專利名稱：一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，基因治療將在人類攻克 腫瘤這一頑癥的過程中占據(jù)重要地位，并將逐步成為一種常見治療手段(1)?；蛑委熓?指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷 或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)(2)?；蛑委煵粌H可以治 療腫瘤，還可以治療那些對人類健康威脅嚴(yán)重的疾病，包括遺傳病(如血友病、囊性 纖維病、家庭性高膽固醇血癥等)、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、類 風(fēng)濕等)。近年來國內(nèi)外對多種疾病致病基因的研究發(fā)展迅速，為基因治療發(fā)展提供了堅(jiān) 實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)條件，使基因治療有望成為攻克人類頑疾的“利器”之一。將基因物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)是實(shí)現(xiàn)基因治療的必須步驟，成功的基因治療依 賴于有效的基因載體。利用病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是基因治療中應(yīng)用最廣泛的方法，其 中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病 毒(VV)等載體。但是病毒類載體在臨床應(yīng)用中存在著很大的安全隱患(3)，已經(jīng)引起 了多起醫(yī)療事故。非病毒類載體因其安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已成為病毒類載 體最有希望的替代者。陽離子聚合物是非病毒基因載體中受到關(guān)注較多的一類載體。 目前廣泛應(yīng)用的陽離子聚合物基因載體有聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、殼聚糖等(4-8)。 這些載體雖然比病毒類的基因載體安全，但是仍然存在轉(zhuǎn)染效率低、細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn) (9-10)。開發(fā)出低毒性和高效率的基因載體已經(jīng)成為基因治療發(fā)展迫切需要解決的問 題。近年來，納米級(jí)金屬材料特別是貴金屬納米材料，特別是金納米簇的熒光性質(zhì) 越來越受到人們的關(guān)注，這是由于它們在生物學(xué)研究領(lǐng)域作為熒光標(biāo)記材料(11)，有著 潛在的優(yōu)勢。傳統(tǒng)半導(dǎo)體納米熒光材料(CdSe/ZnS)是由很小的納米顆粒組成，被稱為量 子點(diǎn)。當(dāng)他們的尺寸小于波爾半徑時(shí)，即當(dāng)他們的直徑在4到5納米左右時(shí)，就產(chǎn)生尺 寸依賴的熒光性質(zhì)(12-14)，產(chǎn)生不同顏色的光，但材料本身的毒性也比較大。金納米簇 也有類似的尺寸依賴的熒光性質(zhì)，隨著納米簇中金個(gè)數(shù)不同可激發(fā)出不同顏色的光。而 且，金納米簇不含有毒性重金屬，雖然也具有微弱的毒性效應(yīng)(15，16)，但它仍然是代 替量子點(diǎn)用于生物技術(shù)熒光標(biāo)記最有潛力的材料。一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆可以作為基因載體(中國發(fā)明專利申請?zhí)?為 200810051411.8)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的應(yīng)用。一種超支化聚 乙烯亞胺-球形金納米顆粒(簡寫為Au-PEI)在不同波長的激發(fā)光源激發(fā)時(shí)發(fā)出不同顏色的熒光，用于熒光標(biāo)記；所述的一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒，由球形 金納米顆粒和超支化聚乙烯亞胺通過硫金鍵結(jié)合在一起；所述的聚乙烯亞胺分子量為 300-30000,所述的球形金納米顆粒和聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為1 100 100 1。所述的一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的制備方法，請參閱中國發(fā)明 專利，申請?zhí)枮?00810051411.8。本發(fā)明提供的一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒用于熒光標(biāo)記的方法的 步驟和條件如下取人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞 COS7細(xì)胞或胚胎成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞，在CO2體積百分含量為5%的37°C的孵箱中，用 含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)；取Au-PEI加水溶解，配置成濃度為lOmg/mL的溶液，用孔徑為0.22 μ m的微 孔濾膜過濾除菌；用去離子水配制濃度為O.lmg/mL的質(zhì)粒DNA水溶液；按照Au-PEI 與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為20 160 1，將Au-PEI的水溶液和質(zhì)粒DNA的水溶液等體 積混合，把該溶液在室溫放置30分鐘，得到Au-PEI/質(zhì)粒DNA水溶液；取六孔板，在六孔板中種細(xì)胞，每孔1.0X106個(gè)，在37°C孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)， 加入上述得到的Au-PEI/質(zhì)粒DNA水溶液，使質(zhì)粒DNA為每孔50 μ g，繼續(xù)培養(yǎng)5小 時(shí)后，取出細(xì)胞，用磷酸緩沖溶液輕輕沖洗5遍，然后用0.5yg/mL的4'，6-二脒 基-2-苯基吲哚(簡稱DAPI)對細(xì)胞核避光標(biāo)記12分鐘，再用磷酸緩沖溶液沖洗5遍， 用甘油封片，進(jìn)行激光共聚焦掃描。