專利名稱：快速檢測(cè)杜氏利什曼原蟲的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人獸共患傳染病病原體的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速檢測(cè)杜氏利 什曼原蟲的熒光定量PCR試劑盒，適用于杜氏利什曼原蟲定性定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
黑熱病(Visceral Leishmaniasis, VL)是由杜氏利什曼原蟲引起的、以白蛉為傳 播媒介的人獸共患傳染病，臨床上以長(zhǎng)期不規(guī)則發(fā)熱、肝脾腫大、貧血以及外周血白 細(xì)胞減少為主要特征。近年來(lái)VL與結(jié)核病、艾滋病合并感染逐年增多。
中華白蛉是我國(guó)VL的主要媒介，分布極廣。 一般5月初開始出現(xiàn)， 一年只繁殖一 個(gè)世代，高峰多見于6月，僅個(gè)別地區(qū)在7、 8月會(huì)出現(xiàn)小高峰。按生態(tài)習(xí)性差異，我 國(guó)中華白蛉可分為2種不同類型平原地區(qū)主要是家棲型，嗜吸人血；而在山丘地區(qū) 則屬近野棲或野棲型，嗜吸各種牲畜和犬類的血液，兼吸人血，且能自體生殖。病犬 是VL主要的傳染源，在黑熱病的傳播起重要作用，通過(guò)禁止養(yǎng)犬和消滅犬源型VL是 防制黑熱病最有效的措施，但是實(shí)踐證明這些措施并不能從根本上消滅黑熱病。由于
其對(duì)人類健康及農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)存在很大的潛在危害，快速、準(zhǔn)確地診斷杜氏利什曼原蟲 病顯得十分重要。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，它可在PCR產(chǎn)物聚集 的時(shí)候檢測(cè)，即"實(shí)時(shí)"檢測(cè)，PCR反應(yīng)在指數(shù)擴(kuò)增范圍內(nèi)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的量。根據(jù)在 指數(shù)擴(kuò)增期的產(chǎn)物量來(lái)推算初始模板的量。方法操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)出率高，且兼具高敏感 性和可信的特異性。因此將熒光定量PCR應(yīng)用于杜氏利什曼原蟲定性定量檢測(cè)具有較強(qiáng) 的實(shí)用性和可行性，但國(guó)內(nèi)外還未見到有檢測(cè)杜氏利什曼原蟲的熒光定量檢測(cè)試劑和 上市。
臨床檢測(cè)上，傳統(tǒng)的病原學(xué)檢査方法具有檢出率不高、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等不足，傳統(tǒng)的 血清學(xué)方法由于簡(jiǎn)便、快速、敏感性尚佳，仍然是各實(shí)驗(yàn)室的常用方法，但血清學(xué)只 是感染的間接標(biāo)志，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，則很難獲得可供診斷的血清學(xué)結(jié)果。并且， 由于人群感染杜氏利什曼原蟲的普遍性，血清學(xué)檢測(cè)對(duì)現(xiàn)癥感染的診斷價(jià)值受到一定 限制。常規(guī)的PCR在操作中容易造成污染，假陽(yáng)性較高，使其在臨床診斷上受到一些限 制，因此急需一種精確、靈敏、快速、無(wú)污染的臨床檢驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種快速檢測(cè)利什曼原蟲 的熒光定量PCR試劑盒。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 一、PCR試劑盒
該試劑盒包括DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD-kDNA、 kDNA 基因特異性引物和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。具體地說(shuō)
(1) DNA提取液配制裂解緩沖液，包括如下組分0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 0.15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8. O)和1% 4% SDS。配制蛋白酶K的貯存 液，濃度為20mg/ml。提取組織或細(xì)胞基因組時(shí)現(xiàn)加蛋白酶K入裂解緩沖液體，終濃度 為4ng/ul，即為DNA提取液。
(2) 熒光定量PCR反應(yīng)液由SYBR-Green I，正反向引物kDNA-F和kDNA-R、 MgCl2、 dNTPs及無(wú)菌雙蒸水組成。
(3) 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD-kDNA:標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板杜氏利什曼原蟲pMD-k副A是含有杜 氏利什曼原蟲高度保守基因KDNA基因117個(gè)堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pMD-18重組質(zhì) 粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后用堿裂解法提取，用分光光度計(jì)測(cè)Aw。定量 并稀釋至1(T拷貝/P 1，使用前進(jìn)行IO倍梯度的系列稀釋。
(4 ) KDNA基因特異性引物序列正向引物kDNA-F:5 ' -CCTATTTTACACCAACCCCCAGT-3 ' ; 反向引物 kDNA-R: 為 5 ' -GGGTAGGGGCGTTCTGCGAAA-3'。
(5)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。
本試劑盒的工作原理
SYBR-Green I是一種常用的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，它巧妙地利用了 PCR技術(shù)高效擴(kuò) 增、光譜技術(shù)的敏感性及定量分析的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中熒光物質(zhì)強(qiáng)度的 變化來(lái)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分析。SYBR-Green I具有以下特點(diǎn)1)它能結(jié)合到雙鏈DNA的小 溝部位;2)它只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)出熒光;3)PCR反應(yīng)中的高溫變性時(shí)，DNA雙鏈 分開，無(wú)熒光:4) PCR反應(yīng)中的低溫復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA, SYBR-Green I發(fā)熒 光，此階段采集信號(hào)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的累積量呈比例關(guān)系。對(duì)杜氏利什曼 原蟲的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct, Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過(guò)程中，熒光量的積累超過(guò)基底熒光量的循環(huán)個(gè)數(shù)，Ct值與起始模板數(shù)呈一定比 例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性 梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起 始拷貝數(shù)。
