面微觀結(jié)構(gòu)的觀察用掃描電子顯微鏡(QUANTA200)觀察磁性酵母菌的表面形貌，樣品經(jīng)過冷凍干燥 處理。用透射電子顯微鏡(FEI Tecnai G2 20 TWIN)觀察磁性酵母細(xì)胞切面形貌，采用戊 二酸——鋨酸雙重固定法固定后進(jìn)行超薄切片，以醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后觀察。圖3顯示出了掃描電鏡觀察到的磁性酵母菌的整體形貌，表面有連續(xù)褶皺起伏結(jié) 構(gòu)。天然的酵母菌細(xì)胞壁表面平整無褶皺，見圖4b。經(jīng)過實(shí)施例1處理后的酵母菌表面有 明顯的“鋸齒”狀結(jié)構(gòu)，見圖4a，且細(xì)胞壁最外層部分厚度明顯增加，該部分結(jié)構(gòu)分布連續(xù)， 較為均勻。由此可以推斷出磁性納米顆粒已牢固附著于酵母細(xì)胞表面，這也是使細(xì)胞有趨 磁性的原因。
1權(quán)利要求
一種活體磁性微生物的制備方法，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法活化培養(yǎng)待磁化微生物；(2)對于細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的微生物，將聚陽離子和聚陰離子交替吸附在經(jīng)活化培養(yǎng)的微生物細(xì)胞表面，并使微生物細(xì)胞最外層為聚陰離子；對于細(xì)胞表面帶正電荷的微生物，則將聚陰離子和聚陽離子交替吸附在經(jīng)活化培養(yǎng)的微生物細(xì)胞表面，并使微生物細(xì)胞最外層為聚陰離子，得到細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液，所用的聚陽離子和聚陰離子為對所選待磁化微生物代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成破壞的聚陽離子和聚陰離子。(3)在細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液中加入CaCl2溶液和磁性納米顆粒水溶液，然后，再用NaOH溶液使微生物菌懸液的pH維持在弱酸性的條件下緩慢滴加Na2HPO4溶液，使反應(yīng)生成的磷酸鈣沉淀均勻的沉積在微生物細(xì)胞表面，同時(shí)使磁性納米顆粒也均勻地?fù)饺氲搅姿徕}的沉積層中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的待磁化微 生物，可以是真菌或細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的待磁化微 生物，是表面帶有正電荷的或負(fù)電荷的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的待磁化微 生物，其形態(tài)可以是球狀、桿狀或螺旋狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的活化培養(yǎng) 待磁化微生物的方法是選取待磁化微生物菌種，按常規(guī)方法接種至液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng) 至微生物培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度為IO6 IO8Hir1 ；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的將聚陽離 子和聚陰離子交替吸附在經(jīng)活化培養(yǎng)的帶負(fù)電荷的微生物表面，并使微生物細(xì)胞最外層為 聚陰離子的具體方法包括以下步驟a)清洗微生物細(xì)胞表面取一定體積的活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中， 用合適的離心轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間離心，棄上清液，加入與所取活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液等 體積的去離子水，搖勻使微生物細(xì)胞形成菌懸液，將該步驟中的離心、棄上清液、加入等體 積的去離子水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；b)細(xì)胞表面聚陽離子的吸附將菌懸液離心，棄上清后加入與步驟a)中所加去離子水 等體積的質(zhì)量百分比為0. 01 0. 5%的聚陽離子稀溶液，搖勻后靜置10 30分鐘；c)除去菌懸液中未吸附的聚陽離子將步驟b)處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與 步驟a)中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加入去離子 水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；d)細(xì)胞表面聚陰離子的吸附將步驟c)處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與步驟a) 中所加去離子水等體積的質(zhì)量百分比為0.01 0.5%的聚陰離子稀溶液，搖勻后靜置10 30分鐘；e)除去菌懸液中未吸附的聚陰離子將步驟d)處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與 步驟a)中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加入去離子 水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；f)聚陽離子和聚陰離子在微生物細(xì)胞表面的交替吸附將步驟《、()、(1)^)依次重復(fù)進(jìn)行1 4次，得到細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生物菌懸液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的將對所選 待磁化微生物代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成破壞的聚陰離子和聚陽離子交替吸附在細(xì)胞表 面帶正電荷的微生物表面，并使微生物細(xì)胞最外層為聚陰離子的具體方法包括以下步驟a’ )清洗微生物細(xì)胞表面取一定體積的活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管 中，用合適的離心轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間離心，棄上清液，加入與所取活化培養(yǎng)后的微生物培養(yǎng)液 等體積的去離子水，搖勻使微生物細(xì)胞形成菌懸液，將該步驟中的離心、棄上清液、加入等 體積的去離子水、搖勻的過程重復(fù)進(jìn)行1 3次；b’ )細(xì)胞表面聚陰離子的吸附將菌懸液離心，棄上清后加入與步驟a)中所加去離子 水等體積的質(zhì)量百分比為0. 