專利名稱：一種納米分子生物傳感器及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和分析生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種納米分子生物傳感器，還涉及一種納米分子生物傳感器的制備方法，同時還涉及納米分子生物傳感器的用途。用于檢測各種臨床、環(huán)境樣品中的目標分子。
背景技術(shù)：
生物傳感器是利用一定的生物或化學(xué)的固定技術(shù)，將生物識別元件(酶、抗體、抗原等)固定在換能元件上，當待測物與生物識別元件發(fā)生特異性反應(yīng)后，通過換能元件將所產(chǎn)生的反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵?、檢測的電信號和光信號等，以此對待測物質(zhì)進行定性和定量分析，從而達到檢測分析的目的。就生物傳感器目前發(fā)展的情況而言，主流仍就是電化學(xué)生物傳感器，這類傳感器是將一些具有生物特性的物質(zhì)，如酶、抗原、抗體、核酸、細胞、組織等作為生物識別元件，而將各種各樣的電極作為換能元件。其生物識別元件是通過共價鍵結(jié)合、LB膜、自組裝膜、化學(xué)免疫、靜電吸附結(jié)合、表面富集等方法與電極結(jié)合。此類傳感器應(yīng)用廣泛，種類多樣，但是也存在其自身的一些限制，如制備步驟繁瑣(包括生物識別元件的獲得、電極的修飾、生物識別元件與電極的結(jié)合等步驟)，由于識別元件與換能器空間分離，得到高檢測靈敏度難度較大等。分子生物傳感器一般將生物識別分子與具有換能功能的生物分子比如pH敏感熒光蛋白分子等直接連接在一起，可以通過蛋白質(zhì)工程手段構(gòu)建，或者化學(xué)方法制備，具有靈敏度高、制備簡單、使用方便等優(yōu)點。但是在一些需要更高靈敏度的檢測領(lǐng)域，譬如環(huán)境中低濃度的農(nóng)藥殘留，單細胞中的成份檢測等方面，還有待進一步提高其靈敏度。
甲基對硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase, MPH)是一種主要以甲基對硫磷(parathionmethyl)為底物的酶。該酶能將甲基對硫磷水解成對硝基苯酚和二甲基硫代磷酸。甲基對硫磷俗稱甲基1605，是有機磷農(nóng)藥中的一種，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于糧食、棉等經(jīng)濟作物的害蟲防治。雖然甲基對硫磷的毒性只相當于對硫磷的1/3，但是仍然屬于劇毒，具有內(nèi)吸性，因此要嚴格按規(guī)定施藥，并加強安全防護措施。但甲基對硫磷中毒的事件還是時有發(fā)生。尤其是其在農(nóng)作物上的大量使用，對人體健康造成極大的危害。因此發(fā)展一種快速有效的有機磷農(nóng)藥檢測方法具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種納米分子生物傳感器，結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，主要特點在于使用成線蛋白質(zhì)將分子生物傳感器自組裝成納米分子傳感器，與未組裝的分子生物傳感器比較，極大地提高了檢測靈敏度。
本發(fā)明的又一個目的是在于提供了一種納米分子生物傳感器的制備方法，利用蛋白質(zhì)融合技術(shù)，將作為生物識別元件的特定酶分子和作為換能器元件的熒光蛋白融合在一起，得到一種同時具有識別和換能輸出信號的功能蛋白。同時利用具有自組裝功能的成納米線蛋白與上述功能蛋白融合，使得上述功能蛋白又增加了自組裝成納米線的功能，使得輸出信號得到進一步放大。這種在基因水平上的融合，簡化了生物傳感器的制備過程和成本， 一旦在基因水平構(gòu)建成功，每次制備只需將構(gòu)建好的基因表達純化即可獲得此傳感器。如果將此傳感器用于檢測，可提高檢測靈敏度，并具有快速、成本低的優(yōu)點。