本發(fā)明的使用方法包括以下步驟
(l)對(duì)貯存液濃度為1(T拷貝/u 1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD-kDNA進(jìn)行IO倍的系列稀釋， 制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；
(2 )從待測(cè)標(biāo)本中提取基因組DNA;
(3) 分別取步驟2中的DNA和同樣量的系列稀釋的步驟1中的兩種陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品加 入到熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；
(4) 通過(guò)比較待測(cè)樣品和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值Ct值，對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝 數(shù)進(jìn)行定量。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有定量準(zhǔn)確、檢測(cè)速度快，僅2小時(shí)、特異性好，靈敏度 高、使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好等特點(diǎn)。
總之，本發(fā)明可以杜氏利什曼原蟲樣品進(jìn)行定性定量檢測(cè)，可以替代傳統(tǒng)的病原 學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)方法。
以下實(shí)驗(yàn)表明試劑盒可以快速檢測(cè)利什曼原蟲
(1) 取新鮮或冰凍脾組織塊0. lg (0.5cm3)，盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加 入lml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入蛋白酶K
(500ug/ml) 20u 1，混勻。在65。C恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37。C水浴12
24 h，用酚-氯仿-異戊醇(酚氯仿異戊醇=25: 24: 1)抽提2次，無(wú)水乙醇沉淀
后用30u 1 TE (0. 1M Tris-HC1， lmM EDTA pH8. 0)溶解，取1 u 1做PCR反應(yīng)。
(2) 將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋為1(f拷貝/ul、 108拷貝/111、 K)7拷貝/ul、 106 拷貝/ul、 105拷貝/ui1。
(3) 分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各24y 1，取第①步所得利什曼原蟲DNA和第② 步稀釋的利什曼原蟲陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各1 Ul，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng) 管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為95。C預(yù)變性60s; 95°C 15 s ， 56°C 15 s ， 72°C 45 s ，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取待測(cè)樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為109拷貝"1、1。 8拷貝/u 1、 107拷貝/^ 1、 106拷貝/11 1的C t值分別為23.09， 23.69， 24.84， 26.40; 陰性對(duì)照為0 。
反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，得到Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析A0.05,數(shù)據(jù)差異無(wú)顯著意義，說(shuō) 明不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性和良好的重復(fù)性。
從上述實(shí)例可以說(shuō)明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且，熒光 定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品(DNA)的檢測(cè)僅需2個(gè)小時(shí)就能完成。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其積極效果在于具有定量準(zhǔn)確、檢測(cè)速度快，僅2小時(shí)、 特異性好，靈敏度高、使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，可以利什曼原蟲樣品進(jìn)行定性定 量檢測(cè)，可以替代傳統(tǒng)的病原學(xué)和血清學(xué)方法。


圖l:利什曼原蟲標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板109拷貝"1、 108拷貝"1、 K)7拷貝/Hl、 106拷
貝/iil、 1(f拷貝/u I不同稀釋度PCR擴(kuò)增結(jié)果。1為DL2000 Marker; 2 9分別為利 什曼原蟲標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板106拷貝/"1、 1()5拷貝/ul、 H)4拷貝/ul、 1()3拷貝/!il、 102 拷貝/ul、 10拷貝/ul、 l拷貝/ul、 0. l拷貝/yl為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2:質(zhì)粒pMD-kDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明
下列實(shí)例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法的，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克 等主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出 版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南，或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例l:試劑盒組成與配制
(1) DNA提取液配制裂解緩沖液，包括如下組分0.1 M Tris-HC1 (pH 8.0)， 0.1 0.15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8. O)和1% 4% SDS。配制蛋白酶K的貯存 液，濃度為20mg/ml。提取組織或細(xì)胞基因組時(shí)現(xiàn)加蛋白酶K入裂解緩沖液體，終濃度 為4ug/ul，即為DNA提取液。
(2) 熒光定量PCR反應(yīng)液配制反應(yīng)液SYBR-Green I (10X) 0. 5u 1， 10Xbuffer
