專利名稱：一種快速檢測牛奶樣品中布魯氏菌的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種快速檢測牛奶樣品中布魯氏菌的PCR方法，用于檢測牛奶中布魯 氏菌或者布魯氏菌DNA，同時還提供了適應(yīng)上述方法的試劑盒。屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患傳染病，被世界動物衛(wèi)生組 織(OIE)列為B類動物疫病，是國際貿(mào)易檢疫中必檢的一種傳染病，我國將其列為 二類動物疫病。布魯氏菌包括6個種20個生物型，即羊種布魯氏菌(及/^/^"^ )生物 型1 3，牛種布魯氏菌(及Wom^)生物型1 9、豬種布魯氏菌CS.^W生物型1 5、綿 羊附睪種布魯氏菌(及ov"')、沙林鼠種布魯氏菌CS.neotowae)和犬種布魯氏菌CS.cam'》， 其中羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌是引起人、家畜和野生動物流產(chǎn)的 主要的病原菌，并且三者之間存在著宿主轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。人類通過食用未巴氏消毒的牛奶 及奶制品或直接與感染動物或尸體接觸而感染。臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱(波浪熱)、寒戰(zhàn)、 頭痛、全身疼痛、疲勞、腦神經(jīng)功能障礙癥狀、關(guān)節(jié)炎等非特異性癥狀。至今，布魯 氏菌病仍在我國部分地區(qū)流行，并時有疫情爆發(fā)的報道，直接危害人類的健康，嚴(yán)重 困擾畜牧業(yè)的發(fā)展和動物及其產(chǎn)品的進出口貿(mào)易。
目前，布魯氏菌病的診斷手段主要包括病原分離鑒定、虎紅平板凝集試驗(RBT)、 試管凝集試驗(SAT)和補體結(jié)合試驗(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、 PCR等， 用常規(guī)方法分離鑒定病原條件要求苛刻，且費力、費時、危險性高、成功率低。RBT 和SAT特異性不高、敏感性低；CFT操作繁瑣，實驗條件和技術(shù)水平要求高，實踐應(yīng) 用極為不便。PCR方法是這些方法中特異性最強、敏感性最高。在歐美的一些發(fā)達國 家已經(jīng)把PCR作為布魯氏菌病病原診斷的一種工具。國內(nèi)對于布魯氏菌病的檢疫診斷 還相對比較落后，國內(nèi)很多實驗室建設(shè)仍然還是空白，對該病的檢測仍然采用RBT、 SAT和CFT，遠不能滿足實際需要。因此，開發(fā)簡便易行、快速、靈敏、特異的分子 生物學(xué)技術(shù)已成為主要的發(fā)展趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種快速檢測牛奶樣品中布魯氏菌的PCR方法，適用于牛奶中布魯 氏菌定性檢測。本發(fā)明還進一步提供了適應(yīng)上述方法的試劑盒及其制備方法，用于檢測牛奶中的 布魯氏菌菌含量。
本發(fā)明的快速檢測牛奶樣品中布魯氏菌的PCR試劑盒，由DNA提取液、PCR反應(yīng)液、 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、布魯氏菌BCSP31基因特異性引物對和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品； 正向引物BF: 5'-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3' 反向引物BR: 5'-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC陽3'
標(biāo)準(zhǔn)陽性模板含有布魯氏菌高度保守基因的287個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的 pMD-18重組載體，該載體在大腸桿菌DH5a中增殖。
PCR反應(yīng)液由正反向引物BF和BR, 10xPCRBuffer(含Mg2+)，dNTPs及無菌雙蒸水組成。
布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列為 5'-atccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgctt gtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcat aatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcg ttgggagcgagctttgcggtt-3'
本發(fā)明所述的試劑盒的制備方法，包括以下步驟
1) DNA提取液包括如下組分10xTE (0.1 MTris-HCl ， 0.1MEDTA pH 8.8)， 5% NP-40和0.5。/。Tween-20;
2) PCR反應(yīng)液由正反向引物BF和BR， 10xPCRBuffer(含Mg2+)， dNTPs及無菌雙 蒸水組成；
3) 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板含有布魯氏菌高度保守基因BCSP31基因287個堿基的核苷酸片 段構(gòu)成的pMD-18重組質(zhì)粒；
4) 布魯氏菌BCSP31基因特異性引物序列
正向引物BF: 5 '-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3'; 反向引物BR: 5'-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC陽3';
5) 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。 本發(fā)明的使用方法包括以下步驟
取lmL牛奶樣品于2mL離心管中，從牛奶樣品中提取DNA;將DNA和陽性標(biāo) 準(zhǔn)品加入到PCR反應(yīng)液的反應(yīng)體系中，進行PCR檢測；取5pLPCR產(chǎn)物，以1%瓊脂 糖凝膠進行電泳檢查，在凝膠圖像分析儀上觀察287bp的擴增條帶。
5以下實驗表明試劑盒可以快速檢測布魯氏菌
(1) 取lmL牛奶樣品于2mL離心管中，力B 500pL 10xTE (0.1 M Tris-HCl ， 0.1 M EDTA PH8.8)，力n 100pL 5% NP-40和0.5%Tween-20。 98。C水浴30rnm， 13， 000r/m離心2min，取上清5pL，用于PCR擴增。