本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種納米分子生物傳感器在對甲基對硫磷檢測農(nóng)藥中的應(yīng)用。該傳感器比現(xiàn)有基于顏色反應(yīng)的甲基對硫磷靈敏上萬倍。
為達到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)措施
一種納米分子生物傳感器，如圖1所示，它包括成線蛋白質(zhì)(NAN0P) 1、熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 2、酶(E) 3，其結(jié)構(gòu)關(guān)系是成線蛋白質(zhì)(NAN0P) l為骨架，成線蛋白質(zhì)與其融合的熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 2和酶(E) 3分布在骨架l的周圍。該納米分子生物傳感器一般上熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 2與骨架1連接，酶3再與熒光蛋白質(zhì)2連接，也可以通過改變?nèi)诤系鞍踪|(zhì)的順序，使酶3與骨架1連接，熒光蛋白質(zhì)2再與酶3連接。應(yīng)用該傳感器時，待檢測的目標分子4先與酶3作用，生成產(chǎn)物5，同時釋放H+或0H—離子，引起局域pH值變化，該變化會被熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 2感知，引起其熒光強度的變化。該納米生物分子傳感器為一個成納米線融合蛋白，它的融合蛋白質(zhì)單體基因由一段核酸序列所編碼，該納米生物傳感器并具有以下功能l)具有自組裝成納米線功能，2)具有對pH值敏感的熒光蛋白的功能，3)具有作為其自身識別元件的酶的催化活性，該酶在其催化的反應(yīng)過程具有pH值變化特征。制備該納米分子生物傳感器的歩驟是
1)設(shè)計一條短肽鏈的基因，將對所檢測分子具有識別功能的酶分子基因(下
文簡稱為e)與具有pH值敏感的熒光蛋白基因(e2gfp)連接在一起，保證該基因(e2gfp-1-e)表達的融合蛋白能正確折疊，保留其活性功能的完整性，并進一歩與成線蛋白質(zhì)基因(nanop)連接，得到納米分子傳感器的基因(nan叩-
e2gfp-l-e)o
2) 將構(gòu)建的納米分子傳感器基因(nanop- e2gfp-1-e)與合適的蛋白質(zhì)表達載體連接，轉(zhuǎn)入表達菌株中，表達納米分子傳感器單體蛋白質(zhì)
(NAN0P-E2GFP-L-E)。
3) 表達的納米分子傳感器單體蛋白質(zhì)(MN0P-E2GFP-L-E)，經(jīng)過分離純化后，所得融合蛋白單體在合適的緩沖液和pH (pH 1-12)條件下進行自組裝成納米線，成為最終應(yīng)用的納米分子傳感器。
本發(fā)明獲得的納米分子生物傳感器在檢測農(nóng)藥甲基對硫磷中的應(yīng)用。其應(yīng)用過程是選用甲基對硫磷水解酶為該納米分子生物傳感器的識別元件，酵母蛋白質(zhì)Sup351—61作為成線蛋白質(zhì)，將該納米分子生物傳感器表達純化得到后，與高純水按1:4混合得到檢測反應(yīng)液，取100nl此檢測反應(yīng)液到比色皿中，在熒光分光光度計選用激發(fā)波長488nm，讀取523nm處的峰高值作為熒光強度初始值，依次分別加入l)il系列濃度梯度的甲基對硫磷樣品(溶劑甲醇)，反應(yīng)后再次測523nm處的峰高作為熒光強度值。由此可以得到甲基對硫磷濃度與熒光強度減弱變化率的標準曲線。待測樣品經(jīng)前處理，也以上述方法檢測，就能在標準曲線上找到相應(yīng)的甲基對硫磷濃度值，繼而達到檢測甲基對硫磷的目的。本發(fā)明應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點
l)生物傳感器的識別元件和換能元件分別由兩種有特定功能的蛋白質(zhì)來充當。并運用蛋白質(zhì)融合技術(shù)將兩者有效的結(jié)合在一起，減化了生物傳感器的制備歩驟。只需一步表達純化就能拿到所需生物傳感器。2) 加入了自主裝納米線蛋白， 一方面使得納米線的組裝與生物傳感器的獲得可以同步，無須另外步驟。另一方面納米技術(shù)的引入大大提高了該生物傳感器的
