專利名稱：β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其 用途。更具體的說是利用葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白對(duì)陳皮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可提高陳 皮中橙皮苷的生物利用度的方法。
背景技術(shù)：
生物轉(zhuǎn)化法本質(zhì)是由微生物產(chǎn)生的一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶作為生物催 化劑對(duì)外源性底物進(jìn)行的一種或幾種化學(xué)反應(yīng)。生物轉(zhuǎn)化既可增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量，克服化 學(xué)合成的缺點(diǎn)，又因其大多數(shù)是在室溫、中性環(huán)境中作用，減少了產(chǎn)物分解、異構(gòu)、消旋和重 排反應(yīng)，反應(yīng)具有位置選擇性和立體選擇性，因此生物轉(zhuǎn)化具有無毒、無污染、低成本、高收 率、環(huán)境友好等特點(diǎn)。S. Singularis分離自Scolytus spp.昆蟲幼蟲糞便，由于此類真菌自然條件下的 生存環(huán)境決定了其體內(nèi)可產(chǎn)生用于分解來自于蔬菜的苷類化合物的酶類。Ishikawa EIJI 等研究發(fā)現(xiàn)S. Singularis只能產(chǎn)生一種水解酶，稱作BglA蛋白，并驗(yàn)證此酶是具有高半乳 糖苷酶活性的葡萄糖苷酶同工酶。橙皮苷是廣泛存在于柑橘類果實(shí)中主要類黃酮苷類成份之一，藥理研究證實(shí)其具 有抗氧化、調(diào)節(jié)脂類代謝、干擾腫瘤發(fā)生等生物活性。但橙皮苷與其他類黃酮一樣口服生 物利用度不高，究其原因之一是其含有的配糖基團(tuán)影響了其水溶性。相關(guān)研究表明橙皮苷 的苷元，橙皮素的口服生物利用度高于橙皮苷，因?yàn)槌绕に夭缓信涮腔鶊F(tuán)，不需要脫糖基 化。因此水解橙皮苷，脫去其配糖基團(tuán)是提高其口服生物利用度的特異性方法之一。目前 研究的轉(zhuǎn)化方法主要有化學(xué)法，如日本Hayashibara橙皮研究所采用糖基化方法制成糖基 化橙皮苷。但強(qiáng)烈化學(xué)反應(yīng)會(huì)改變苷類化合物的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型，導(dǎo)致產(chǎn)物不穩(wěn)定或藥效消失； 酶解法，如瑞士雀巢研究中心采用酶修飾方法，用橙皮苷酶水解橙皮苷獲得橙皮素-7-糖 苷。酶解法轉(zhuǎn)化苷類中藥是以苷類提取物為作用底物，使用糖苷水解酶作為催化劑，工藝過 程復(fù)雜，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白。本發(fā)明使用 3 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化陳皮中的主要活性成分橙皮苷，口服給藥和靜脈 給藥兩種給藥途徑的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果均表明此酶的生物轉(zhuǎn)化作用提高了橙皮苷的生物利 用度，因此我們探索微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用ATCC標(biāo)準(zhǔn)真菌菌株S. singularis,采用現(xiàn)代分 子生物學(xué)技術(shù)，克隆、表達(dá)具有高0 “葡萄糖苷酶活性的BglA蛋白，利用其生物轉(zhuǎn)化橙皮 苷，將苷轉(zhuǎn)化為苷元，消除苷類中藥人群中應(yīng)用個(gè)體差異，提高苷類中藥生物利用度，進(jìn)而 提高苷類中藥藥效。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開了 葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白在提高苷類中 藥生物利用度方面的應(yīng)用，特別是將橙皮苷轉(zhuǎn)化為苷元藥物方面的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案一種編碼葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的基因，該基因具有SEQ ID N0:1。本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶，它具有SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列；本發(fā)明所述葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的重組表達(dá)質(zhì)粒的載體為 pQE30-Xa-bglAo本發(fā)明進(jìn)一步公開了 葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制備提高苷類化合物 生物利用度藥物方面的應(yīng)用。特別是葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制備提高陳皮 中橙皮苷的生物利用度藥物方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的葡萄糖苷酶同工酶BglA是一種新型的酶，這種酶不 但耐高溫，而且熱穩(wěn)定性優(yōu)良，特別是在體外水解橙皮苷，將橙皮苷轉(zhuǎn)化為苷元藥物方面具 有明顯的作用。從而完成了本發(fā)明的工作。本發(fā)明首先公開了橙皮苷的提取及BglA蛋白體外水解橙皮苷的方法橙皮苷提取自陳皮，采用超聲提取方法。4g陳皮被粉碎為粒徑大小為1mm粉末， 200ml甲醇溶解，40°C，60mHz超聲60min，重復(fù)一次。