(2) 分別取PCR反應(yīng)液各45pL，取第(l)步所得布魯氏菌DNA和布魯氏菌陽性標(biāo)準(zhǔn) 模板各5pL，并設(shè)陰性對照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在PCR儀上平行做 PCR檢測。循環(huán)條件為95。C預(yù)變性5min， 94。C變性30sec、 62。C退火30sec、 72'C延伸30sec，擴增31個循環(huán)。
(3) 取5^LPCR產(chǎn)物，以1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢查，在凝膠圖像分析儀上觀察 287bp的擴增條帶。
反復(fù)重復(fù)試驗3次，所得檢測結(jié)果都相同，說明不同批次之間的檢測結(jié)果具有可 比性和良好的重復(fù)性。見圖1。
從上述實例可以說明，PCR方法重復(fù)性好，而且PCR檢測試劑盒對樣品(DNA) 的檢測僅需3個小時就能完成。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其積極效果在于該PCR檢測方法實用性強，可直接檢測 牛奶樣品中污染的布魯氏菌，3小時內(nèi)快速出結(jié)果、靈敏度高達0.16pg基因組，相當(dāng) 于11 16個細菌，裝配成試劑盒使用安全，特異性好，使用步驟簡單，可重復(fù)性好， 可以對牛奶樣品中的布魯氏菌進行定性檢測，可以替代傳統(tǒng)的病原學(xué)和血清學(xué)方法。


圖1為布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性模板PCR擴增圖中，1是100bp Ladder DNA marker, 2 5分別為牛種布魯氏菌544A 、牛種布 魯氏菌104M 、羊種布魯氏菌16M 、豬種布魯氏菌S2pMD-18重組質(zhì)粒的PCR擴增結(jié)果。
圖2為PCR試劑盒的特異性鑒定圖中，1是DL2000DNAMarker; 2是牛種布魯氏菌544APCR擴增結(jié)果、3是牛 種布魯氏菌104MPCR擴增結(jié)果、4是羊種布魯氏菌16MPCR擴增結(jié)果、5是豬種布
魯氏菌S2 PCR擴增結(jié)果；6是鼠傷寒沙門氏菌；7是金黃色葡萄球菌；8是銅綠假單 胞菌；9是豬鏈球菌；IO是大腸桿菌；ll是肺炎克雷伯氏菌；12是變形桿菌；13是多 殺性巴氏桿菌；14是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；15是蠟樣芽胞桿菌；16是豬胸膜肺炎放線
6桿菌血清1型；17是豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型；18是豬胸膜肺炎放線桿菌血清3型；19是豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型；20是大腸桿菌O157: H7; 21是純水對照。圖3為PCR試劑盒的敏感性鑒定圖中，1是DL2000DN A Marker; 2 10是倍比稀釋牛種布魯氏菌基因組PCR擴
增圖，2的濃度為1.6xl06pg; 3是1.6xl()5pg; 4是1.6xl()4pg; 5是1.6xl()3pg; 6是
1.6xl02pg; 7是1.6xl0'pg; 8是1.6pg; 9是1.6x10—、g; IO是陰性對照對照。
具體實施例方式
通過以下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實驗材料牛種布魯氏菌544A (A 544A)、牛種布魯氏菌104M (S. a6ort^
104M)、羊種布魯氏菌16M (及w^tew^ 16M)、豬種布魯氏菌S2 (5.她S2)滅活菌液由中國地方病第一研究所提供，限制性內(nèi)切酶、pMD18T克隆載體購自Takara公司，鼠傷寒沙門氏菌(CVCC541)、豬鏈球菌(CVCC606)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清l型(CVCC259)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型(CVCC260)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清3型(CVCC261)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型(CVCC263)均購自中國獸藥監(jiān)察所，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單胞菌
(ATCC27853)、大腸桿菌(ATCC35218)、蠟樣芽胞桿菌(CMCC(B)63301)、變形桿菌(CMCC (B) 45103)均購自由中國藥品生物制品檢定所，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌
(ATCC9610)由沈陽出入境檢驗檢疫局贈送，大腸桿菌0157:H7 (912981)由日本友人贈送，肺炎克雷伯氏菌(臨床分離株，豬)、多殺性巴氏桿菌(臨床分離株，豬)由本室保存。
實施例1:試劑盒組成與配制
1) DNA提取液包括如下組分10XTE (0. 1 MTris-HCl ， 0. 1 M EDTA PH8.8),5%NP-40和0.5%Tween-20。
2) PCR反應(yīng)液配制反應(yīng)液，10xPCR Buffer(含Mg2+) 10(xL、 dNTPs (2.5 mmol/L )5pL、正向引物和反向引物各2pL (10pmol/L)、 Taq酶(5U/pL) 0.5pL、無菌雙蒸水25.5pL;3) 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為含有布魯氏菌高度保守基因BCSP31基因287個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pMD-18重組質(zhì)粒。
4) 布魯氏菌BCSP31基因特異性引物序列
正向引物BF: 5'-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3';反向弓l物BR: 5'-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3'
5) 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。實施例2:
試劑盒的特異性試驗