靈敏度。
3) 檢測所需樣品量少，檢測靈敏度高。本發(fā)明的傳感器檢測可以在一個10041液相體系中完成的，檢測樣品只需1^1即可。


圖l. 一種納米分子生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖
l一成線蛋白質(zhì)(NANOP) 2 —熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 3 —酶(E) 4—檢測分子5 —檢測分子與酶反應(yīng)后產(chǎn)物。
圖2.構(gòu)建的融合蛋白Sup351—61-E2GFP-L-MPH的電子顯微鏡照片。照片顯示該融合蛋白能夠自主裝成納米線，且納米線的形狀清晰。
圖3.本發(fā)明的納米分子生物傳感器熒光強度對應(yīng)pH值的變化曲線。結(jié)果顯示，納米分子生物傳感器熒光強度在P服.0-8. O的范圍內(nèi)隨pH值變化趨勢明顯。
圖4.本發(fā)明的納米分子生物傳感器在檢測系列濃度梯度的甲基對硫磷樣品下得到的熒光強度減弱變化率的標準曲線與常規(guī)分子生物傳感器的比較圖。結(jié)果顯示，在該納米分子生物傳感器(成線融合蛋白)的濃度為100^il/ml，反應(yīng)體系磷酸鹽緩沖液濃度為10nmol/l的條件下，對甲基對硫磷進行檢測下限到lnmo1/1，也就是O. 2-0. 3ng/ml。
具體實施例方式
通過以下實施方案來具體說明本發(fā)明，而不對本發(fā)明做出限定。一種納米分子生物傳感器，根據(jù)圖l可所，納米分子生物傳感器它包括成線蛋白質(zhì)(NAN0P) 1、熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 2、酶(E) 3，其結(jié)構(gòu)關(guān)系是成線蛋白質(zhì)(N緒0P) l為骨架，成線蛋白質(zhì)l與其融合的熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 2和酶(E)3分布在骨架1的周圍。該納米分子生物傳感器一般上熒光蛋白質(zhì)(E2GFP)2與骨架1連接，酶3再與熒光蛋白質(zhì)2連接，也可以通過改變?nèi)诤系鞍踪|(zhì)的順序，使酶3與骨架1連接，熒光蛋白質(zhì)2再與酶3連接。應(yīng)用該傳感器時，待檢測的目標分子4先與酶3作用，生成產(chǎn)物5，同時釋放H+或0H—離子，引起局域pH值變化，該變化會被熒光蛋白質(zhì)(E2GFP) 2感知，引起其熒光強度的變化。
以甲基對硫磷水解酶檢測農(nóng)藥甲基對硫磷為例，該納米分子生物傳感器的制備過程是
1) 本發(fā)明所用到的pH敏感熒光蛋白質(zhì)E2GFP是在表達載體pEGFP-Cl (購自BDBiosciences公司)中EGFP的基礎(chǔ)上突變了兩個位點得到，這兩個位點為T203Y，L231H ， 結(jié)構(gòu)基因長度為714bp 。 設(shè)計引物E2gfp-A : 5，TCGCCCGGTGAGCAAGGGC 3' 禾卩 E2gfp-D : 5，AGTCCAAGCACAGCTCGTCCAT 3'將E2GFP基因通過PCR擴增得到，并使兩端帶上Nde I和ffindin酶切位點，并用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切得到酶切片斷。
2) MPH基因來源自Pseudomonas sp.WBC-3 (申請人實驗室篩選得到，具體參見專利有機磷農(nóng)藥降解菌及其制備方法，ZL01128319.X),結(jié)構(gòu)基因長度為896bp。 MPH基因定位于Pseudomonas sp.WBC-3的大質(zhì)粒上。通過堿裂解法得到質(zhì)粒，以得到的質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物Mph-A : 5 'ACTCTGATATCGCCGCCAGCA 3 ' 禾Q Mph-D : 5 'TCCCAGCTGGATGGGGTTGAC3，將MPH基因通過PCR擴增得到，并使兩端帶上EcoRV和Xho I酶切位點，并用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切得到酶切片斷。
