專利名稱：一株纖維素降解菌株lcb12的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株纖維素降解菌株LCB12的基因，它為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (沒e"o的j^omo"^ma/to;^7/fl) LCB12 CCTCC N:M 209098的16S r DNA基因。其中一株纖維 素降解菌株LCB12，為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(5fe"o/ro; /w附o"^附"/^7A沾")LCB12 CCTCC N:M 209098，已于2009年5月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏號(hào)CCTCCN: M 209098。通過經(jīng)典表型鑒定和16S rDNA核苷酸序列分析相結(jié)合的方法，對(duì)一株纖維素降 解菌株LCB12進(jìn)行了生理生化和16S rDNA分子水平的鑒定，由此確定它為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞 菌。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物，是一類可再生的重要資源和能源。纖維素不 溶于水，在環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難降解，并廣泛存在于農(nóng)作物秸稈、城市固體廢物、畜禽養(yǎng) 殖廢棄物和造紙廢水中，是難降解污染物之一。目前，從環(huán)境中分離和選育纖維素酶高產(chǎn) 菌株，挖掘纖維素酶產(chǎn)生菌的資源，利用微生物的酶解作用，解決環(huán)境污染問題，甚至轉(zhuǎn)化 為能源已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株纖維素降解菌株LCB12的基因，通過16S rDNA序列分析方法， 對(duì)一株纖維素降解菌株LCB12進(jìn)行分子水平的鑒定，確定其為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。該菌株 具有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力。
一株纖維素降解菌株LCB12的基因，其特征在于為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (沒e"o/rop/wmwKW wa/top/n7/a) LCB12 CCTCC N: M 209098的16S r DNA基因，其菌株的 16SrDNA全序列如下
CAGAGTGMCGCTGGCGGTAGGCCTAACACATGCMGTCGMCGGCAGCACAGGAGAGCT60
TGCTCTCTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCATCGGMTTTACTCTTTCGTG120
GGGGATMCGTAGGGAMCTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTG嵐GCCGGGG180
ACCTTCGGGCCTGGCGCGMTGMTGAGCCGATGCCCGATAGCTAGTTGGCGGGGTAAGA240
GCCCACCMGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGMCTGA300
GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCMGC360
CTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGMGMGGCCTTCGGGTTGT嵐GCCCTTTTGTTGG420
GAMGAAAAGCAGTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCG480
GCTMCTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTMTACGMGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACT540
GGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTGTTTAAGTCTGTCGTGAMGCCCTGGGCTCMCCT600
GGGAATTGCGATGGAAACTGGGCGACTAGAGTGTGGCAGAGGATAGTGGAATTCCTGGTG660
TAGCAGTGMATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCGTGGCGMGGCGACTGTCTGGGCC720
MCACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAMCAGGATTAGATACCCTGGTAGTC780
CACGCCCTAAACGATGCGMCTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTA840
ACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCMGACTG嵐CTCAAAGGMTTGAC■GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC960
CTGGCCTTGACATGCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGACA1020
CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG1080
AGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCG1140
GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGC1200
TACACACGTACTACAATGGTGGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGTCAATCG1260
CAGAAACCCCATCTCAGTCCGTATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCG1320
CTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC1380
CCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGC1440
TGCAC1445
上述16S r DNA序列全長(zhǎng)1445個(gè)核苷酸。 所述的畜禽主要有豬、牛、羊、驢、兔、雞、鴨、鵝等。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的一株纖維素降解菌株LCB12的基因，它是嗜麥芽寡養(yǎng) 單胞菌(Sfe"o的; /zo附wKWwa/topM/a) LCB12 CCTCC M 209098的16SrDNA基因，本發(fā)明 基因序列，通過提取細(xì)菌核DNA， 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA 的全序列測(cè)定和分析而獲得。