用經(jīng)過DNA有效性驗證鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、豬鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、多殺性巴氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、蠟樣芽胞桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌血清l型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清3型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型、大腸桿菌0157: H7等15種對照，陽性樣品各5^L為模板進行PCR反應(yīng)，同時設(shè)陰性對照。
PCR擴增條件為循環(huán)條件為95。C預(yù)變性5min， 94'C變性30sec、 62'C退火30sec、72。C延伸30sec，擴增31個循環(huán)。
結(jié)果只有牛種布魯氏菌544A、牛種布魯氏菌104M、羊種布魯氏菌16M、豬種布魯氏菌S2擴增出287bp特異性目的片段，而鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、豬鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、多殺性巴氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、蠟樣芽胞桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌血清l型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清3型、豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型、大腸桿菌0157:H7和陰性對照無條帶(見圖2)。上述結(jié)果說明上述結(jié)果說明試劑盒具有較好的特異性。
實施例3
試劑盒的敏感性試驗
取20pL牛布魯氏菌544A基因組，稀釋10倍，用UV-2802H型紫外可見分光光度計測其濃度，然后倍比稀釋，以倍比稀釋的牛布魯氏菌544A基因組為模板，取5pL進行PCR反應(yīng)，同時設(shè)陰性對照。
PCR擴增條件為循環(huán)條件為95。C預(yù)變性5min， 94。C變性30sec、 62。C退火30sec、72"C延伸30sec，擴增31個循環(huán)。
通過實驗結(jié)果確定試劑盒的敏感性為0.16pg基因組(相當(dāng)于ll 16個細菌)(見圖3)序列表二
-atccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagcUtgcggtt-^
權(quán)利要求
1、一種快速檢測牛奶樣品中布魯氏菌的PCR試劑盒，其特征在于由DNA提取液、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、布魯氏菌BCSP31基因特異性引物對和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；正向引物BF5′-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3′反向引物BR5′-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3′標(biāo)準(zhǔn)陽性模板含有布魯氏菌高度保守基因的287個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pMD-18重組載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征是PCR反應(yīng)液由正反向引物BF和BR， 10xPCRBuffer(含Mg2+)，dNTPs及無菌雙蒸水組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列為5'-atccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgcggtt-3'。
4. 權(quán)利要求l所述的試劑盒的制備方法，包括以下步驟l)DNA提取液包括如下組分10xTE (0.1 MTris-HCl ， 0.1 MEDTA pH8.8)， 5% NP隱40和0,5o/oTween-20;2) PCR反應(yīng)液由正反向引物BF和BR， 10xPCRBuffer(含Mg2+)，dNTPs及無菌雙蒸水組成；3) 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板含有布魯氏菌高度保守基因BCSP31基因287個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pMD-18重組質(zhì)粒；4) 布魯氏菌BCSP31基因特異性引物序列正向引物BF: 5 '-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3';反向引物BR: 5'-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC陽3';5) 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測牛奶樣品中布魯氏菌的PCR方法，涉及一種人獸共患傳染病病原體的基因檢測技術(shù)，適用于布魯氏菌定性檢測。本發(fā)明由標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、PCR反應(yīng)液、布魯氏菌BCSP31基因特異性引物、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成。本發(fā)明檢測速度快，特異性好，靈敏度高，使用步驟簡單，可重復(fù)性高，可以替代傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101659995SQ20091006716
公開日2010年3月3日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者冮森林, 孫長江, 張俊梅, 李鐵峰, 杜崇濤, 杜濤峰, 王大力, 趙偉棟, 雷連成, 韓文瑜 申請人:吉林大學(xué)