將甲醇超聲提取液過濾后蒸發(fā)干燥，殘 留物溶解于含5% (v/v)丙二醇的水中，終濃度為10mg/ml。所得溶液用0. lml, 0. 01M草酸 酸化，HPLC定量。然后將本研究克隆S. singularis的bglA基因，將之與表達(dá)載體pQE30_Xa 相連接組成重組質(zhì)粒pQE-30Xa-bglA，并成功在E. coli中表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)前期在microRNA水平體外研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷可以抑制JSRV引起的人支氣管 上皮細(xì)胞中致瘤性microRNA-17-92基因高表達(dá)，是一種可用于干擾人BAC發(fā)生的候選化學(xué) 預(yù)防腫瘤藥物。但是研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷體內(nèi)生物利用度不高，且人群中由于能夠特異性水解 不同苷類化合物的腸道菌群個(gè)體差異導(dǎo)致人群苷類化合物生物利用度個(gè)體差異，進(jìn)而導(dǎo)致 藥效差異，影響了橙皮苷在體內(nèi)發(fā)揮生物活性?？紤]到我國古老的中藥炮制方法能夠提高中國傳統(tǒng)中藥陳皮的藥效，因此為探 討陳皮經(jīng)發(fā)酵炮制藥效提高的機(jī)制，摸索提高橙皮苷生物利用度的生物轉(zhuǎn)化方法，本研究 選擇了 ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株Sporobolomyces singularis，從中提取其產(chǎn)生的BglA蛋白，并在 E. coli中表達(dá)其葡萄糖苷酶同工酶bglA基因。繼而本發(fā)明使用提取于S. singularis 和表達(dá)于E. coli的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白體外生物轉(zhuǎn)化橙皮苷提取物，通過觀 察橙皮苷經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后，大鼠血漿內(nèi)總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)變化，來觀察3 -葡萄糖苷酶同 工酶BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化作用對(duì)橙皮苷生物利用度的影響。本發(fā)明的選用pQE30_Xa載體，除具有pQE載體的一些基本特征，如優(yōu)化的啟動(dòng) 子_操縱元模式，包括來自噬菌體的T5啟動(dòng)子(由大腸桿菌的RNA聚合酶識(shí)別)和兩個(gè)乳 糖操縱子識(shí)別序列；合成的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS II，保證高效的翻譯；有多個(gè)終止密碼子， 無論目的片段從多克隆位點(diǎn)的哪里插入都可以正確的終止；兩個(gè)強(qiáng)而有力的轉(zhuǎn)錄終止子 來自\噬菌體的t0和來自大腸桿菌rrnB操縱元的T1，可以有效預(yù)防轉(zhuǎn)錄中的通讀現(xiàn)象 并保證表達(dá)質(zhì)粒的穩(wěn)定性；所有質(zhì)粒含有0 -內(nèi)酰胺酶(bla)基因；ColEl復(fù)制起點(diǎn)等特點(diǎn) 外，還在其N末端加入6X組氨酸標(biāo)簽，對(duì)于比較難表達(dá)的蛋白以及蛋白太小容易被降解的 蛋白可以利用這種標(biāo)簽。它可以保證蛋白的穩(wěn)定性，同時(shí)不會(huì)對(duì)外源蛋白的免疫原性造成 很大的影響；同時(shí)，此載體在6X組氨酸和外源蛋白之間含有一個(gè)Xa因子蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，Xa因子可以從識(shí)別位點(diǎn)的精氨酸后準(zhǔn)確將外源蛋白分離而不帶有任何載體加入的氨基酸。本發(fā)明的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白所具有的積極效果在于(1)利用0 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白對(duì)陳皮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可提高陳皮的主要 活性成分橙皮苷的生物利用度。相比較于橙皮苷提取物對(duì)照組，經(jīng)葡萄糖苷酶同工酶 BglA蛋白作用組血漿總橙皮素濃度明顯增高，達(dá)到最大血藥濃度的時(shí)間T_明顯縮短。從 而本研究建立了一種提高苷類化合物生物利用度，進(jìn)而提高其藥效的新方法。(2)初步探討了陳皮經(jīng)炮制藥效增加的機(jī)制，即生物利用度低的橙皮苷可被 3 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用轉(zhuǎn)化為橙皮素。(3)提取自S.singularis菌株的BglA蛋白和表達(dá)自E.coli菌株的BglA蛋白均 具有3 _葡萄糖苷酶同工酶活性，體外可將橙皮苷水解為其苷元橙皮素。(4)首次在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)進(jìn)行橙皮苷和橙皮素的口服給藥和靜脈給藥兩種給 藥方式的藥代動(dòng)力學(xué)平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)橙皮素比橙皮苷易于吸收且清除較慢，從而補(bǔ)充 了橙皮苷生物利用度低于其苷元的原因。首次說明苷體內(nèi)血漿快速清除率和目前已知的苷 具有低水溶性、在腸上皮細(xì)胞上的低透過性或/和腸上皮細(xì)胞對(duì)其的外排作用一樣，都與 苷類化合物低生物利用度有關(guān)聯(lián)。