本發(fā)明從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥中篩選到一株在纖維素條件下具有一定生長(zhǎng)能 力的新菌株。 一株纖維素降解菌株LCB12有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力，該 菌株能使纖維素的去除效率提高8-12%，能在72小時(shí)之內(nèi)去除畜禽養(yǎng)殖廢水中的纖維素 24-30mg/L。


圖1是纖維素降解菌株LCB12的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1:核DNA， 2:擴(kuò)增產(chǎn)物，3: Marker)。
圖2是纖維素降解菌株LCB12的掃描電鏡圖。 圖3是纖維素降解菌株LCB12的纖維素酶活數(shù)據(jù)圖。
具體實(shí)施例方式
一、 一株纖維素降解菌株LCB12的篩選方法
(一)、材料準(zhǔn)備
1、 實(shí)驗(yàn)廢水和池底污泥取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口。
2、 培養(yǎng)基
篩選培養(yǎng)基(g/L): Na2HP043.0， NH萬O. 8， MgS04 7H20 0. 1， CaCl20. 1， CMC-Na 2.0， 微晶纖維素粉l.O，濾紙2.0，稻草2.0， pH值7.0 7.2。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L): Na2HP043. 0, ,030. 8， MgS04 7H20 0. 5， CaCl20.5， FeS04 7H20 0. 01， MnS04 H20 0. 01， ZnS04 0. 01， CMC-Na 10. 0 (或微晶纖維素粉5. 0或纖維二糖5. 0)， 蛋白胨1.0，酵母提取物O. 5， pH值7.0 7.2。
LB液體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 訓(xùn)OmL， pH7.0。
LB固體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 lOOOmL，瓊脂15g (固)，pH7.0。
LB斜面培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 lOOOmL，瓊脂20g (固),pH7.0。
3、 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 國(guó)華SHA-B恒溫振蕩器， S朋150G光照生物培養(yǎng)箱，臥式壓力蒸汽滅菌器------上海醫(yī)用核子儀器廠，
光學(xué)顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH計(jì)等-----Hana有限公司，
超凈工作臺(tái)， 鼓風(fēng)干燥箱，
KYKY-1000B掃描電子顯微鏡， PTC200型PCR儀， 電泳儀及電泳槽， UVP凝膠紫外觀測(cè)儀，
微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑廠，DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自 美國(guó)Promega公司、7bg酶、dNTP、 DNAMarker、 酶均購自日本Takara公司。
(二)、菌株的篩選分離與純化
1) 、初篩①稱取1克畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥樣品(樣品為池底污泥，池底污 泥取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口 )，用20 mL無菌水水洗，8000，m離心5 min， 棄上清，再加20mL水，重懸土樣；重懸后再加20mL水離心(8000 rpm離心5 min)，棄 上清，重懸土樣，此步驟重復(fù)操作3次，得到泥水混合物，備用；
② 將泥水混合物轉(zhuǎn)入裝有l(wèi)OOmL篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，3(TC恒溫靜至培養(yǎng) 至培養(yǎng)基渾濁，得到菌懸液A;
③ 取5 mL菌懸液A于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周；將 培養(yǎng)一周后的菌懸液取5 mL于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周， 重復(fù)操作5-6次，最后得到的菌懸液B;
④ 將最后得到的菌懸液B中取20叱于LB平板上涂布；置30。C下恒溫培養(yǎng)l-3天，挑 取長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落形態(tài)各不相同的菌落，經(jīng)2-5次純化后{純化用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物
(LB平板上的菌落)少許在平板上進(jìn)行劃線；當(dāng)接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)， 接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成 一個(gè)菌落，即得到純化后的單菌落K得到待鑒定的菌落，保種備用。
2) 、 二次篩選將待鑒定的菌落在LB液體培養(yǎng)基中隔夜培養(yǎng)后，點(diǎn)種到篩選培養(yǎng)基平
板上，30。C恒溫培養(yǎng)2~4 d，往培養(yǎng)皿中加入30mL的1 mg/mL的剛果紅溶液，染色1 h， 棄去染液，加入50mL的1 mol/L的NaCl溶液,洗滌1 h，若菌落的周圍會(huì)出現(xiàn)清晰的透明圈， 說明細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶，依據(jù)透明圈的直徑大小選擇直徑大的產(chǎn)酶菌株。
用接種針挑取直徑大的產(chǎn)酶菌株(在菌落特征上有明顯差異的單菌)，對(duì)挑取的產(chǎn)酶菌 株在LB平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至獲得單一菌株，并于LB斜面培養(yǎng)基上劃線保種，得到 一株菌株LCB12，即纖維素降解菌株LCB12。
二、纖維素降解菌株LCB12的鑒定
1、對(duì)纖維素降解菌株LCB12的鑒定
對(duì)纖維素降解菌株LCB12進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rRNA分子的鑒定，從分子水
平確定纖維素降解菌株的種屬。
16S rRNA序列分析主要按照以下步驟 1)提取細(xì)菌核DNA，
a) 集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)，取其菌 懸液lmL于1. 5mL的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。
b) 加STE緩沖液lmL洗一次，振蕩重懸細(xì)菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