3) 設(shè) 計 兩 條 核 苷 酸 鏈 5'AGCTTAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGTGAT 3' 禾B 5，ATC ACCGGAACCGCTACCGAACC AGAGCCGCTA3 ，將這兩條核苷酸鏈在65。C下退火得到一條雙鏈核苷酸，兩端帶有Hindin和EcoRV酶切位點。
4) 用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I酶切質(zhì)粒pET20b (+)(購自Novagen公司)，得到相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切得到酶切片斷。將上述片斷通過連接酶連接在一起，連接條件為16。C， 12小時。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入￡ coh' DH5a(購自美國Merck公司)感受態(tài)中。轉(zhuǎn)化子中獲得的正確陽性克隆子即為DH5a/ pET20b ( + ) -E2GFP-L-MPH菌株。
5) 設(shè)計引物E2gfp隱mph-A: 5， GGAGCCGAATTGTACGTGAGCAAGGGC 3，和E2gfp-mph-D: 5， TGGTGCTCGAGAGTGTTGGGGTTGACGA 3'通過PCR從以上得到的pET20b ( + ) -E2GFP-L-MPH質(zhì)粒上擴增出兩端帶有EcoR I和Xho I酶切位點的E力FP-L-Mra基因，并用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切得到酶切片斷。6) 所用到的Sup35""基因來源自畢赤酵母的Sup35p基因，取其N區(qū)的前183bp。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切pET28a-Sup35"1質(zhì)粒(申請人實驗室構(gòu)建得到，具體構(gòu)建見下面)，得到相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切片斷。通過連接酶將￡20 丄-^0^的酶切片斷和？￡丁28&- S邵35"61 (申請人實驗室構(gòu)建)酶切片斷進行連接，連接條件同上述。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coliDH5a感受態(tài)中。轉(zhuǎn)化子中獲得的正確陽性克隆子即為含有質(zhì)粒pET28a-Sup351-61-E2GFP-L-MPH的DH5
a菌株。所述的pET-28-Sup351—61制備過程是設(shè)計帶有6xHis-tag編碼序列和Nco I酶切位點的上游引物和帶有BamH I酶切位點的下游引物，從畢赤酵母的基因組里PCR擴增得到。PCR產(chǎn)物片段和pET-28 (Merck)通過Nco I和BamH
I雙酶切后，連接在一起轉(zhuǎn)入E. coli DH5 a感受態(tài)中，得到含有pET-28-Sup351—61質(zhì)粒的E. coli DH5a菌株，將該菌株培養(yǎng)后，既可通過提取菌液得到pET-28-Sup35"61質(zhì)粒。
7) 在37。C下，將DH5a/ pET28a-Sup351-61-E2GFP-L-MPH接種至ijLB+卡那霉素培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，將該質(zhì)粒pET28a-Sup351—61-E2GFP-L-MPH轉(zhuǎn)化到表達菌株A BL21 (DE3)制得的感受態(tài)細胞中。