圖 1 為 pQE30_Xa 載體圖；圖2HPLC代表性圖譜，其中(A)橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(tR = 20. 38min)和橙皮素標(biāo)準(zhǔn) 品(tR = 10. 77min)圖譜；⑶空白大鼠血漿圖譜；(C)大鼠血漿中0. 02 u mol/L橙皮素和 0. 02 u mol/L橙皮苷?qǐng)D譜；圖3bglA基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4pQE30-Xa_bglA 酶切結(jié)果圖；圖5BglA蛋白SDS-PAGE電泳圖；其中1 細(xì)菌細(xì)胞提取物；2 分子量標(biāo)準(zhǔn)；3 :BglA 蛋白；圖6橙皮苷被BglA蛋白和0 -葡萄糖苷酶體外生物轉(zhuǎn)化圖；圖7單次靜脈給藥后大鼠體內(nèi)總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)變化。大鼠被隨機(jī)分為5組， 每只大鼠靜脈注射相當(dāng)于31i!m0l/kg橙皮苷。血漿樣本使用葡萄糖醛酸酶水解，血漿 內(nèi)藥物水平以血漿總橙皮素表示。每一數(shù)值以5 土SEM (n=5)表示；圖8單次口服給藥后大鼠血漿總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)變化。大鼠被隨機(jī)分為5組， 每只大鼠口服相當(dāng)于31i!m0l/kg橙皮苷。血漿樣本使用葡萄糖醛酸酶水解，血漿內(nèi)藥 物水平以血漿總橙皮素表示。每一數(shù)值以$ 土SEM(n=5); 圖9橙皮苷和橙皮素腸道內(nèi)代謝途徑，包括橙皮苷體外被BglA蛋白水解及體內(nèi)被 腸道細(xì)菌水解、橙皮苷和橙皮素的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，以及兩者體內(nèi)代謝途徑。
具體實(shí)施例方式為了簡(jiǎn)單和清楚的目的，下文恰當(dāng)?shù)氖÷粤斯夹g(shù)的描述，以免那些不必要的 細(xì)節(jié)影響對(duì)本技術(shù)方案的描述。以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1
5
1.材料1. 1 試劑橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品0 -葡萄糖苷酶PNP-GlcM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶BamH I 內(nèi)切酶Hind III 內(nèi)切酶10XK buffer2 X Ligation Master MixAmp小型質(zhì)粒提取試劑盒凝膠回收試劑盒IPTGSDS蛋白分子量ladderUsukizyme考馬氏亮藍(lán)G250YWG-C18 (4. 6X150mm,5um)蛋白月東酵母提取物麥芽提取物瓊脂粉其他相關(guān)試劑均為分析純或HPLC級(jí)1. 2 菌株1. 2. IS. Singularis購自ATCC (American Type Culture Collection)，菌株號(hào) 24193，接種于 YM 培養(yǎng) 基，24°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1. 2. 2E. coli T0P10基因型為 F-mcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) <P 801acZ A M15 A lacX74nupG recAlara D139 A(ara-leu) 7697galE15galK16rpsL (StrE) endAl X、購自 Invitrogen 公司。1. 2. 3E. coli Ml5 (pREP4)基因型為NalsStrsRifs Thi_lac_Ara+Gal+MtrF_RecA_Uvr+Lon+,購自 Qiagen 公司1. 3pQE30_Xa 載體購自Qiagen公司，其酶切位點(diǎn)如圖1所示。1. 4 動(dòng)物6周齡雄性Wistar大鼠(180 220g) 25只，購自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào) SCXK-Military-2002，飼養(yǎng)于室溫(23士2°C )，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)lw。1. 5培養(yǎng)基
Sigma Sigma Sigma Invitrogen TaKaRa TaKaRa TaKaRa Qiagen 上海生工 Invitrogen Invitrogen Sigma Sigma MB I
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1.5.1YM 培養(yǎng)基 1L蒸餾水中含有酵母提取物3g，麥芽提取物3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊脂20g， pH 5. 0。高壓滅菌備用。1. 5. 2LB液體培養(yǎng)基1L蒸餾水中含有蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，用ION NaOH調(diào)節(jié)pH值至 7.0，高壓滅菌備用。1. 5. 3LB固體培養(yǎng)基1L LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15g溶解，高壓滅菌備用。1. 5. 4 含 Amp LB 培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后呈液態(tài)的LB培養(yǎng)基冷至50°C時(shí)，加入Amp至終濃度為50 u g/ml。1. 6常用溶液及配制1. 6. 11M IPTG, 200mg IPTG溶于1ml去離子水中，過濾除菌分裝，_20°C保存。1.6. 21M〇&(12儲(chǔ)存液，200ml純水中溶解54g，用0. 