專利名稱：：黃瓜抗、感褐斑病基因片段及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及黃瓜常規(guī)雜交育種、分子標(biāo)記輔助育種的方法與技術(shù)，特別涉及黃瓜抗褐斑病基因片段、黃瓜感褐斑病基因片段及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：黃瓜褐斑病(又稱耙斑病)[Cw7"^/wraaw7co/fl(Berk.&Curt.)Wei.]是一種世界性分布的病害，1906年歐洲首次報道該病。目前已成為為害黃瓜露地和保護地栽培的重要病害之一，尤以越冬溫室、冬春溫室、春大棚等保護地內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重。該菌寄主范圍十分廣泛，除為害黃瓜外，能侵染十字花科、葫盧科、茄科等科中的20余種蔬菜。主要為害葉部，病斑初呈淡褐色后變褐綠色，略呈圓形，直徑612mra，多數(shù)病斑的擴展受葉脈限制，呈不規(guī)則形或多角形，有的斑中部呈灰白色至灰褐色，上生灰黑色霉?fàn)钗锛床【姆稚咦庸：头稚咦?。?yán)重時，病斑融合，葉片枯死，引起植株早衰，提前拉秧。病菌侵入后潛育期一般67天，高濕或通風(fēng)不良易發(fā)病，2527'C及飽和濕度條件下發(fā)病重，溫差大有利于發(fā)病。該病引致落葉率低于5%時，病情擴展慢，約2周，而以后一周內(nèi)發(fā)展快，落葉率可由5%發(fā)展至90%。棚室內(nèi)反季節(jié)種植黃瓜在冬春季節(jié)和初夏均易流行發(fā)病。田間發(fā)病率一般在10%25%，嚴(yán)重時為60%70%，造成損失達(dá)30%以上。黃瓜褐斑病是黃瓜生產(chǎn)上的重要病害。査閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，迄今為止，有關(guān)黃瓜褐斑病的抗性遺傳規(guī)律和分子標(biāo)記輔助育種研究尚缺乏系統(tǒng)的研究和報道。因而將黃瓜抗褐斑病基因與不抗褐斑病的其它品種的優(yōu)良品質(zhì)基因相結(jié)合，培育優(yōu)良抗病的黃瓜新品種和創(chuàng)造黃瓜新種質(zhì)是生產(chǎn)實踐中亟需解決的實際問題。分子標(biāo)記的應(yīng)用為蔬菜育種學(xué)開辟了嶄新的研究和應(yīng)用領(lǐng)域，它使蔬菜育種學(xué)家能直接從分子水平了解物種間的差異,也使育種過程更直觀，目的性更強。利用"分子標(biāo)記輔助選擇"(Molecularmarker-assistedselection,MAS),可在早代對表現(xiàn)優(yōu)良的基因型進(jìn)行鑒定，從而大大提高育種效率。將分子遺傳技術(shù)應(yīng)用于蔬菜抗病遺傳育種的研究上，為材料的選擇提供了全新的手段。苗期即可在DNA水平上對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，而且穩(wěn)定可靠，不受季節(jié)、環(huán)境條件等因素的影響，可提高選擇速度，增強選擇的準(zhǔn)確性和可靠性，加快育種進(jìn)程，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜抗褐斑病基因片段。本發(fā)明的第二個目的是提供一種黃瓜感褐斑病基因片段。本發(fā)明的第三個目的利用黃瓜抗褐斑病基因片段和黃瓜感褐斑病基因片段，對黃瓜抗褐斑病種質(zhì)資源進(jìn)行篩選或?qū)S瓜進(jìn)行抗褐斑病分子標(biāo)記輔助育種。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下黃瓜抗褐斑病基因片段，是SEQIDNo.l所述的核苷酸序列。黃瓜感褐斑病基因片段，是SEQIDNo.2所述的核苷酸序列。利用SEQIDNo.l所述的核苷酸序列和SEQIDNo.2所述的核苷酸序歹i，對黃瓜抗褐斑病種質(zhì)資源進(jìn)行篩選或?qū)S瓜進(jìn)行抗褐斑病分子標(biāo)記輔助育種。利用本發(fā)明的黃瓜抗褐斑病基因片段和黃瓜感褐斑病基因片段對構(gòu)建的F2代分離群體和黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行褐斑病抗性評價，其結(jié)果與人工接種鑒定符合率達(dá)97.10%(數(shù)據(jù)見表1)，在黃瓜育種中進(jìn)行資源抗性篩選具有很大的應(yīng)用價值。以這些序列為依據(jù)，可以進(jìn)行抗褐斑病標(biāo)記輔助選擇、育種，用作黃瓜育種中檢測黃瓜抗褐斑病基因的探針；可以為進(jìn)行抗褐斑病基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的抗病性奠定基礎(chǔ)。圖1是黃瓜抗褐斑病和感褐斑病特異DNA片段的獲得圖譜或Q5XP57-1雜交后代F2代分離情況圖譜其中A(M)為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量200bp;B(P^)為母本Q5抗性基因片段，C(P2)為父本P57-l感性基因片段；1、11、14、17、19、23、25、34、37為抗病單株；2、3、5、6、9、24、27、28、36為感病單株；4、7、8、10、12、13、15、16、18、2022、26、2933、35為雜合類型單株，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)，純合抗性株僅有抗性基因片段，純合感性株僅有感性基因片段，雜合類型同時具有抗性基因片段和感性基因片段。