8) 挑取BL21 (DE3)(購自美國Merck公司)/ pET28a-Sup35IHU-E2GFP-L-MPH轉(zhuǎn)化子到LB+卡那霉素培養(yǎng)基中，37t:培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)得到的菌液按1/100的量接入新鮮LB+卡那霉素培養(yǎng)基中，在37'C下進行擴大培養(yǎng)。當菌液OD到達O. 5-0. 8時，當加入IPTG(購自美國Merck公司)誘導(dǎo)目的融合蛋白進行表達。誘導(dǎo)表達溫度25-30°C，誘導(dǎo)時間5-6小時。
9) 通過離心(8000rpm,7min)收集菌體，將收集到的菌體重懸到磷酸鹽緩沖液中，通過超聲波進行破碎。在4"C條件下，將破碎過后的溶液高速離心
(13000rpra， 30min),取上清，獲得粗蛋白樣品。
10) 蛋白質(zhì)的純化采取Ni離子親和層析，柱子用20raM咪唑，50mMNaHiU_Na2HP04 (p朋.O)的緩沖溶液平衡，上樣后，用100mM咪唑，50raMNaH2P(VNa2HP04 ( pH8. 0 )將目的蛋白洗脫下來。 由此得到具有Sup35'—fil-E2GFP-L-Mra基因編碼的相對應(yīng)的融合蛋白質(zhì)單體。
11) 融合蛋白蛋白質(zhì)單體稀釋到l-2mg/ml，與4'C下靜止過夜，即可自組裝成納米線。所獲得的納米分子傳感器在電鏡觀察下，顯示該融合蛋白能夠自主裝成納米線，且納米線的形狀清晰，如圖2所示。
所構(gòu)建的納米分子生物傳感器，包括成線蛋白質(zhì)(S叩351—61)、熒光蛋白質(zhì)(E2GFP)、酶(MHO,其結(jié)構(gòu)關(guān)系是成線蛋白質(zhì)(S叩351—61)為骨架，成線蛋白質(zhì)l與其融合的熒光蛋白質(zhì)(E2GFP)和酶(Mm)分布在骨架的周圍。其中熒光蛋白質(zhì)(E2GFP)與骨架連接，酶再與熒光蛋白質(zhì)連接。也可以通過改變?nèi)诤系鞍踪|(zhì)的順序，使酶與骨架連接，熒光蛋白質(zhì)再與酶連接。
為檢驗本發(fā)明獲得的納米分子生物傳感器對液相pH值的敏感范圍，將此種納米生物分子傳感器與磷酸鹽緩沖溶液配得的一系列pH值融合分別混合，各個混合液分別取100pl到比色皿中，在熒光分光光度計選用激發(fā)波長488nm，讀取500-600nm處的峰面積值F(488， 500-600)作為熒光強度，以所得到的不同pH值下的F(488, 500-600)和不同pH值作曲線，可以得到不同pH值下納米分子生物傳感器熒光強度變化曲線。如圖3所示。
本發(fā)明獲得的納米分子生物傳感器用于檢測農(nóng)藥甲基對硫磷的過程為
1) 將此種納米生物分子傳感器(成納米線融合蛋白)與MiniQ水按l:4混合得到檢測反應(yīng)液，納米生物傳器在檢測反應(yīng)液中的終濃度要保持在100-200ng/ml。取10(V1檢測反應(yīng)液到比色皿中，在熒光分光光度計選用激發(fā)波長488nm，讀取523nm處的峰高值作為熒光強度初始值，再將liil一個特定濃度的甲基對硫磷樣品加入到檢測反應(yīng)液中，反應(yīng)2-3min后同樣讀取523nni處的峰高作為樣品檢測熒光強度值，熒光強度減弱率=1-(熒光強度初始值-樣品檢測熒光強度值)/熒光強度初始值，如此按一定濃度梯度進行多個甲基對硫磷標準樣品的檢測，得到一系列熒光強度減弱率，以得到甲基對硫磷濃度-熒光強度減弱率的標準曲線。
2) 待測樣品通過有機溶劑萃取得到。同樣取100pl檢測反應(yīng)液到比色皿中，在熒光分光光度計選用激發(fā)波長488nm，讀取523nm處的峰高值作為熒光強度初始值。再加入lpl待測樣品反應(yīng)2-3分鐘后，在熒光分光光度計中選用激發(fā)波長488mn，讀取523ran處的峰高值作為樣品檢測熒光強度值。同步驟l)計算得到待測樣品的熒光強度減弱率，即可在標準曲線上找到相應(yīng)的甲基對硫磷濃度值，繼
11而達到檢測甲基對硫磷的目的。
為顯示本發(fā)明的優(yōu)點，申請人也構(gòu)建了未融合成線蛋白質(zhì)的普通分子傳感器(E2GFP-L-Mm)，通過與未成線的常規(guī)分子生物傳感器(E2GFP-L-Mm)的比較(圖4)，可見本發(fā)明公開的納米分子傳感器具有更高的檢測靈敏度，檢測限比未成線的常規(guī)分子生物傳感器低4個數(shù)量級。