22iim的除菌濾器過濾，每 10ml分裝保存于-20°C ； 100mM的工作液將儲(chǔ)存液用4°C預(yù)冷的無菌純水稀釋至100mM。 1. 6. 310% SDS，在90ml水中溶解10g電泳級(jí)的SDS，加熱至68°C助溶，調(diào)pH至7. 2，加水定 容至1L。1. 6. 412 % SDS-PAGE 分離膠，純凈水 1. 6ml，30 % 聚丙烯酰胺 2. 0ml, 1. 5M Tris ‘ Cl(pH 8. 8)) 1. 3ml, 10% SDS 0. 05ml，10%過硫酸銨 0. 05ml，TEMED 0.002ml。1.6. 5考馬斯亮藍(lán)蛋白定量染液，將lOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%乙醇 中，加入100ml磷酸，然后加水定容至1L，濾紙過濾，4°C保存。1. 7主要儀器超聲波儀KQ-100A中國昆明HPLC儀LC-6日本島津2.方法2. 1橙皮苷提取橙皮苷提取自陳皮，采用超聲提取方法。4g陳皮被粉碎為粒徑大小為0. 5 1mm 粉末，200ml甲醇溶解，40°C 60mHz超聲60min，重復(fù)一次。將甲醇超聲提取液過濾后蒸發(fā)干 燥，殘留物溶解于含5% (v/v)丙二醇的水中，終濃度為10mg/ml。所得溶液用0. lml 0. 01M 草酸酸化，HPLC定量。2. 2 從 S. Singularis 中提取 BglA 蛋白收集處于對(duì)數(shù)生長中期的S. Singularis細(xì)胞，離心(2，000Xg,5min)。使用50mM 磷酸鈉緩沖液(PH 7. 0)沖洗沉淀兩次后，使用50mM檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 4. 0)溶解沉 淀，37°C下使用(wAOUsukizyme作用2h?？扇苄援a(chǎn)物與上清液混合均勻得粗提物。2.3.克隆、表達(dá)bglA基因2. 3. 1 總 RNA 提取及 RT-PCR(1)當(dāng) S. Singularis 生長到對(duì)數(shù)生長期(OD660 = 2X 108cells/ml)時(shí)，使用 50mM磷酸檸檬酸緩沖液沖洗細(xì)胞。在150 ill沖洗液加入500 ill Trizol，震蕩混勻 30s，冰上放置5min。(2)加入氯仿(0. 2ml氯仿/ml Trizol)，劇烈震蕩15s，冰上放置 lOmin。(3)4°C 12，OOOrpm離心15min，取上清移至新管。(4)加入異丙醇(0. 5ml異丙醇/mlTrizol)，混勻震蕩，冰上放置 lOmin。(5)4°C 12，OOOrpm 離心 15min，棄上清。(6)75% 乙 醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，垂直震蕩，4°C 12，OOOrpm離心5min。重復(fù)一次。(7)棄上清， 室溫干燥沉淀，DEPC水溶解RNA。-70°C保存。(8)RT:冰浴中加入總 RNA5. 0u 1Oligo(dT) 181. 0u 1混勻離心3-5s，70°C 5min，冰浴lmin，離心3_5s。繼續(xù)加入dNTP(lOmM)2. 5 u 15XRT buffer4. 0 u 1RNase inhibitor(40U/ml) 0. 5u 1M-MLV(10U/u 1)2. 0u 137 °C lh，70°C 15min，所得 cDNA 分裝，-20°C 保存。(9)PCR反應(yīng)體系利用GeneBank 中已公布的 S. Singularis bglA 基因序列(GI :62533244)，用 Gene Runner軟件設(shè)計(jì)引物。引物由Invitrogen公司合成。引物序列如下上游引物5' -CGC GGATCCATGATGCTGCATGCGGCAC-3‘(序列表 3)
下游引物5' -CCCAAGCTT TCAGAGGTGGTTGCGACC-3 ‘(序列表 4)
PCR反應(yīng)體系
模板cDNA4u 1
lOXEx Taq buffer5u 1
dNTP1 u 1
上游引物1 u 1
上游引物1 u 1
Ex Taq0. 5u 1
ddH2037. 5u 1
總體積50 u 1
經(jīng)優(yōu)化后的PCR循環(huán)參荽文為94°C 2min, 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2min 30 個(gè)循環(huán)，
72°C延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果。PCR產(chǎn)物用TaKaRa瓊脂糖凝 膠DNA純化試劑盒回收、定量、分裝，-20°C保存。2. 3. 2重組載體的構(gòu)建及鑒定(1)酶切BamH I 1 u 1, Hind III I 1111，共用10父1( buffer lyl，DNA 片段 5 Pi (或質(zhì)粒4 ill)，ddH20 2 ill (或3 ill)，總體系為10 ill?；靹颍x心3 5s，37°C酶切 2h?；厥彰盖挟a(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳定量。(2)連接質(zhì)粒 lii 1，DNA片段4ii l，2XLigation MasterMix 5 ii 1，總體系 10 ii 1。 混勻，16°C連接過夜。(3)重組載體轉(zhuǎn)化E. coli TOP 10感受態(tài)細(xì)胞①將10 u 1連接產(chǎn)物加入50 yl感 受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min。②42°C熱休克30s，立即置冰浴中。③加入500 yl 37°C預(yù) 溫LB液體培養(yǎng)基，37°C 200rpm振搖培養(yǎng)lh。④取適量上述轉(zhuǎn)化菌液涂布于37°C預(yù)溫含 Amp LB平板，37 °C培養(yǎng)過夜。