c) 加600 pLTE緩沖液，劇烈振蕩重懸細(xì)菌，加入10%的SDS 65pL， 65。C水浴5-10min。d) 加等體積酚氯仿抽提三次。
e) 小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3麗aAc， 12000 rpm離心10min。 徹底棄上清。
f) DNA沉淀用70%乙醇洗一次，風(fēng)干后溶于20|aL TE緩沖液備用。
TE緩沖液lO腿ol /L Tris-Cl (pH8. 0); lmmol /L EDTA-Na2 (p朋.0)， STE緩沖液0. lmol/L NaCl 10腿ol/L Tris-Cl (pH8.0) lmmol/L EDTA (pH8. 0)，
2) 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，
PCR擴(kuò)增引物參照Weisburg等人的方法合成。 Pl:正向引物5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3， P2:反向引物5' GGTTACCTTGTTACGACTT3， 在50nL反應(yīng)體積中，加入lnL模板DNA (0. l(ag)， 0. 5pL Pl和P2 (終濃度為0. 5pM)， lpLdNTP (每種NTPO. 2 mM)， 0. 5pLTaq聚合酶(2 U)禾Q 5 IOXPCR緩沖液。PCR擴(kuò)增 條件為94。C預(yù)變性5min;在94。C變性30s， 61-65。C退火30s， 72。C延伸lmin，循環(huán)30 次；最后72 °C終延伸10 min。
3) PCR產(chǎn)物的回收
將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放 入1. 5mL離心管中加2倍體積TE， 65'C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取 上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍 體積無水乙醇沉淀，離心，用濃度為70%乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。
4) 16S rDNA的全序列測(cè)定和分析
PCR測(cè)序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。 P-f: CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC; P-r: GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC 。 加入l)aL模板DNA (<0. l嗎)，PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94 °C 1 min， 55 °C 30s， 72 。C 2min)。采用ABI PRISM測(cè)序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373 A DNA測(cè)序儀上測(cè)序。測(cè)得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，
最終從分子水平上確定該菌的種屬。 2、 16S rRNA序列測(cè)定 本發(fā)明采用對(duì)16SrRNA序列測(cè)定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的 核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度 為1445bp的擴(kuò)增帶(用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測(cè)定 其全序列。序列如下 <110〉 中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)
<120〉 一株纖維素降解菌株LCB12的基因
<160〉 1445
<210> 1 <211> 1445bp <212〉 DNA
<213〉 卩譽(yù)麥芽寡養(yǎng)單胞菌(5!fe"ofrcip/w附cway <400〉 1
6GCTGGCGGTAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGGAGAGCT60
TGCTCTCTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCATCGGAATTTACTCTTTCGTG120
GGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTMTACCGCATACGACCTACGGGTGMAGCCGGGG180
ACCTTCGGGCCTGGCGCGAATGMTGAGCCGATGCCCGATAGCTAGTTGGCGGGGTMGA240
GCCCACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGMCTGA300
GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGMTATTGGACMTGGGCGCMGC360
CTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGMGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGG420
GAAAGAAAAGCAGTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCC嵐GAATMGCACCG480
GCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTMTACGAAGGGTGCMGCGTTACTCGGAATTACT540
GGGCGTMAGCGTGCGTAGGTGGTTGTTTAAGTCTGTCGTGAMGCCCTGGGCTCMCCT600
GGGMTTGCGATGGAMCTGGGCGACTAGAGTGTGGCAGAGGATAGTGGAATTCCTGGTG660
TAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCGTGGCGMGGCGACTGTCTGGGCC720
AACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC780
CACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTA840
ACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCMGACTGAMCTCMAGGAATTGAC■
GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTMTTCGATGCAACGCGAAGMCCTTAC960
CTGGCCTTGACATGCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGACA1020
CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCMCG1080
AGCGCMCCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGMCTCTAAGGAGACCGCCG1140
GTGACAMCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGC1200
TACACACGTACTACAATGGTGGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGTCAATCG1260
CAGAAACCCCATCTCAGTCCGTATTGGAGTCTGCMCTCGACTCCATGMGTCGGAATCG1320
CTAGTMTCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC1380
CCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGMGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGC1440
TGCAC1445
三、 菌落形態(tài)特征以及生理生化特性
菌株LCB12的菌落形態(tài)菌落呈橘紅色、不透明、圓形、表面光滑，中心凸出、邊緣 整齊；生理特征細(xì)菌呈規(guī)則的直桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列，常呈V形排列，革蘭氏陰性， 運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，不產(chǎn)生氧化酶和接觸酶；最適生長(zhǎng)pH值6.5 7.5，最適生長(zhǎng)溫度25-35 °C，不能在6(TC生長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)菌表觀也做了掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖2。
四、 菌株LCB12為新的菌株
采用BLAST分析法對(duì)菌株LCB12的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)， 菌株LCB12與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(5fe"o加如omoH^ wato;7/ 7/a)的同源性高達(dá)99.0%。
綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，菌株LCB12命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (&e"o/ro;j/2o附oMasmfl/top/2z7/fl) LCB12。查閱有關(guān)資料，尚嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬有關(guān)畜禽養(yǎng) 殖廢水中降解纖維素能力研究的報(bào)道。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Sfe"0加少/20附朋a;y ma/topMfa) LCB12為新的菌株，已于2009年5月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)， 保藏號(hào)CCTCC N:M 209098。
本發(fā)明從自湖北省鄂州市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥(沉積底泥)篩選分離出 這一株細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解纖維素養(yǎng)殖廢水的功能。這拓寬了人們對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單 胞菌(5te"o加; /2omomy膨/啤M&)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含纖維素畜 禽養(yǎng)殖廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
7五、菌株LCB12的應(yīng)用
(一)、挑取嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(5te"ofrop/wmo"oy watop/n7/a) LCB12單菌落，于LB 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(5fe"Wra; /zomo"w ma/to; /z///a) LCB12:含纖維素廢水(如畜禽養(yǎng)殖廢水，即實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖 場(chǎng)排污口)的體積比為0.5-2: 100接種，30-35'C恒溫培養(yǎng)，pH值為6_8，反應(yīng)48_72小 時(shí)。
所述的LB固體培養(yǎng)基為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000raL，瓊脂15g (固)，pH7. 0。
(二)、菌株LCB12產(chǎn)纖維素酶的能力
纖維素是大分子的聚集，由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)交錯(cuò)而成。將天然纖維素分解，必須依 靠?jī)?nèi)切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG)三種酶協(xié)同作用 才能完成。為了考察菌株對(duì)纖維素的降解能力，研究了在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，細(xì)菌生產(chǎn)三種酶 的能力。取產(chǎn)酶培養(yǎng)基100mL加入250mL的錐形瓶中，加入菌株LCB12的菌懸液(用接種 環(huán)挑取LCB12菌落于10mL LB液體培養(yǎng)基中，30。C震搖培養(yǎng)12小時(shí))lmL，加入含纖維素 廢水(實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口) 100mL (纖維素的濃度為 300-500mg/L)， 30°C、震搖培養(yǎng)一周，檢測(cè)各種酶活(見圖3)。結(jié)果表明，該菌株LCB12 在一周內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG)三 種酶酶活可分別達(dá)到13.9， 6.2， 15.2U/mL。