圖2是多態(tài)性特異片段的EST-SSR驗證結(jié)果圖其中B(P!)為母本Q5抗性基因片段，C(P2)為父本P57-1感性基因片段，14、68、1620、28、29、31為抗病材料，5、715、2127、30為感病材料;圖3是Marker標(biāo)記特異片段回收擴增2.0%瓊脂糖電泳結(jié)果圖M為DNA標(biāo)準(zhǔn)，14為感病基因片段，58為抗病基因片段。具體實施例方式本發(fā)明是在對大量黃瓜資源進(jìn)行苗期人工接種抗病性鑒定，獲得黃瓜抗褐斑病種質(zhì)的基礎(chǔ)上，采用EST-SSR技術(shù)分離黃瓜抗褐斑病基因片段和黃瓜感褐斑病基因片段，進(jìn)行序列同源性分析，為種質(zhì)資源的抗源篩選、分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用EST(Expressedsequencetags)-SSR(Simplesequencerepeat)分子標(biāo)記技術(shù)，采用BSA法對黃瓜褐斑病抗病材料Q5的抗病性相關(guān)基因和黃瓜褐斑病感病材料P57-1的感病性相關(guān)基因進(jìn)行了分子標(biāo)記研究。獲得黃瓜抗褐斑病基因DNA片段1個，獲得黃瓜感褐斑病基因DNA片段1個，對這些片段測序后，其大小分別為203bp(SEQIDNo.l所述的核苷酸序列)、207bp(SEQIDNo.2所述的核苷酸序列)。本發(fā)明獲得的黃瓜抗褐斑病基因序列和感褐斑病基因序列的具體操作步驟如下1.F2分離群體的構(gòu)建及抗病性鑒定在大量資源苗期人工接種抗病性鑒定的基礎(chǔ)上，選取黃瓜抗褐斑病母本Q5和感褐斑病父本P57-l及其F2代分離群體為試材。4田間種植F2群體，正常管理。第2真葉時采用噴霧法進(jìn)行褐斑病苗期接種鑒定。分別于接種后5、10、15d調(diào)査統(tǒng)計發(fā)病情況。將F2單株分為高抗、中間類型和高感3個級別。2.DNA提取及SSR分析體系剪取黃瓜幼嫩小葉，采用CTAB法單株提取DNA，-20匸保存。PCR反應(yīng)體系為20ul，黃瓜基因組DNA20ng、引物各50ng、dNTPO.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶1.6單位；反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性300秒，94。C變性30秒，58'C退火30秒，72'C延伸60秒，35個循環(huán)，再72。C延伸350秒。3.引物篩選和驗證在抗感親本間篩選111對SSR引物和29對EST-SSR引物，在雙親間產(chǎn)生多態(tài)性的引物3對，其中引物CSFR33在兩親本以及F2抗感組和中間類型單株進(jìn)行PCR擴增，獲得了一個共顯性EST-SSR標(biāo)記，用該引物組合分別對組外的其它F2單株以及育種和生產(chǎn)上的褐斑病抗感高代自交系進(jìn)行擴增，進(jìn)一步確認(rèn)所篩選到的標(biāo)記。結(jié)果表明抗病親本和抗病組單株只有203bp的特異片段，感病親本和感病組單株只有207bp的特異片段，而中間類型單株則同時具有該兩個特異片段。經(jīng)連鎖值測定，所篩選到的標(biāo)記與目標(biāo)基因——褐斑病抗性相關(guān)基因緊密連鎖，遺傳距離為2.9cM。所用EST-SSR引物CSFR33的堿基序列為Pl:-GAGCATTGAGCAGTCACGAG-3zP2:-GTATTTGTGAGGGGTGGAGG-3'4.PCR產(chǎn)物的回收和測序?qū)U增產(chǎn)物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95'C變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，IOOW恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察。采用煮沸法將兩個目的片段從銀染膠上回收、擴增，送至北京三博遠(yuǎn)志生物工程公司進(jìn)行測序。5.序列分析根據(jù)測序結(jié)果，與抗病性相關(guān)的特異片段有203個堿基(SEQIDNo.l所示)，與感病性相關(guān)的特異片段有207個堿基(SEQIDNo.2所示)，二者的差異在于4個堿基的插入或缺失。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1采用BSA法，以黃瓜褐斑病抗病材料Q5和感病材料P57-l及其241株F2代分離群體為試材，采用CTAB法提取黃瓜基因組DNA。以111對SSR引物和29對EST-SSR引物進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)特異DNA片段在F2代分離群體中的表現(xiàn)情況，對照以上的苗期人工接種抗病性鑒定結(jié)果，獲得與黃瓜抗褐斑病基因緊密連鎖的EST-SSR標(biāo)記CSFR33以及抗褐斑病基因DNA片段(SEQIDNo.1所示)和感褐斑病基因DNA片段(SEQIDNo.2所示)。