專利名稱：：人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白制備方法及其在防治奶牛乳房炎中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開一種人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白，同時(shí)還提供了其基因工程制備方法，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該融合蛋白生物制劑在防治奶牛乳房炎中的應(yīng)用，屬于獸醫(yī)學(xué)生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：奶牛乳房炎是奶牛最常見、防治最難、花費(fèi)最多的疾病之一，給奶牛業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。嚴(yán)重影響牛奶的品質(zhì)，間接影響人體健康，給奶牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前常用的治療奶牛乳房炎的藥物為抗生素，如環(huán)丙沙星、青霉素等，但是由于抗生素長期使用造成了嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，近幾年凝固酶陰性葡萄球菌的比例上升，其中葡萄球菌的耐藥率達(dá)90%以上，直接導(dǎo)致乳房炎的治療效果顯著下降。同時(shí)，抗生素在乳中殘留嚴(yán)重危害人類健康，如果用含抗生素的奶做酸奶或奶酪等，則殘留在其中的抗生素會抑制細(xì)菌的發(fā)酵，使產(chǎn)量和質(zhì)量降低。我國食品衛(wèi)生法規(guī)定，在應(yīng)用抗生素期間和停藥后5天內(nèi)的乳不能食用。因此，抗生素的療效越來越差，應(yīng)用范圍也受到很大限制。本發(fā)明涉及的人溶菌酶是人體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，和人體具有天然相容性，在臨床上應(yīng)用時(shí)，比其它溶菌酶更安全，且沒有刺激性和副作用?？咕挠纸锌刮⑸镫模遣溉閯游锓烙到y(tǒng)的一個重要組成部分，具有熱穩(wěn)定性好，水溶性好，廣譜殺菌的特點(diǎn)，對較大的離子強(qiáng)度和較低或較高的PH值都有較強(qiáng)的抗性。近年來雖然有報(bào)道克隆人溶菌酶基因進(jìn)行基因工程表達(dá)及探討轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人溶菌酶的研究，也有報(bào)道有關(guān)抗菌肽基因以及與其它相關(guān)基因融合的克隆和表達(dá)，但未見將人溶菌酶和抗菌肽融合表達(dá)產(chǎn)物用于治療奶牛乳房炎的研究，也沒有和本項(xiàng)目相關(guān)內(nèi)容的專利公開。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開一種人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，為一種新的融合蛋白。本發(fā)明還提供了該融合蛋白的制備方法，采用基因工程方法生產(chǎn)生物制劑。本發(fā)明進(jìn)一步公開了該融合蛋白在制備治療奶牛乳房炎藥物中的用途。本發(fā)明的人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，其特征在于它是由人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-l在基因水平融合后表達(dá)的重組蛋白所述的人溶菌酶氨基酸序列如SEQ1DN0.1所示，抗菌肽氨基酸序列為SEQ1DNa2序列所示，連接肽氨基酸序列為SEQ1DN0.3序列所示，人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白氨基酸序列為SEQ1DN0.4所示，人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白通過人溶菌酶-15個柔性氨基酸的連接肽-抗菌肽Catesbeianin-l的方式連接。本發(fā)明人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白的制備方法包括以下歩驟1、從人胎盤組織中克隆人溶菌酶基因至pMD18T載體，通過設(shè)計(jì)引物PCR,獲得人溶菌酶基因；2、釆用人工合成方法獲得抗菌肽Catesbeianin-l基因以及連接肽基因；3、通過酶切連接的方法把人溶菌酶基因，連接肽基因和抗菌肽Catesbeianin-l基因連接，得到人溶菌酶-連接肽-抗菌肽Catesbeianin-l基因；4、人溶菌酶-連接肽-抗菌肽Catesbeianin-l基因與經(jīng)過EcoRl和Xbal1雙酶切的pPICZaA載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，通過PCR和雙酶切鑒定，篩選陽性克隆送至上海生物工程測序；5、將測序正確的重組質(zhì)粒pPICZaA-hlyz-linker-Catesbeianin-l電轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌GS115中，通過Zeocin抗生素的篩選獲得高效酵母表達(dá)菌株；6、挑取陽性酵母菌甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，收獲表達(dá)上清，經(jīng)SDS-PAGE和western-blot鑒定，獲得人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白。