(4)重組載體的篩選和鑒定①PCR鑒定。挑取含Amp LB平板上單菌落接種于含 Amp LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振搖培養(yǎng)過夜。按試劑盒說明書用小型質(zhì)粒提取試劑 盒從菌液中提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒DNA為模板，用前述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件與參 數(shù)同前，瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果。②酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如表2所 示。③測(cè)序鑒定，將PCR鑒定和酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒由北京賽博基因有限公司測(cè)序鑒 定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pQE30-Xa-bglA。表2重組質(zhì)粒pQE30-Xa-bglA酶切反應(yīng)體系(單位μ 1) 混勻，離心3-5S，37°C酶切過夜，2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。2. 3. 3重組載體表達(dá)將構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-Xa_BglA轉(zhuǎn)化E. coli M15 (pREP4)，操作步驟 同上。將培養(yǎng)過夜的陽性克隆菌液，按1 100接種4ml Amp抗性LB，37°C搖床培養(yǎng)至OD值 處于0.6 0.8之間。加入終濃度為0. 4mM IPTG，37°C振搖培養(yǎng)3h。取菌液lml，12，OOOXg 30s收集沉淀，加入100 μ 1 IXSDS加樣緩沖液重懸，同蛋白Marker—起70°C lOmin，離心 12，OOOXg lmin，取上清，Bio-Safe考馬氏亮藍(lán)G250染色，12% SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)^ ο2. 4BglA蛋白的β -葡萄糖苷酶活性檢測(cè)使用對(duì)硝基-β -D-吡喃葡萄糖苷(ΡΝΡ- β -Glc)作為底物，孵育混合物(總體積 =lml)包含1. 5mM PNP-β -Glc，50mM磷酸緩沖液(pH6. 0)以及0. Iml BglA蛋白真菌提取 物或E. coli表達(dá)純化產(chǎn)物。37°C孵育4h后，加入4ml 0. 25M Na2CO3終止反應(yīng)。420nm波 長下測(cè)量吸光度。2.5體外BglA蛋白水解橙皮苷實(shí)驗(yàn)分別從S. Singularis和E. coli中提取BglA蛋白，檢測(cè)出其酶活性后，進(jìn)行體外 BglA蛋白水解橙皮苷實(shí)驗(yàn)。每一酶反應(yīng)體系(lml體積)包含0.5 μ M橙皮苷、50mM檸檬酸 磷酸緩沖液(PH6. 0)以及相當(dāng)于0. Olmg酶活性的BglA蛋白。反應(yīng)混合物在加入酶前先在 40°C預(yù)孵育5min，在加入酶后再在40°C孵育30min，最后煮沸5min終止反應(yīng)。同時(shí)設(shè)立相 同反應(yīng)條件下的兩個(gè)對(duì)照，一為葡萄糖苷酶商品陽性對(duì)照，另一為橙皮苷空白對(duì)照。反 應(yīng)體系中的橙皮苷和橙皮素用HPLC方法定量。用于HPLC檢測(cè)的標(biāo)本先經(jīng)3，OOOXg離心 20min，取上清，再用500 μ 1甲醇提取，提取所得的有機(jī)相被轉(zhuǎn)移到微離心管中，真空干燥。 干燥所得產(chǎn)物使用ΙΟΟμΙ甲醇再溶解并3，OOOXg離心lOmin，所得上清用于HPLC分析。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。2. 6HPLC方法檢測(cè)大鼠血漿標(biāo)本中的橙皮苷和橙皮素。2. 6.1色譜條件使用YWG-C18(4. 6X150mm，5iim)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇0. 04M KH2P04(兩者體 積比為40 60，使用H3P04調(diào)節(jié)pH到4. 0)，進(jìn)樣量為20 u 1，柱溫為30°C，流速為lml/min, 檢測(cè)波長為283nm。2. 6. 2血漿標(biāo)本預(yù)處理取大鼠血漿標(biāo)本50 ill，用等量溶于0. ImM醋酸鈉緩沖液(pH6. 8)的3 -葡萄糖 醛酸酶H-5(500U/ml)37°C孵育90min，0. 01M草酸100 yl終止酶作用。向反應(yīng)混合物中加 入500iU甲醇渦旋混勻2min，3000Xg離心lOmin，提取上清液體，真空干燥，100 yl甲醇 重懸、3，000 X g離心lOmin，取上清進(jìn)行HPLC檢測(cè)。2. 6. 3分析方法確證本研究代表性HPLC譜圖如圖2所示。配制一定濃度的橙皮苷和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶 液，進(jìn)樣20 yl，得圖2(A)，顯示橙皮苷的保留時(shí)間tK = 20. 38min，橙皮素的保留時(shí)間tK =10. 77min，說明本研究所使用HPLC方法可完全區(qū)分橙皮苷和橙皮素；取大鼠空白血漿 50 u 1，按照血漿樣本預(yù)處理方法2. 6. 2操作，進(jìn)樣20 u 1，得色譜圖2 (B)；將一定濃度橙皮 苷和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到空白血漿中，依照同法操作，得色譜圖2(C)。結(jié)果表明，大鼠 血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾本研究中使用的HPLC方法檢測(cè)橙皮苷和橙皮素。2. 6. 