實施例25用保存于天津科潤黃瓜研究所育種一室的黃瓜種質(zhì)資源XL6-3、W17-2-l、A13、P53、P54、P60-l、P59-l、66、F51、Q12、Q21等，采用苗期人工接種抗病性鑒定方法對以上材料進(jìn)行抗病性鑒定，獲得抗病材料和感病材料。根據(jù)實施例1獲得的與抗褐斑病基因緊密連鎖的EST-SSR特異引物CSFR33，對上述黃瓜材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，凡擴增產(chǎn)物出現(xiàn)203bp的特異片段的材料，為抗褐斑病資源；凡擴增產(chǎn)物出現(xiàn)207bp的特異片段的材料，為感褐斑病資源；凡同時擴增出該兩個特異片段的材料，為不純合材料?？购职卟≠Y源，或者是抗褐斑病基因的攜帶者，可以用作進(jìn)一步抗病品種選育的材料和育種種質(zhì)。表1F2單株田間抗病表現(xiàn)及標(biāo)記分離統(tǒng)計針n難CSFR33CSFR33計p翻CSFR33CSFR33賠翻CSFR33CSFR33M++*36M+_71M++2M++37S_+72M++3M++38M++73M++4M++39R+_74R+_5M++40M++75M++6R+_41R+76S—+7R+_42S_+77R+_8M++43S一_78R+_9M++44M++"9\1+_10M++45S_+80S_+11M++46S_+81R+一12S_+47M++82R+_13M++48M++83M++14M++49S+84R+_15M++50M++85M++16R+_51R+86R+17R+_52M++87S—+18M++53M++88R+_*19\'，+_54R+_89M++20S_+55M++卯M++21M++56M++*91R++22S—+57R+_92R+一23S_+58M++93S_+24M++59R+94M++25S_+60M++95S+26S_+61M++96M++27M++62M++97M++28M++63R+_98R+_29M++64S+99S_+30M++65R+100M++31M++66M++101M++32S67S一+102S_+*33V5+_68S_+103S_+34S_+69M++104s_+35M++70M++105M++7續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注R:高度抗??；M:中間類型；S:高度感??；+:有條帶；-:無條帶；*:交換單株由表中可以看出，共有交換單株7株，所以吻合率為234/241=97.10。序列表<110>天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司<120>黃瓜抗、感褐斑病基因片段及應(yīng)用<160>2<210>1<211>203<212>DNA<213>黃瓜禾中(CucumissativusLinn.)<221>gene<222>(1)…(203)<400>1gtatttgtgagtggtggagg卿cacg卿gg咖taatttgtttgggtttttgttttac60gtgttgtttttgttgttgttaatgttgaggagagagagagagagagagagagagagagaa120ggaataataaatattctctgggagaataagctaagtaattagaatagtggactccccccc180ccactcgtgactgctcaatgetc203<210〉2<211>207<212>DNA<213>黃瓜禾中(CucumissativusLinn.)<221>gene<222>(1)...(207)<400>2gtatttgtgagtggtggaggaagcacgagaggaaataatttgtttgggtttttgttttacGOgtgttgtttttgttgttgttaatgttgaggag卿g卿g卿gag卿g卿gag卿g120agaaggaataataaatattctctgggagaataagctaagtaattagaatagtggactccc180ccccccactcgtgactgctcaatgctc20權(quán)利要求1.黃瓜抗褐斑病基因片段，其特征是SEQIDNo.1所述的核苷酸序列。2.黃瓜感褐斑病基因片段，其特征是SEQIDNo.2所述的核苷酸序列。3.利用權(quán)利要求1所述的黃瓜抗褐斑病基因片段和權(quán)利要求2所述的黃瓜感褐斑病基因片段，對黃瓜抗褐斑病種質(zhì)資源進(jìn)行篩選。全文摘要本發(fā)明公開了黃瓜抗、感褐斑病基因片段及應(yīng)用，黃瓜抗褐斑病基因片段，是SEQIDNo.1所述的核苷酸序列。黃瓜感褐斑病基因片段，是SEQIDNo.2所述的核苷酸序列。利用黃瓜抗褐斑病基因片段和黃瓜感褐斑病基因片段，對黃瓜抗褐斑病種質(zhì)資源進(jìn)行篩選。在黃瓜育種中進(jìn)行資源抗性篩選具有很大的應(yīng)用價值。以這些序列為依據(jù)，可以進(jìn)行抗褐斑病標(biāo)記輔助選擇、育種，用作黃瓜育種中檢測黃瓜抗褐斑病基因的探針；可以為進(jìn)行抗褐斑病基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的抗病性奠定基礎(chǔ)。文檔編號C12N15/29GK101508998SQ20091006825公開日2009年8月19日申請日期2009年3月26日優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日發(fā)明者李淑菊,楊瑞環(huán),王惠哲,煒管申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司