以下實(shí)驗(yàn)表明人溶菌酶-Catesbeianin-l抗菌肽融合蛋白(簡稱rhlyz-Catesbeianin-1)對乳房炎的治療效果實(shí)驗(yàn)例lrhlyz-Catesbeianin-1對試驗(yàn)性小鼠乳房炎治療l.實(shí)驗(yàn)動物與分組方法50只40日齡健康昆明系小白鼠(購自長春高新實(shí)驗(yàn)動物中心)，體重40士2g，沒有配種經(jīng)歷。飼喂市售飼料，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將50只昆明小鼠隨機(jī)抽取IO只設(shè)為空白組(n=10，不作任何處理)，將另40只小鼠隨機(jī)分成2個菌組，每組20只，分別為金黃色葡萄球菌組、大腸桿菌組；再將每個菌組的20只小鼠隨機(jī)分成對照組(Con)11=10和實(shí)驗(yàn)組(T)n=10。對照組為注射生理鹽水組，實(shí)驗(yàn)組為注射rhlyz-Catesbeianin-1組。42.菌種金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)室從長春地區(qū)患臨床乳房炎奶牛的乳汁中經(jīng)分離鑒定凍干保存的地方菌株。3.乳腺基部注射法將每一實(shí)驗(yàn)組的20只小鼠進(jìn)行乳腺基部注射，細(xì)菌接種方法如下左手將小鼠仰面固定，用75%酒精棉球?qū)Φ谒膶θ橄偌爸車つw進(jìn)行消毒，將稀釋好的細(xì)菌懸液從第四對乳腺的乳房基部小角度插入，輕挑針尖至乳頭正下方，邊退出邊注射，注射0.05mL菌懸液，感到稍有阻力則表示已注入乳房內(nèi)，記錄注射時(shí)間。24h后，同菌組中，任選10只發(fā)病小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，在第四對乳腺分別注射2MIC質(zhì)量濃度的rhlyz-Catesbeianin-l蛋白0.05mL，每隔四小時(shí)注射一次，共注射3次，另10只作為對照組，在第四對乳腺注射相同劑量的生理鹽水，注射方法同上，從第一次注射算起24h后剖殺。4測定指標(biāo)及方法4丄臨床癥狀變化剖殺前，對照組小鼠精神沉郁，被毛蓬亂，活動較少，不斷舔拭腹部，實(shí)驗(yàn)組和空白組小鼠臨床癥狀不明顯，活動較正常。4.2剖檢變化空白組(不接菌不治療)乳腺組織粘膜潮紅色，乳腺組織支持血管較細(xì)。對照組(接菌不治療)病變較明顯，四種細(xì)菌接種組乳腺組織均有腫大，變硬,出血，支持乳腺組織的血管變粗，程度稍有不同，金黃色葡萄球菌組病變較明顯，出血較嚴(yán)重，大腸桿菌組次之。實(shí)驗(yàn)組(接菌治療)未見明顯病理變化。4.3.病理切片結(jié)果對照組金黃色葡萄球菌組和大腸桿菌組乳腺組織結(jié)構(gòu)崩塌，間質(zhì)變寬，不可辨認(rèn)，大量炎性細(xì)胞浸潤在乳腺小葉間質(zhì)、腺泡間、腺泡腔內(nèi)及血管周圍。實(shí)驗(yàn)組乳腺組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，炎性細(xì)胞減少。空白組無異常。如圖3所示。4.4免疫組化檢測rhlyz-Catesbeianin-l融合蛋白采集小鼠乳腺組織制作石蠟切片，用兔抗人溶菌酶多克隆抗體作為第一抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG為第二抗體、使用SP試劑盒、DAB發(fā)色對切片進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果表明在注射rhlyz-Catesbeianin-l融合蛋白的小鼠乳腺上皮細(xì)胞明顯著色，表明注射rhlyz-Catesbeianin-l融合蛋白的小鼠乳腺上皮細(xì)胞中有大量融合蛋白存在，正常小鼠染色結(jié)果中也有輕微著色，原因?yàn)樾∈笞陨矸置谌橹屑春形⒘咳芫浮Ｈ鐖D4所示。4.5乳腺組織研磨液平板培養(yǎng)結(jié)果將乳腺組織研磨液稀釋103倍后，接種，并標(biāo)記對應(yīng)的小數(shù)組別及分組，在37'C培養(yǎng)18-24h后計(jì)數(shù)活菌數(shù)，對照組乳腺組織研磨液培養(yǎng)物中均有菌落長出，實(shí)驗(yàn)組中有部分乳腺組織研磨液培養(yǎng)物中有菌落長出。根據(jù)乳腺組織研磨液培養(yǎng)物的接種結(jié)果可推算出融合蛋白相對應(yīng)各菌組的治愈率，金黃色葡萄球菌性乳腺炎的治愈率為80%，大腸桿菌組乳腺炎的治愈率為60%。實(shí)驗(yàn)例2rhlyz-Catesbeianin-l對奶牛乳房炎治療1、試驗(yàn)動物吉林省吉林市某奶牛場泌乳期黑白花奶牛。2、實(shí)驗(yàn)試劑與藥品CMT奶牛隱性乳房炎診斷試劑配制稱取十二烷基磺酸鈉4g，氫氧化鈉1.5g，溴甲酚紫0.01g于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，室溫保存。