4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍分別取空白血漿50iU，加入橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50iU，配制成 分別相當(dāng)于橙皮苷和橙皮素血漿濃度為0. 002,0. 005,0. 02，0. 05，0. 2，0. 5和1 y mol/L的 樣品，按上述方法進(jìn)行操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰高度為縱坐 標(biāo)，用加權(quán)(W= 1/C2)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得的直線回歸方程即為橙皮苷和橙皮 素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 0. 1676x-0. 0092，r2 = 0. 998 ；橙皮素的標(biāo) 準(zhǔn)曲線方程為y = 0. 1083x-0. 0065,r2 = 0. 998。則由本HPLC測(cè)量方法得到橙皮苷和橙皮 素的線性范圍分別為3. 5 1000nmol/ml和1. 5 1000nmol/ml。2. 6. 5定量下限用空白血漿分別配制濃度為3. 5nmol/L的橙皮苷溶液和1. 5nmol/L的橙皮素溶 液，則分別相當(dāng)于含橙皮苷血漿濃度為3. 5nmol/L和含橙皮素血漿濃度為1. 5nmol/L的樣 品。對(duì)此兩樣品進(jìn)行5樣本分析，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每一樣本測(cè)得濃度。則在此待 測(cè)濃度下，橙皮苷和橙皮素的日內(nèi)精密度(RSD)分別為13. 4%和12.9%，準(zhǔn)確度(RE)分別 為16. 5%和17.8%。結(jié)果表明本研究所使用的HPLC法測(cè)量橙皮苷和橙皮素的定量下限分 別為 3. 5nmol/L 和 1. 5nmol/L。2. 6. 6方法精密度和準(zhǔn)確度取空白血漿50 iU，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍”項(xiàng)下方法制備橙皮素低、中、高濃度 (0. 005,0. 05和0. 8 y mol/L)的質(zhì)量控制樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3天，并 與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，計(jì)算質(zhì)量控制樣品的測(cè)得濃度，將測(cè)得濃度與配制濃度比較計(jì)算得 本研究HPLC測(cè)量方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，橙皮素日內(nèi)精 密度均小于7 %，日間精密度均小于11%，準(zhǔn)確度在士4. 2 %之內(nèi)，說明測(cè)定橙皮素的HPLC分析方法符合有關(guān)國際規(guī)范要求。2.6. 7提取回收率考察取空白血漿50 iU，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍”項(xiàng)下方法制備橙皮素低、中、高濃度 (0. 005,0. 05和O.Symol/L)的質(zhì)量控制樣品，考察樣品提取回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種濃度下 樣品的回收率均>95%。表3檢測(cè)大鼠血漿中橙皮素HPLC方法的精密度和準(zhǔn)確度，(n = 5) 2. 7橙皮苷大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)2. 7.1 口服給藥實(shí)驗(yàn)雄性Wistar大鼠(6周齡，180 220g)試驗(yàn)前一天禁食，試驗(yàn)前稱重，按體重隨 機(jī)分組，每組5只，共分5組，即為橙皮苷提取物組、橙皮苷提取物經(jīng)S. Singularis中提取 BglA蛋白作用組、橙皮苷提取物組經(jīng)表達(dá)于E. coli中BglA蛋白作用組和兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照 組，即橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組。給藥劑量參照中國藥典推薦的陳皮劑量，經(jīng)換 算，用于大鼠的劑量為橙皮苷18. 9mg/kg，橙皮素9. 4mg/kg?？诜o藥后取血時(shí)間分別為灌 胃后0，0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，14和24h。經(jīng)頸靜脈插管采集血液標(biāo)本。血液標(biāo)本采取后 經(jīng)10，000乂8離心21^11，在301^11內(nèi)收集血漿貯存于-20°C。HPLC檢測(cè)前血漿標(biāo)本的預(yù)處 理如前2. 6. 2所述。2. 7. 2靜脈給藥試驗(yàn)雄性Wistar大鼠(6周齡，180 220g)試驗(yàn)前一天禁食，試驗(yàn)前稱重，按體重隨機(jī) 分為5組，每組5只。分組情況和給藥劑量與口服給藥組相同。藥物經(jīng)靜脈給藥前先經(jīng)過 濾，10，OOOXg離心2min，并經(jīng)溶血性檢測(cè)為非溶血性物質(zhì)，再高壓滅菌后靜脈注射。取血 時(shí)間分別為靜脈注射后0，0.5，1，2，4，6，8，12和24h。經(jīng)頸靜脈插管采集血液標(biāo)本。血液標(biāo) 本采取后經(jīng)10，000\8離心2!^11，在30111111內(nèi)收集血漿貯存于_20°C。HPLC檢測(cè)前血漿標(biāo) 本的預(yù)處理如前2. 6. 2所述。2. 8檢測(cè)指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析大鼠血漿總橙皮素檢測(cè)結(jié)果藥物動(dòng)力學(xué)分析采用WinNonlin分析軟件(Version 5. 2Build 200701231637,Pharsight,CA)。藥代動(dòng)力學(xué)各參數(shù)計(jì)算采用非房室模型分析、線 性插值法及標(biāo)準(zhǔn)方程方法，各個(gè)參數(shù)所采用的計(jì)算公式如下所示。分別計(jì)算每只大鼠的血 藥濃度曲線，使用SPSS 11. 5進(jìn)行參數(shù)多組比較的方差分析。
