專利名稱：一種大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域。
背景技術：
轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細菌，使之獲得新的遺傳性狀。這是現(xiàn)代分子生 物學最基本的操作技術。轉(zhuǎn)化效率直接影響前后試驗的進展和工作效率，而感受態(tài)細胞的 狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)化效率最直接、關鍵的因素之一。通常有兩種方法獲得感受態(tài)細胞，一種是購 于商業(yè)公司，這種感受態(tài)通常有較高的轉(zhuǎn)化效率，每微克質(zhì)粒DNA產(chǎn)生108個轉(zhuǎn)化克隆的轉(zhuǎn) 化效率，但價格比較昂貴。另一種方法是實驗室自己制備。目前常用的感受態(tài)細胞制備方 法有CaC12和RbCl/KCl法。RbCl/KCl法的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較高，但需要特殊的試劑 RbCl, CaC12法簡便易行，但轉(zhuǎn)化效率較低。除上述兩種方法外，還有制備超級感受態(tài)細胞 的Inoue法和電穿孔法，Inoue法細菌的培養(yǎng)條件是18°C，一般的實驗室很難達到。電穿孔 法要求電穿孔儀，一般實驗室不具有該設備。因而，研究一種轉(zhuǎn)化效率高，重復性好，操作簡 單適用于普通實驗室的感受態(tài)制備方法對與分子生物學的研究尤為必要，對分子克隆實驗 具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大腸桿菌感受態(tài)細胞(E. col !Competent Cells)的制 備方法，它是一種轉(zhuǎn)化效率高、方便、快捷、重復性好的感受態(tài)細胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的制備方法是1)材料LB液體培養(yǎng)基蛋白胨8-12，酵母膏4-6，NaCl 8_12，蒸餾水定容900-1100， PH7. 0,121°C滅菌20min。上述材料均為重量單位。新型制備液0. 06M-0. IM的氯化鈣溶液中PEG3350占體積比6_12%，甘油占體積 比10-15%，加超純水定容，121°C滅菌20min。2)方法預先將滅菌的離心管和新型制備液放入-20°C冰箱8-14小時，待制備感受態(tài)細胞 時備用。所有的操作均要在冰上執(zhí)行。取菌株分區(qū)劃線接種于LB平板，倒置37°C培養(yǎng)12-16小時；挑取單菌落接種于 5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床生長，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于200ml新鮮LB培養(yǎng)液中繼續(xù)生 長至菌液0D600為0. 3-0. 5 ；將菌液分裝于冰凍的離心管中冰浴5min，4°C，離心5min，回收 細胞；棄盡上清，將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液中，冰浴5min ；4°C離心5min ；棄 盡上清液將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液，于4°C離心5min ；棄盡上清液，加入預 冷的新型制備液重懸沉淀，分裝。本發(fā)明的有益效果是將氯化鈣，甘油，PEG3350有機的按照一定的比例混在一 起，制備感受態(tài)細胞，獲得了較高的轉(zhuǎn)化率，對分子克隆實驗意義重大。該方法操作簡單，重復性好，轉(zhuǎn)化效率高，不但能滿足常規(guī)的分子實驗要求，還能夠滿足構建文庫等復雜實驗對 轉(zhuǎn)化效率的要求，是一項較為實用的新技術，具有極高的應用價值。表1三種方法制備感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率比較
權利要求
一種大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法，其制備方法是a、材料LB液體培養(yǎng)基蛋白胨8 12，酵母膏4 6，NaCl 8 12，蒸餾水定容900 1100，PH7.0，121℃滅菌20min；上述材料均為重量單位；新型制備液0.06M 0.1M的氯化鈣溶液中PEG3350占體積比6 12％，甘油占體積比10 15％，加超純水定容，121℃滅菌20min；b、方法預先將滅菌的離心管和新型制備液放入 20℃冰箱8 14小時，待制備感受態(tài)細胞時備用，所有的操作均要在冰上執(zhí)行；取菌株分區(qū)劃線接種于LB平板，倒置37℃培養(yǎng)12 16小時；挑取單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床生長，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于200ml新鮮LB培養(yǎng)液中繼續(xù)生長至菌液OD600為0.3 0.5；將菌液分裝于冰凍的離心管中冰浴5min，4℃，離心5min，回收細胞；棄盡上清，將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液中，冰浴5min；4℃離心5min；棄盡上清液，將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液，于4℃離心5min；棄盡上清液，加入預冷的新型制備液重懸沉淀，分裝。
全文摘要
一種大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法，屬于微生物技術領域，其制備方法是將離心管和新型制備液放入-20℃8-14小時，取菌株接種于LB平板，倒置37℃培養(yǎng)12-16小時；挑取單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床生長，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于200ml新鮮LB培養(yǎng)液中繼續(xù)生長至菌液OD600為0.3-0.5；將菌液分裝于冰凍的離心管中冰浴5min，4℃，離心5min，回收細胞；棄盡上清液，加入預冷的新型制備液重懸沉淀分裝。有益效果是獲得了較高的轉(zhuǎn)化率，對分子克隆實驗意義重大。該方法操作簡單，重復性好，轉(zhuǎn)化效率高，具有極高的應用價值。
文檔編號C12R1/19GK101993830SQ20091006745
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權日2009年8月28日
發(fā)明者劉基偉, 吳健, 張國梁, 張鵬舉, 李旭, 胡成華 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學院