如圖2所示，以Au-PEI 13為例說明，在波長為400 450nm(最佳激發(fā)波長為 430nm)的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長在720 SOOnm范圍內(nèi)的紅光；用DAPI標(biāo)記的 細(xì)胞核在此波長的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長在460nm左右的藍(lán)色熒光。在370nm波 長的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在600nm左右的黃光。有益效果本發(fā)明的超支化聚乙烯亞胺納米金球形顆粒用于熒光標(biāo)記時(shí)，其激 發(fā)和發(fā)射波長有效范圍都比較寬，在波長為400 450nm(最佳激發(fā)波長為430nm)的紫 外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長在720 SOOnm范圍內(nèi)的紅光；用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核在此波 長的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長在460nm左右的藍(lán)色熒光。在370nm波長的紫外光激 發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在600nm左右的黃光。其克服了有機(jī)物熒光材料峰值有效范圍 比較窄的弱點(diǎn)，使Au-PEI的適用性更強(qiáng)，并且可產(chǎn)生比較強(qiáng)比較清晰的熒光，是一種良 好的熒光材料。


圖1為超支化聚乙烯亞胺納米金粒子的光譜圖。圖中，A為Au-PEI 13的激發(fā) 和發(fā)射光譜圖；B為Au-PEI 15的激發(fā)和發(fā)射光譜圖；a和c分別為Au-PEI 13和Au-PEI 15的激發(fā)光譜；b和d分別為Au-PEI 13和Au-PEI 15的發(fā)射光譜。圖2為Au-PEI 13的激光共聚焦掃描圖，圖中，細(xì)胞核為DAPI標(biāo)記的藍(lán)色， Au-PEI 13產(chǎn)生的為紅色。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 超支化聚乙烯亞胺金納米材料的制備超支化聚乙烯亞胺金納米材料，按中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?00810051411.8提
供的方法制備。Au-PEI 13和Au_PEI 15的熒光譜圖以及不同顏色的熒光如圖1所示。圖1中a和c分別表示Au-PEI 13和Au-PEI 15的激發(fā)熒光掃描圖；b和d分別 表示Au-PEI 13和Au-PEI 15的發(fā)射熒光掃描圖。A為AU_PEI13的熒光掃描譜圖及所 觀察到的紅光；B為AU-PEI15的熒光掃描譜圖及所觀察到的黃光。Au-PEI 13在400 450nm(最佳激發(fā)波長為430nm)波長的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在720 SOOnm 范圍內(nèi)的紅光；Au-PEI 15在370nm波長的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在600nm 左右的黃光。實(shí)施例2 超支化聚乙烯亞胺納米金粒子的熒光標(biāo)記的應(yīng)用取人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，在CO2體積百分含量為5%的37°C的孵箱中，用 含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)。取Au-PEI加水溶解，配置成濃度為lOmg/mL的溶液，用孔徑為0.22 μ m的微 孔濾膜過濾除菌；用去離子水配制濃度為O.lmg/mL的質(zhì)粒DNA水溶液，按照Au-PEI 與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為20 160 1，將Au-PEI的水溶液和質(zhì)粒DNA水溶液等體積 混合，把該溶液置室溫放置30分鐘，得到Au-PEI/質(zhì)粒DNA水溶液；取六孔板，在六 孔板中種細(xì)胞，每孔1.0X106個(gè)，在37°C孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入上述得到的Au-PEI/ 質(zhì)粒DNA水溶液，使DNA每孔50 μ g，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)后，取出細(xì)胞，用磷酸緩沖溶液 輕輕沖洗5遍，然后用0.5 μ g/mL的DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行避光標(biāo)記12分鐘，再用磷酸緩 沖溶液沖洗5遍，用甘油封片，進(jìn)行激光共聚焦掃描。如圖2所示，Au-PEI 13在400 450nm(最佳激發(fā)波長為430nm)波長的紫外 光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在720 SOOnm范圍內(nèi)的紅光。用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核在 此波長激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長在460nm左右的藍(lán)色熒光。實(shí)施例3 超支化聚乙烯亞胺納米金粒子的熒光標(biāo)記的應(yīng)用其用于中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)的具體方法和步驟，同實(shí)施例2所述用于 人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的具體方法和步驟。實(shí)施例4:超支化聚乙烯亞胺納米金粒子的熒光標(biāo)記的應(yīng)用其用于非洲綠猴腎細(xì)胞(C0S7細(xì)胞)的具體方法和步驟，同實(shí)施例2所述用于 人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的具體方法和步驟。實(shí)施例5 超支化聚乙烯亞胺納米金粒子的熒光標(biāo)記的應(yīng)用其用于胚胎成纖維細(xì)胞(3T3細(xì)胞)的具體方法和步驟，同實(shí)施例2所述用于人 宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的具體方法和步驟。本發(fā)明涉及的參考文獻(xiàn) [IJGlover D J, Lipps H J and David A J, Towards Safe, Non-Viral therapeutic geng wxpression inhumans，Nature Reviews, Genetics, 2005, 6(8) 299-311