2. 5ul， dNTP (2.5鵬ol/L) 2ul， Taq酶(5U/ul) 0. 2ul， MgCl2 (2. 5mmol/L) 3.5"1，正向引物和反向引物各lu 1 (10umol/L)，無(wú)菌雙蒸水14. 3ul。
(3) 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板貯存液濃度為1(T拷貝/ul標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD-kDNA。(4)陰性指控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。 實(shí)施例2:試劑盒的特異性試驗(yàn)
用經(jīng)過(guò)DNA有效性驗(yàn)證毛滴蟲、賈第蟲、微小隱孢子蟲、弓形蟲、柔嫩艾美爾球 蟲等5種對(duì)照陽(yáng)性樣品各1 U 1為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和陽(yáng) 性對(duì)照組。
PCR擴(kuò)增條件為循環(huán)條件為95。C預(yù)變性60 s ; 95°C 15 s ， 56°C 15 s ， 72°C 45 s ,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
結(jié)果只有利什曼原蟲檢測(cè)有擴(kuò)增曲線，而毛滴蟲、賈第蟲、微小隱孢子蟲、弓形 蟲、柔嫩艾美爾球蟲均無(wú)擴(kuò)增曲線。將利什曼原蟲經(jīng)三次重復(fù)，溶解曲線的溶解溫度 穩(wěn)定，說(shuō)明目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好；獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳， 均與目的條帶大小(117bp)相近。上述結(jié)果說(shuō)明試劑盒具有較好的特異性。 實(shí)施例3試劑盒的敏感性試驗(yàn)
首先將計(jì)數(shù)后的利什曼原蟲前鞭毛體DNA進(jìn)行稀釋，檢測(cè)其總DNA含量，采用倍 比法作10X， 100X， 1000X， 2000X， 4000X， 8000X稀釋利什曼原蟲DNA，各lul 為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。
PCR擴(kuò)增條件為循環(huán)條件為95。C預(yù)變性60 s ; 95°C 15 s ， 56°C 15 s ， 72°C 45 s ，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定試劑盒的敏感性，通過(guò)6個(gè)稀釋度的擴(kuò)增曲線，表明該熒光定 量PCR試劑盒最多能檢測(cè)到0. 5個(gè)利什曼原蟲。
權(quán)利要求
1、一種快速檢測(cè)杜氏利什曼原蟲的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于由DNA提取液，熒光定量PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板杜氏利什曼原蟲pMD-kDNA、杜氏利什曼原蟲kDNA基因特異性引物對(duì)、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；正向引物kDNA-F5′-CCTATTTTACACCAACCCCCAGT-3′；反向引物kDNA-R為5′-GGGTAGGGGCGTTCTGCGAAA-3′；標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD-kDNA含有杜氏利什曼原蟲高度保守基因的117個(gè)堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pMD-18重組載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是熒光定量PCR反應(yīng)液是熒光定量PCR反應(yīng)液由SYBR-Green I，正 反向引物kDNA-F和kDNA-R、 MgCl2、 dNTPs及無(wú)菌雙蒸水組成。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是杜氏利什曼原蟲標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性模板所包含的kDNA基因的核苷酸序列為5' -cctattttacacc犯cccctagtttcccgcctccgagcccaaa犯tggcaattttcggccaaa aa"tcgaacggggtttctgcacccatttttcg犯tttcgcagaacgcccctaccc-3'。
4、權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，包括以下步驟l)DNA提取液配制裂解緩沖液，包括如下組分0. lMTris-HC1(pH 8.0)， 0.1 0. 15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8.0)和1% 4%SDS。配制蛋白酶K的貯存液，濃度為20mg/ml。提取組織或細(xì)胞基因組時(shí)現(xiàn)加蛋白酶K入裂解緩沖液體，終濃度為4ug/ul，即為 DNA提取液。2)定量PCR反應(yīng)液包括由SYBR-Green I，正反向引物kDNA-F 和kDNA-R、 MgCl2、 dNTPs及無(wú)菌雙蒸水組成；3)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD-kDNA:標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板杜氏利什曼原蟲 pMD-kDNA:標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板杜氏利什曼原蟲pMD-kDNA是含有杜氏利什 曼原蟲高度保守基因KDNA基因117個(gè)堿基的核苷酸片段構(gòu)成的 pMD-18重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a增殖后用堿裂解法 提取，用分光光度計(jì)測(cè)A，定量并稀釋至1(T拷貝/ul，使用前進(jìn)行 IO倍梯度的系列稀釋。(4) 杜氏利什曼原蟲KDNA基因特異性引物序列正向引物kDNA-F:5' -CCTATTTTACACCAACCCCCAGT-3';反向引物 kDNA-R:為5' -GGGTAGGGGCGTTCTGCGAAA-3'。(5) 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)杜氏利什曼原蟲的熒光定量PCR試劑盒，涉及一種人獸共患傳染病病原體的基因檢測(cè)技術(shù)，適用于杜氏利什曼原蟲定性定量檢測(cè)。本發(fā)明由標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、熒光定量PCR反應(yīng)液、杜氏利什曼原蟲kDNA基因特異性引物、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成。本發(fā)明定量準(zhǔn)確，檢測(cè)速度快，特異性好，靈敏度高，使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，可以替代傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101613752SQ20091006702
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者全 劉, 商立民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所