權(quán)利要求
1、一種納米分子生物傳感器，它包括成線蛋白質(zhì)(1)、熒光蛋白質(zhì)(2)、酶(3)，其特征在于成線蛋白質(zhì)(1)為骨架，成線蛋白質(zhì)(1)與其融合的熒光蛋白質(zhì)(2)和酶(3)分布在骨架(1)的周圍，熒光蛋白質(zhì)(2)與骨架(1)連接，酶(3)與熒光蛋白質(zhì)(2)連接，或者酶(3)與骨架(1)連接，熒光蛋白質(zhì)(2)再與酶(3)連接。
2、 權(quán)利要求1所述的一種納米分子生物傳感器的制備方法，其步驟是1) 設(shè)計一條短肽鏈的基因，將對所檢測分子具有識別功能的酶分子基因與具 有pH值敏感的熒光蛋白基因e2gfp連接在一起，保證該基因e2gfp-1-e表達的融合 蛋白能正確折疊，保留其活性功能的完整性，并進一步與成線蛋白質(zhì)基因nanop 連接，得到納米分子傳感器的基因nan叩-e2gfp-1-e;2) 將構(gòu)建的納米分子傳感器基因nanop- e2gfp-1-e與蛋白質(zhì)表達載體連接， 轉(zhuǎn)入表達菌株中，表達納米分子傳感器單體蛋白質(zhì)NANOP-E2GFP-L-E;3) 表達的納米分子傳感器單體蛋白質(zhì)NANOP-E2GFP-L-E，經(jīng)過分離純化 后，所得融合蛋白單體在緩沖液和pHl-12條件下進行自組裝成納米線，成為最 終應(yīng)用的納米分子傳感器。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種納米分子生物傳感器的制備方法，其步驟是1) 使用的pH敏感熒光蛋白質(zhì)E2GFP是在表達載體pEGFP-Cl中EGFP的基礎(chǔ)上 突變了兩個位點得到，這兩個位點為T203Y， L231H，結(jié)構(gòu)基因長度為714bp,設(shè)計 引物E2gfp-A : 5， TCGCCCGGTGAGCAAGGGC 3，禾卩E2gfp-D : 5， AGTCCAAGCACAGCTCGTCCAT 3'將E2GFP基因通過PCR擴增得到，并使兩端 帶上Nde I和HindIII酶切位點，限制性內(nèi)切酶酶切得到酶切片斷；2) MPH基因來源自Pseudomonas sp.WBC-3 ，結(jié)構(gòu)基因長度為896bp， MPH 基因定位于Pseudomonas sp.WBC-3的質(zhì)粒上，通過堿裂解法得到質(zhì)粒，以得到 的質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物Mph-A: 5， ACTCTGATATCGCCGCCAGCA 3，和 Mph-D: 5' TCCCAGCTGGATGGGGTTGAC3，將MPH基因通過PCR擴增得 到，并使兩端帶上EcoRV和XhoI酶切位點，限制性內(nèi)切酶酶切得到酶切片斷；3) 設(shè) 計 兩 條 核 苷 酸 鏈 5'AGCTTAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGTGAT 3' 和 5， ATC ACCGGAACCGCTACCGAACC AGAGCCGCTA3 ，將這兩條核苷酸鏈在65 °C 下退火得到一條雙鏈核苷酸，兩端帶有HindIII和EcoRV酶切位點；4) 用限制性內(nèi)切酶Ndel和XhoI酶切質(zhì)粒pET20b (+)，得到內(nèi)切酶酶切得 到酶切片斷，將上述片斷通過連接酶連接在一起，連接條件為16'C，12小時，將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入^ c^iDH5a感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化子中獲得的正確陽性克隆子即為DH5a/ pET20b (+) -E2GFP-L-MPH菌株；5) 設(shè)計引物E2gfp-mph-A: 5， GGAGCCGAATTGTACGTGAGCAAGGGC 3， 和E2gfp-mph-D: 5， TGGTGCTCGAGAGTGTTGGGGTTGACGA 3'通過PCR從 