01 0. 5%的聚陰離子稀溶液，搖勻后靜置10 30分鐘；c’)除去菌懸液中未吸附的聚陰離子將步驟b)處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與 步驟a)中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加入去離子 水、搖勻的過程反復(fù)進(jìn)行1 3次；d’ )細(xì)胞表面聚陽離子的吸附將步驟c)處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與步驟 a')中所加去離子水等體積的質(zhì)量百分比為0.01 0.5%的聚陽離子稀溶液，搖勻后靜置 10 30分鐘；e’)除去菌懸液中未吸附的聚陽離子將步驟d)處理過的菌懸液離心，棄上清，加入與 步驟a’ )中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻，將該步驟中的離心、棄上清、加入去離 子水、搖勻的過程反復(fù)進(jìn)行1 3次；f')將上述步驟b’)、c’)、d’)、e’)依次重復(fù)進(jìn)行1 4次，并在最后一次重復(fù)時(shí)， 只進(jìn)依次行步驟b’)、C’)，使細(xì)胞最外層為聚陰離子，得到細(xì)胞最外層為聚陰離子的微生 物菌懸液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的對所選待 磁化微生物代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成破壞的聚陽離子是聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚丙 烯氯化銨或陽離子聚丙烯酰胺；所述的對所選待磁化微生物代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成破 壞的聚陰離子是聚丙烯酸鈉、聚苯乙烯磺酸鈉、陰離子聚丙烯酰胺或海藻酸鈉。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的在細(xì)胞最 外層為聚陰離子的微生物菌懸液中加入CaCl2溶液和磁性納米顆粒水溶液，然后，在用NaOH 溶液使微生物菌懸液的PH維持在弱酸性的條件下緩慢滴加Na2HPO4溶液，使反應(yīng)生成的磷 酸鈣沉淀均勻的沉積在微生物細(xì)胞表面，同時(shí)使磁性納米顆粒也均勻地?fù)饺氲搅姿徕}的沉 積層中的具體方法包括以下步驟g)加入待反應(yīng)的CaCl2將經(jīng)過權(quán)利要求1所述步驟(2)處理后的菌懸液離心，棄上清， 加入與權(quán)利要求6所述步驟a)或與權(quán)利要求7所述步驟a’ )中所加去離子水等體積的濃 度為0. 005 0. 05mol/L的CaCl2溶液，搖勻；h)加入磁性納米顆粒向步驟g)處理過的菌懸液中加入濃度為0.01 0. lg/L的磁 性納米顆粒的水溶液，其體積為步驟g)所加CaCl2溶液的1/20 1/5，搖勻；i)向經(jīng)過步驟h)處理過的含有磁性納米顆粒的菌懸液中緩慢滴加與步驟g)所加 CaCl2溶液體積相同的濃度為0. 005 0. 05mol/L的Na2HPO4溶液，并不停搖勻，同時(shí)用濃度 為0. 005 0. 05mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使Na2HPO4溶液的整個(gè)滴加過程中pH維持在`6. 7 6. 8 ；j)Na2HPO4與NaOH溶液全部滴加完畢后，繼續(xù)搖勻10 60min ；k)除去過量而未反應(yīng)的試劑將步驟j)處理后的菌懸液離心，棄上清，加入與權(quán)利要 求6所述步驟a)或與權(quán)利要求7所述步驟a’ )中所加去離子水等體積的去離子水，搖勻， 將該步驟中的離心、棄上清、加入去離子水、搖勻的過程反復(fù)進(jìn)行1 3次。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所 述的磁性納米顆粒水溶液中的磁性納米顆粒是Fe3O4或γ -Fe2O3，其平均粒徑小于50nm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2) 和步驟(3)是在0 4°C條件下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所 述的去離子水、聚陽離子溶液、聚陰離子溶液、CaCl2溶液、磁性納米顆粒水溶液、Na2HPO4溶 液和NaOH溶液中加入了 NaCl，以維持微生物細(xì)胞滲透壓，NaCl的加入量根據(jù)所處理的微生 物細(xì)胞所需的滲透壓確定。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的活體磁性微生物的制備方法，其特征在于，所 述的去離子水、聚陽離子溶液、聚陰離子溶液、CaCl2溶液、磁性納米顆粒水溶液、Na2HPO4溶 液和NaOH溶液在使用前經(jīng)過高溫高壓滅菌。
14.人工制備的活體磁性微生物，其特征在于，該微生物細(xì)胞的表面有以人工方法附著 的磁性納米顆粒。
15.據(jù)權(quán)利要求14所述的人工制備的磁性微生物，其特征在于，該微生物細(xì)胞表面以 人工方法附著的磁性納米顆粒是平均粒徑小于50nm的Fe3O4或γ -Fe203。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在微生物表面高效導(dǎo)入磁性納米顆粒，獲得活體磁性微生物的制備方法，即將待磁化的微生物進(jìn)行活化培養(yǎng)后用適當(dāng)?shù)木坳栯x子和聚陰離子的稀溶液對微生物細(xì)胞表面進(jìn)行改性處理，然后加入CaCl2溶液和磁性納米顆粒的水溶液以及Na2HPO4和NaOH，生成的磷酸鈣沉淀沉積在微生物細(xì)胞表面，磁性納米顆粒摻入到磷酸鈣的沉積層中而附著于微生物細(xì)胞表面，制得的磁性微生物可保持活性。本方法可操作性強(qiáng)，對于不同種類的微生物具有較好的普適性，可以使一般微生物活細(xì)胞額外獲得趨磁性，可應(yīng)用于微生物生物制造的過程控制，進(jìn)一步組裝微納米新材料和新器件。
文檔編號C12R1/865GK101906409SQ200910062428
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日
發(fā)明者史續(xù)典, 楊光, 王大明 申請人:華中科技大學(xué)