青霉素和鏈霉素注射液，乳炎消，江蘇長青獸藥有限公司生產(chǎn)，純度為90。/。的rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白。3、對隱性乳房炎的治療經(jīng)CMT檢測反應(yīng)判為+十+的奶牛分成三組，每組5頭奶牛。第一組乳池內(nèi)注射20毫克rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白，第二組乳池內(nèi)注射100萬單位青霉素和25萬單位鏈霉素，第三組乳池內(nèi)注射15毫升中藥乳炎消，每天注射1次，共注射3次。以CMT反應(yīng)下降l個以上+號為判斷依據(jù)，用藥一周后四個治療組的有效率分別為4/5、5/5和3/5，十天后的有效率分別為3/5、3/5和2/5;三個治療組乳汁的細(xì)菌總數(shù)、金黃色葡萄球菌數(shù)、鏈球菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均較治療前有明顯下降;在治療期間的7天內(nèi)，四個治療組的平均產(chǎn)奶量分別較治療前增加2.73、2.91和1.93公斤/頭/天；在隨后的7天內(nèi)，四個治療組的平均產(chǎn)奶量分別較治療前增加2.79、2.91禾口0.30公斤/頭/天。試驗(yàn)結(jié)果表明，人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白治療奶牛乳房炎的效果與抗生素合劑接近。4、經(jīng)抗生素治療無效的乳房炎的治療選擇臨床常用抗生素(青霉素治療一周)治療無效的乳房炎乳區(qū)10個，乳池內(nèi)注射rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白40毫升(40毫克)，每天注射1次，共注射3次。結(jié)果在注射后第七天時(shí)，除2個乳區(qū)的臨床癥狀無改善外，其余乳區(qū)的臨床表現(xiàn)均有不同程度的減輕，包括紅、腫、熱、痛消失，乳汁顏色及PH恢復(fù)正常，CMT檢測結(jié)果顯示，治療有效率為40%(4/10)。試驗(yàn)結(jié)果表明，人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白對經(jīng)抗生素治療無效的頑固性乳房炎也有一定的治療效果。本發(fā)明的積極效果在于通過基因重組方式以融合蛋白的形式將人溶菌酶和抗菌肽Catesbeianin-l基因連接至高效真核表達(dá)載體上，進(jìn)一步增強(qiáng)融合蛋白的抗菌和抗病毒活性，得到具有更高活性的抗菌和抗病毒的重組蛋白，并將此融合蛋白在防治奶牛乳房炎中應(yīng)用，開發(fā)一種無化藥殘留，無抗生素殘留和低耐藥性的防治奶牛乳房炎的新型藥物。圖1為重組質(zhì)粒pPICZaA-hlyz-linker-Catesbeianin-l的構(gòu)建流程圖2為融合蛋白抑菌效果圖l.金黃色葡萄球菌；2.沙門氏菌；3.大腸桿菌；4.枯草芽胞桿菌；5.鏈球菌；6.白色念珠菌；圖3為小鼠乳腺病理切片圖1.正常小鼠乳腺圖2.攻毒小鼠乳腺圖3.經(jīng)融合蛋白治療后小鼠乳房炎；圖4為小鼠乳腺免疫組化圖l.正常小鼠乳房圖；2.注射融合蛋白小鼠乳房圖；圖5為融合蛋白的免疫印跡分析1陰性對照；2.人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品；3.融合蛋白；M低分子量蛋白Maker具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例rhlyz-Catesbdanin-l融合蛋白的制備l.引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genebank上發(fā)表的人溶菌酶基因序列(NC-000012.10)和抗菌肽基因序列設(shè)計(jì)引物Pl、P2、Cl、C2、T1和T2，設(shè)計(jì)15個柔性氨基酸Linker把人溶菌酶基因與抗菌肽Catesbeianin-l基因串連。所有引物由上海生物工程公司合成，引物序列如下人溶菌酶上游引物P,.5'-CGSMnSATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG-3'(引入￡coRI酶切位點(diǎn))人溶菌酶下游引物P2:5'-TTGCGGCCGCCACTCCACAACCTTGAACA-3'(引入WWI酶切位點(diǎn))Catesbeianin-l上游引物C1:5'-TCGGAAAAGGAGAGAAG-3'Catesbeianin-1下游引物C2:5'-GTAGGAATGTCACAGTAACG-3'特異性上游引物Tl:5'-GAAGGTCTTTGAAAGGTG-3'特異性下游引物T2:5'-CAATCAATACTGTATAATCCAA-3'2.人溶菌酶基因的克隆從人胎盤組織中提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，根據(jù)人溶菌酶基因序列(NC-000012.10)設(shè)計(jì)合成引物P1和P2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR循環(huán)參數(shù)94。