以上得到的pET20b ( + ) -E2GFP-L-MPH質(zhì)粒上擴增出兩端帶有EcoRl和XhoI酶 切位點的E2GFP-L-MHi基因，并用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切得到酶切片斷；6) 所用到的Sup351—61基因來源自畢赤酵母的Sup35p基因，取其N區(qū)的前 183bp，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切pET28a-Sup351-61質(zhì)粒，得到內(nèi)切 酶酶切片斷，通過連接酶將E2GFP-L-MPH的酶切片斷和pET28a- Sup35"61酶 切片斷進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5a感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化子中獲得的正 確陽性克隆子即為含有質(zhì)粒pET28a-Sup351-61-E2GFP-L-MPH的DH5 a菌株；7) 在37。C下，將DH5a/ pET28a-Sup351—61-E2GFP-L-MPH接種至ljLB+卡那霉素培 養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，將該質(zhì)粒 pET28a-S叩351—61-E2GFP-L-MPH轉(zhuǎn)化到表達菌株A BL21 (DE3)制得的感受 態(tài)細胞中；8) 挑取BL21 (DE3) / pET28a-Sup351—6i-E2GFP_L-MPH轉(zhuǎn)化子到LB+卡那霉素培 養(yǎng)基中，37i:培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)得到的菌液按l/100的量接入新鮮LB+卡那霉素培 養(yǎng)基中，在37'C下進行擴大培養(yǎng)，菌液OD到達0.5-0.8時，加入IPTG誘導(dǎo)目的融 合蛋白進行表達，誘導(dǎo)表達溫度25-3(TC，誘導(dǎo)時間5-6小時；9) 通過離心收集菌體，將收集到的菌體重懸到磷酸鹽緩沖液中，通過超聲波 進行破碎，在4'C條件下，將破碎過后的溶液高速離心，取上清，獲得蛋白樣品；10) 蛋白質(zhì)的純化采取Ni離子親和層析，柱子用20mM咪唑，50raM NaH2P04-Na2HP04pH8. 0的緩沖溶液平衡，上樣后，用lOOmM咪唑，50rnM NaH2P04-Na2HP04， p朋.0,將目的蛋白洗脫下來，得到具有Sup351—61-E2GFP-L-MPH基因編碼的相對應(yīng)的融合蛋白質(zhì)單體；ll)融合蛋白蛋白質(zhì)單體稀釋到l-2mg/ml，與4'C下靜止過夜，組裝成納米線。
4、權(quán)利要求1所述的一種納米分子生物傳感器在檢測甲基對硫磷農(nóng)藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米分子生物傳感器及其制備方法。該傳感器的主要特點是采用成線蛋白質(zhì)將分子生物傳感器自組裝成納米分子傳感器，與未組裝的分子生物傳感器比較，極大地提高了檢測靈敏度。其制備利用蛋白質(zhì)融合技術(shù)，將具有自組裝功能的成納米線蛋白與作為生物識別元件的特定酶分子和作為換能器元件的熒光蛋白融合在一起，得到一種同時具有自組裝成納米線、識別和換能輸出信號的功能蛋白，該功能蛋白質(zhì)經(jīng)表達純化后，自組裝成納米分子生物傳感器，可以用于檢測各種臨床、環(huán)境樣品中的目標分子。本發(fā)明同時公開了使用該方法制備的納米分子生物傳感器在檢測農(nóng)藥甲基對硫磷中的應(yīng)用。
文檔編號C12M1/40GK101624568SQ20091006348
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者艷 冷, 危宏平, 尤祥宇, 張先恩, 張治平, 冬 門 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所