公式 3
公式 4
公式 5結(jié)果3.1 重組質(zhì)粒 pQE30-Xa_bglA 構(gòu)建3. 1. 1獲得目的基因bglA基因利用特異性引物，以S. Singularis總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增bglA基因， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見1785bp片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符，未發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò) 增條帶，如圖3所示。3. 1.2重組質(zhì)粒鑒定3. 1.2. IPCR 鑒定bglA基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切、純化回收后，插入載體pQE_30Xa，轉(zhuǎn)化Ε. co 1 i T0P10。經(jīng)Amp平板篩選后，挑取菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠 電泳后可見1785bp的片段。3. 1.2. 2 酶切鑒定重組質(zhì)粒pQE30-Xa-bglA酶切結(jié)果如圖4所示?？梢妴蚊盖械钠未笮∈强召|(zhì)粒 和基因片段大小之和，而雙酶切的兩條帶與空質(zhì)粒和目的基因片段大小符合。說明重組質(zhì) 粒大小及插入方向是正確的。3. 1.2. 3 測(cè)序鑒定測(cè)序結(jié)果表明bglA目的基因插入正確，符合pQE30_Xa載體的讀碼框架。3. 2 重組質(zhì)粒 pQE30-Xa_bglA 在 E. coll 中的表達(dá)經(jīng)轉(zhuǎn)染bglA基因后，從E. coli M15(pREP4)細(xì)胞中提取的BglA蛋白SDS-PAGE分 析結(jié)果如圖5所示，電泳可見一大小為約為66Kda的明顯條帶。此條帶的分子量大小與由 bglA基因氨基酸序列推導(dǎo)出的分子量期望大小65. 67KD十分符合。在沒有轉(zhuǎn)染bglA基因 的E. coli M15(pREP4)細(xì)胞提取物中沒有檢測(cè)到此明顯蛋白條帶。3. 3BglA蛋白體外水解橙皮苷橙皮苷體外被BglA蛋白水解結(jié)果如圖6所示。橙皮苷空白對(duì)照組中未檢測(cè)到橙皮 素產(chǎn)生。從S. Singularis分離出的BglA蛋白和在E. coli M15(pREP4)中克隆表達(dá)的BglA 蛋白均能將橙皮苷水解為橙皮素，而兩種來源的BglA蛋白水解橙皮苷的情況與β -葡萄糖 苷酶商品對(duì)照組之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)，說明β _葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋 白將橙皮苷由糖苷水解為苷元，而苷元比糖苷具有更強(qiáng)的活性。3. 4單次靜脈給藥后BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化橙皮苷對(duì)大鼠體內(nèi)總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué) 的影響。在既往橙皮苷藥代動(dòng)力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，機(jī)體攝入的橙皮苷和橙皮素經(jīng)吸收代謝 后，人體血漿中主要活性代謝產(chǎn)物是橙皮素葡萄糖醛酸化合物，而其他類型的活性代謝產(chǎn) 物，如橙皮素硫酸酯化合物及橙皮素葡萄糖醛酸硫酸酯化合物在血漿中僅少量存在。其他 橙皮苷藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)如在檢測(cè)血漿藥物濃度前，血漿標(biāo)本不使用β-葡萄糖醛酸酶作用，則將不能在血漿標(biāo)本中檢測(cè)到游離橙皮苷或橙皮素，從而從另一方面說明橙 皮苷攝入后在血漿中并非以原形或其苷元形式存在，而是以代謝化合物形式存在。因此根 據(jù)這些文獻(xiàn)報(bào)道以及目前尚無橙皮素葡萄糖醛酸化合物標(biāo)準(zhǔn)品商品出售的情況，本研究在 HPLC檢測(cè)前，也使用了 葡萄糖醛酸酶作用各血漿標(biāo)本以釋放橙皮苷苷元(見本部分方 法2. 6. 2)，并將0 -葡萄糖醛酸酶水解產(chǎn)物命名為“總橙皮素”。單次靜脈給藥后大鼠體內(nèi)總橙皮素血藥濃度_時(shí)間曲線分析結(jié)果如圖7所示。表4單次靜脈給藥后大鼠體內(nèi)總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(1± 5，n = 5) a橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品的AUCObs之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。b橙皮苷提取物+BlgA蛋白組AUCObs，Vz, CL和橙皮苷提取物對(duì)照組之間的差別 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組幾個(gè)重要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果如表4所示?？梢?靜脈給藥后，橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組AUC值(為61. 