C預(yù)變性lmin;94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個循環(huán)，72'C延伸8min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳)，回收PCR產(chǎn)物與PMD-18T載體在T4連接酶作用下連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，a-互補(bǔ)(藍(lán)/白斑篩選法)進(jìn)行陽性克隆的初步篩選，白斑初歩確定為陽性菌株，挑取單克隆鑒定，把PCR和酶切鑒定正確的單菌落送至上海生物工程公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GeneBank中的序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與已發(fā)表的人溶菌酶序列完全一致。3.融合基因的設(shè)計(jì)與合成人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白是以人溶菌酶-連接肽-抗菌肽Catesbeianin-l的方式連接，因此人溶菌酶基因在前，抗菌肽Catesbeianin-l基因在后，見SEQ1DN0.5。4.重組質(zhì)粒pPICZaA-hlyz-Catesbeianin-l的構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZaA-hlyz-Catesbeianin-l的構(gòu)建流程，見圖1。5.GS115-hlyz-Catesbeianin-1工程菌的篩選用SacI酶切pPICZaA-hlyz-linker-Catesbeianin-l質(zhì)粒，回收線性化片段，于電轉(zhuǎn)化杯中與冰預(yù)冷的感受態(tài)酵母菌GS115混勻，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化杯與ECM399電轉(zhuǎn)化儀均為美國BTXTM公司產(chǎn)品)，電轉(zhuǎn)條件270v，llms，轉(zhuǎn)化酵母菌液均勻涂布于YPDS平板(含200嗎/mL的Zeocin)，2830。C靜置培養(yǎng)310d，直至轉(zhuǎn)化菌落出現(xiàn)。參照酵母基因組提取試劑盒提取基因組DNA，經(jīng)酵母通用引物(5'A0X1和3'A0X1引物上游引物5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，下游引物5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3，)和特異性引物Tl和T2進(jìn)行PCR檢測(循環(huán)參數(shù)94X:預(yù)變性lmin;94。C變性30s，5(TC退火30s，72。C延伸lmin，30個循環(huán)，72'C延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳)人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-l基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到畢赤酵母染色體上。6.rhlyz-Catesbeianin-l融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將一陽性菌落接種于5mL的YPD中，3(TC培養(yǎng)1618h。4000r/min離心10min收集菌體，用50mL的BMGY培養(yǎng)基重懸菌體，30°C、250r/min培養(yǎng)。當(dāng)菌體濃度達(dá)到OD600為26時(shí)，4000r/min離心10min收集菌體，用50mL的BMMY培養(yǎng)基重懸沉淀，在培養(yǎng)瓶瓶口加蓋4層紗布，于28。C、250r/min培養(yǎng)56-84小時(shí)。在培養(yǎng)的過程中，每隔24h加入一次100%甲醇至終濃度為1.0%。84h以后，4°C、5000r/min離心10min回收上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)做對照。電泳結(jié)束后，以50mA恒流、室溫下lh將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜以5y。脫脂奶粉封閉過夜，經(jīng)pH7.4、0.02mol/LPBS漂洗3次后，加入l:100稀釋的兔抗人hlyz多抗，室溫反應(yīng)lh(或4。C過夜)，PBS漂洗3次，再與羊抗兔的二抗反應(yīng)lh后充分洗滌進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。經(jīng)western-blot鑒定證實(shí)為人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白，見圖5。7.rhlyz-Catesbeianin-l融合蛋白的純化凝膠層析稱取5gSephadexG-IOO，置于250ml的燒杯中，用O.Olmol，pH值為7.0的PBS緩沖液在沸水浴中溶脹3h，充分溶脹后，倒出上層多余的水分和細(xì)小懸浮的顆粒。將處理好的SephadexG-100裝入柱子中，不要產(chǎn)生氣泡，裝好后，接通洗脫瓶，打開下口，洗脫6h，平衡凝膠柱，調(diào)整恒流泵流速0.500.70mL/min。