為了考察該菌株(菌株LCB12)在實(shí)際處理畜禽養(yǎng)殖廢水的中降解纖維素的能力，研究 了該菌株投加到畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧反應(yīng)器中(實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng) 殖場(chǎng)排污口)，纖維素的降解效率。在長(zhǎng)期(穩(wěn)定運(yùn)行三個(gè)月以上)穩(wěn)定運(yùn)行的反應(yīng)器中加 入菌株LCB12的菌懸液(用接種環(huán)挑取LCB12菌落于10mL LB液體培養(yǎng)基中，3(TC震搖培 養(yǎng)12小時(shí))10m L，反應(yīng)器中含纖維素廢水(實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng) 殖場(chǎng)排污口)為1000mL (纖維素的濃度為300-500mg/L)， 3CTC、靜止一周，再穩(wěn)定運(yùn)行30 天，在反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行期間定期檢測(cè)纖維素的去除效率，與未投加該菌株的對(duì)照反應(yīng)器對(duì) 比，結(jié)果表明，該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)去除畜禽養(yǎng)殖廢水中的纖維素24-30mg/L;該菌株 能使該反應(yīng)器處理纖維素的去除效率提高8-12% (原始處理率為65-70°/。，加入菌株LCB12 后處理率為75-80%)。
權(quán)利要求
1.一株纖維素降解菌株LCB12的基因，其特征在于為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)LCB12 CCTCC NM 209098的16S r DNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下CAGAGTGAAC GCTGGCGGTA GGCCTAACAC ATGCAAGTCG AACGGCAGCA CAGGAGAGCT60TGCTCTCTGG GTGACGAGTG GCGGACGGGT GAGGAATGCA TCGGAATTTA CTCTTTCGTG120GGGGATAACG TAGGGAAACT TACGCTAATA CCGCATACGA CCTACGGGTG AAAGCCGGGG180ACCTTCGGGC CTGGCGCGAA TGAATGAGCC GATGCCCGAT AGCTAGTTGG CGGGGTAAGA240GCCCACCAAG GCGACGATCG GTAGCTGGTC TGAGAGGATG ATCAGCCACA CTGGAACTGA300GACACGGTCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT ATTGGACAAT GGGCGCAAGC360CTGATCCAGC CATACCGCGT GGGTGAAGAA GGCCTTCGGG TTGTAAAGCC CTTTTGTTGG420GAAAGAAAAG CAGTCGGTTA ATACCCGATT GTTCTGACGG TACCCAAAGA ATAAGCACCG480GCTAACTTCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGAAGGGTGC AAGCGTTACT CGGAATTACT540GGGCGTAAAG CGTGCGTAGG TGGTTGTTTA AGTCTGTCGT GAAAGCCCTG GGCTCAACCT600GGGAATTGCG ATGGAAACTG GGCGACTAGA GTGTGGCAGA GGATAGTGGA ATTCCTGGTG660TAGCAGTGAA ATGCGTAGAG ATCAGGAGGA ACATCCGTGG CGAAGGCGAC TGTCTGGGCC720AACACTGACA CTGAGGCACG AAAGCGTGGG GAGCAAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC780CACGCCCTAA ACGATGCGAA CTGGATGTTG GGTGCAATTT GGCACGCAGT ATCGAAGCTA840ACGCGTTAAG TTCGCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGAC TGAAACTCAA AGGAATTGAC900GGGGGCCCGC ACAAGCGGTG GAGTATGTGG TTTAATTCGA TGCAACGCGA AGAACCTTAC960CTGGCCTTGA CATGCACGGA ACTTTCCAGA GATGGATTGG TGCCTTCGGG AACCGTGACA1020CAGGTGCTGC ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG1080AGCGCAACCC TTGTCCTTAG TTGCCAGCAC GTAATGGTGG GAACTCTAAG GAGACCGCCG1140GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA CGGCCAGGGC1200TACACACGTA CTACAATGGT GGGGACAGAG GGCTGCAAGC CGGCGACGGT AAGTCAATCG1260CAGAAACCCC ATCTCAGTCC GTATTGGAGT CTGCAACTCG ACTCCATGAA GTCGGAATCG1320CTAGTAATCG CAGATCAGCA TTGCTGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC1380CCGTCACACC ATGGGAGTTT GTTGCACCAG AAGCAGGTAG CTTAACCTTC GGGAGGGCGC1440TGCAC1445上述16S r DNA序列全長(zhǎng)1445個(gè)核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株纖維素降解菌株LCB12的基因，其特征在于:采用BLAST 分析法，對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S^wWrap/wwomw wa/top/n7fa) LCB12 CCTCC N:M 209098 的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(5fe"Wra; /K>wo"ffif wa/top/ 7/a ) LCB12 CCTCC N:M 209098與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(iSewWrap/wmoway ma/to; /n7/a)的同源性高達(dá)99 0% 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株纖維素降解菌株LCB12的基因。一株纖維素降解菌株LCB12的基因，其特征是它是嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)LCB12 CCTCC NM 209098的16S r DNA基因。本發(fā)明基因序列，通過提取細(xì)菌核DNA，16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析而獲得。本發(fā)明從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥中篩選到一株在纖維素條件下具有一定生長(zhǎng)能力的新菌株，它有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101665790SQ20091006306
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者珩 劉, 琨 劉, 平 李, 王焰新, 王艷紅, 蕾 童 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)