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權(quán)利要求
1.一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于，其用于熒光標(biāo)記； 所述的超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒，由納米金顆粒和超支化聚乙烯亞胺通過硫 金鍵結(jié)合在一起，所述的聚乙烯亞胺分子量為300-30000，所述的納米金顆粒和陽離子聚 合物的質(zhì)量比為1 100 100 1。
2.—種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒用于熒光標(biāo)記的方法，其特征在于步驟和 條件如下取人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞COS7細(xì) 胞或胚胎成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞，在CO2體積百分含量為5%的37°C的孵箱中，用含質(zhì)量 百分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)；取超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒加水溶解，配置成濃度為lOmg/mL的溶 液，用孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌；用去離子水配制濃度為O.lmg/mL的質(zhì)粒 DNA水溶液；按照超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為20 160 1，將超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的水溶液和質(zhì)粒DNA的水溶液等體積 混合，把該溶液在室溫放置30分鐘，得到的超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒/質(zhì)粒 DNA水溶液；取六孔板，在六孔板中種細(xì)胞，每孔1.0 X IO6個(gè)，在37°C孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入 上述得到的超支化聚乙烯亞胺_球形金納米顆粒/質(zhì)粒DNA水溶液，使質(zhì)粒DNA為每 孔50yg，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)后，取出細(xì)胞，用磷酸緩沖溶液輕輕沖洗5遍，然后用0.5 μ g/ mL的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚對細(xì)胞核避光標(biāo)記12分鐘，再用磷酸緩沖溶液沖洗5 遍，用甘油封片，進(jìn)行激光共聚焦掃描；所述的超支化聚乙烯亞胺_球形金納米顆粒在400 450nm在波長為400 450nm 的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長在720 SOOnm范圍內(nèi)的紅光，用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核在 此波長的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長在460nm左右的藍(lán)色熒光；在370nm波長的紫外 光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在600nm左右的黃光。
3.如權(quán)利要求2所述的一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒用于熒光標(biāo)記的方 法，其特征在于，所述的超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的激發(fā)光波長為430nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種超支化聚乙烯亞胺-球形金納米顆粒的應(yīng)用。其用于熒光標(biāo)記。所述的納米顆粒，由納米金顆粒和超支化聚乙烯亞胺通過硫金鍵結(jié)合在一起，所述的聚乙烯亞胺分子量為300-30000，所述的納米金顆粒和陽離子聚合物的質(zhì)量比為1∶100～100∶1。該納米金球形顆粒用于熒光標(biāo)記時(shí)，其激發(fā)和發(fā)射波長有效范圍都比較寬，在激發(fā)波長為400～450nm，最佳激發(fā)波長為430nm的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在720～800nm范圍內(nèi)的紅光；在370nm激發(fā)波長的紫外光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)射波長峰值在600nm左右的黃光。其克服了有機(jī)物熒光材料峰值有效范圍比較窄的弱點(diǎn)，是一種良好的熒光材料。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102021225SQ200910067538
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者景遐斌, 李艷輝, 林琳, 田華雨, 郭兆培, 陳學(xué)思, 陳杰 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所