將收集的樣品分別測定OD280值，并根據(jù)OD值作圖，然后根據(jù)圖形波峰波谷的情況，將樣品分為幾部分。反相高效液相色譜(RP-HPLC):連接高效液相A、B液體，A為超純水(含0.1X三氟乙酸)，B為乙腈(含0.1X三氟乙酸)，設(shè)置程序，時(shí)間和B液的濃度如表1。重復(fù)沖洗針頭和系統(tǒng)23次。先設(shè)定程序并上樣，根據(jù)峰型調(diào)整程序。手動收集樣品，作好標(biāo)記。合并后凍干。表1反相髙效液相色譜程序設(shè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>8.rhlyz-Catesbeianin-l融合蛋白理化性質(zhì)鑒定8丄抗菌活性測定平板擴(kuò)散法測定rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白的抑菌活性37'C培養(yǎng)16h后結(jié)果對臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、枯草芽胞桿菌、白色念株菌等耐藥菌有抑制作用，見圖2。二倍稀釋法測定rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白的MIC(最小抑菌濃度)和MBC(最小殺菌濃度)，見表2。酵母表達(dá)的人溶菌酶做對照，證明rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白具有天然人溶菌酶和抗菌肽屬性。表2rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋A的最小抑齒濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注ND表示沒有作用8.2.最適反應(yīng)溫度選取25。C，30°C，35°C，37°C，39°C，40°C，45'C不同溫度條件，測定酶活性，結(jié)果表明，酶的最適反應(yīng)溫度為37'C。8.3.最適PH值選擇磷酸緩沖液配制底物溶液，濃度為0.2mg/ml，其它條件不變，測定酶活力。結(jié)果表明，rhLYZ-Catesbeianin-l在磷酸緩沖液中的最適反應(yīng)PH值為8。8.4.熱穩(wěn)定性將等量rhLYZ-Catesbeianin-l分別置于35。C，40°C，45°C，50°C，55°C，60°C，65°C不同溫度下30min，冷卻后于37'C按常規(guī)方法測定酶活性，結(jié)果表明，rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白在50°C之前熱穩(wěn)定性良好。8.5.酶的米氏常數(shù)以M,'cracoccw/^^fe汰^船為酶的底物，分別酉50.1，0.2，0.3,0.4，0.5mg/ml的濃度，測定酶活力，用雙倒數(shù)法，得到KnvO.04845mg/m1.8.6.金屬離子對酶活性的影響選取不同金屬離子分別加入rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白溶液，終濃度為0.1mg/ml測定其活力，結(jié)果表明，Cu2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，(^2+等金屬離子都對酶活力有影響，其中012+能夠使酶活力全部喪失，見表3。表3金屬離子對融合蛋白酶活力的影響金屬離子無離子Cu2+Fe3+Fe2+Ni+Mn2+Ca2+Co+Zn2+相對酶活力100026.743.172.375.067.869.442.59.安全性檢驗(yàn)9.1小鼠實(shí)驗(yàn)用500微克溶解在500毫升生理鹽水中的rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白肌肉注射實(shí)驗(yàn)小鼠(昆明小鼠IO只，1822g),注射后連續(xù)觀察710天，IO只小鼠未出現(xiàn)不良反應(yīng)和死亡現(xiàn)象；9.2犢牛實(shí)驗(yàn)用25毫克溶解在生理鹽水中的rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白肌肉注射初生犢牛注射后連續(xù)觀察5天，5頭犢牛未出現(xiàn)體溫升高和異常臨床表現(xiàn)；9.3奶牛實(shí)驗(yàn)將50毫克溶解在生理鹽水中的rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白注射入患乳腺炎奶牛乳腺注射后連續(xù)觀察1周，4個乳區(qū)未出現(xiàn)異常臨床表現(xiàn)。9.4藥物殘留實(shí)驗(yàn)取rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白治療后牛乳進(jìn)行藥物殘留檢測，結(jié)果僅在注射后第2天PCR檢測為陽性。用300微克rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白灌喂小鼠，然后用電泳和PCR擴(kuò)增法檢測消化道內(nèi)降解動態(tài)，在小鼠的胃內(nèi)，rhLYZ-Catesbeianin-l融合蛋白20分鐘內(nèi)即完全降解。12序列表SEQIDNO.l人溶菌酶氨基酸序列MKVFERCELARTLKRLGMDGYSGISLAN麗CLAKWESGYNTRAVSEQIDNO.2抗菌肽Catesbeianin-l氨基酸序列MMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSID,SEQIDNO.3連接肽序歹ij:GGGGSGGGGSGGGGSSEQIDNO.4人溶菌酶-抗菌肽Catesbdanin-1融合蛋白氨基酸序列MKVFERCELARTLKRLGMDGYSGISLANWMCLAKWESGYNTRAVAAAG^GG^GGGG^GGGGSMMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSID共175個氨基酸，分子量MW17888.65等電點(diǎn)PI9.39,黑斜體為15個柔性氨基酸linkerSEQIDNO.5人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-l核苷酸序列(537bp)GAATTCATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGGCTACAGTGGAATCAGCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTTGTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTGGCGGCCGCTGGrGC7/4GGCGGrrC4GGTGGCTCTCGCGGT(GCGa4rC(7ATGATGAGGGTGATGAGGAGGAAGACTAAAGTTATTTGGGAAAAAAAGGACTTTATTGGATTATACAGTATTGATTGATCTAGA黑斜體linker,酶切位點(diǎn):￡coWI(GAATTC),NotI(GCGGCCGC)，X&aI(TCTAGA)權(quán)利要求1、一種人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白，其特征在于它是由人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-1在基因水平融合后表達(dá)的重組蛋白所述的人溶菌酶氨基酸序列如SEQ1DNO.1所示，抗菌肽氨基酸序列為SEQ1DNO.2序列所示，連接肽氨基酸序列為SEQ1DNO.3序列所示，人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白氨基酸序列為SEQ1DNO.4所示，人溶菌酶與抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白通過人溶菌酶-15個柔性氨基酸的連接肽-抗菌肽Catesbeianin-1的方式連接。2、權(quán)利要求l所述融合蛋白的制備方法，包括以下歩驟1)從人胎盤組織中克隆人溶菌酶基因至pMD18T載體，通過設(shè)計(jì)引物PCR，獲得人溶菌酶基因；2)采用人工合成方法獲得抗菌肽Catesbeianin-l基因以及連接肽基因；3)通過酶切連接的方法把人溶菌酶基因，連接肽基因和抗菌肽Catesbeianin-l基因連接，得到人溶菌酶-連接肽-抗菌肽Catesbeianin-l基因；4)人溶菌酶-連接肽-抗菌肽Catesbeianin-l基因與經(jīng)過EcoRl和Xbal1雙酶切的pPICZaA載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，通過PCR和雙酶切鑒定，篩選陽性克隆測序；5)將測序正確的重組質(zhì)粒pPICZaA-hlyz-linker-Catesbeianin-1電轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌GS115中，通過Zeocin抗生素的篩選獲得高效酵母表達(dá)菌株；6)挑取陽性酵母菌甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，收獲表達(dá)上清，經(jīng)SDS-PAGE和western-blot鑒定，獲得人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-l融合蛋白。3、權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備治療奶牛乳房炎藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開一種人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白，同時(shí)還提供了其基因工程制備方法，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該融合蛋白生物制劑在防治奶牛乳房炎中的應(yīng)用，通過基因重組方式以融合蛋白的形式將人溶菌酶和抗菌肽Catesbeianin-1基因連接至高效真核表達(dá)載體上，進(jìn)一步增強(qiáng)融合蛋白的抗菌和抗病毒活性，得到具有更高活性的抗菌和抗病毒的重組蛋白，并將此融合蛋白在防治奶牛乳房炎中應(yīng)用，開發(fā)一種無化藥殘留，無抗生素殘留和低耐藥性的防治奶牛乳房炎的新型藥物。文檔編號C12N9/96GK101649311SQ200910067530公開日2010年2月17日申請日期2009年9月15日優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日發(fā)明者爽呂,杜崇濤,歐陽萍,江麗娜,雷連成,韓文瑜申請人:吉林大學(xué)