5nmol hr/ml)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組的AUC 值(為30. lnmol hr/ml)，可見其相對(duì)生物利用度約是橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組的2倍。橙皮素標(biāo) 準(zhǔn)品組血漿清除率(為0. 56ml/hr)快于橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組(為1. 17ml/hr)，可見此兩組血漿 清除率差別趨勢(shì)與此兩組AUC值差別相一致。但是，橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組分布容積(為5. 40ml) 要比橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組(為10. 73ml)小得多。本研究除了以橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品為 研究對(duì)象，同時(shí)我們也給大鼠注射了經(jīng)或不經(jīng)0 _葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮 苷提取物，而據(jù)本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果BglA蛋白能夠?qū)⒊绕ぼ账鉃槌绕に?。單次靜脈給藥 結(jié)果表明，橙皮苷提取物如不被0 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用，而單獨(dú)注射于大鼠 時(shí)，大鼠血漿總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)變化與橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的類似；而如被葡萄糖苷酶同 工酶BglA蛋白作用，不管是使用從S. Singularis細(xì)胞中提取的還是表達(dá)于E. coli中BglA 蛋白，大鼠血漿總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)變化都與橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品的類似，如表4所示。但是當(dāng)將橙皮苷提取物對(duì)照組與橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組相對(duì)比時(shí)，可見橙皮苷提取物對(duì) 照組血漿總橙皮素的AUC更小、血漿清除率更快、分布容積更大，如表4所示。這一結(jié)果表 明由于本研究所用橙皮苷提取于中藥陳皮，則提取物內(nèi)可能還含有其他植物性化合物，而 這些植物性化合物會(huì)干擾橙皮苷體內(nèi)代謝，從而影響到橙皮苷藥代動(dòng)力學(xué)各參數(shù)數(shù)值。
3. 5單次口服給藥后BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化橙皮苷對(duì)大鼠體內(nèi)總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué) 的影響。本研究不但觀察了大鼠經(jīng)靜脈注射給予經(jīng)或不經(jīng)BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化作用的橙皮 苷提取物的血漿總橙皮素藥動(dòng)學(xué)行為，而且觀察了灌胃給予經(jīng)或不經(jīng)BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化 作用的橙皮苷提取物的血漿總橙皮素藥動(dòng)學(xué)行為，并通過比較相同劑量?jī)煞N給藥途徑后的 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)來計(jì)算大鼠給藥后的絕對(duì)生物利用度，如表5所示。本研究結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組橙皮苷和橙皮素均能被實(shí)驗(yàn)中大鼠吸收。橙皮素標(biāo)準(zhǔn) 品組和兩個(gè)經(jīng)β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物組中，大鼠血漿總橙皮 素達(dá)到最大血藥濃度(Cmax)的時(shí)間約在攝入后4h，明顯短于橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組和橙皮苷提取 物對(duì)照組(Tmax = 6h)，如圖8和表5所示。在橙皮苷提取物對(duì)照組和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組中，藥 物口服2h后才可在大鼠血漿中檢測(cè)到橙皮素，血漿總橙皮素在6h達(dá)到峰值，兩組峰值分別 為0. 20 μ M和0. 35 μ M ；另一方面，在兩個(gè)經(jīng)β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮 苷提取物組中，大鼠血漿總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)變化與橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品的相類似。當(dāng)大鼠攝入 橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品或者經(jīng)生物轉(zhuǎn)化的橙皮苷提取物后，血漿總橙皮素在攝入后30min內(nèi)即可被 檢測(cè)到，三組均在攝入后4h達(dá)到Cmax (分別為0. 82 μΜ,Ο. 74μΜ和0. 95 μ Μ),如表5所示。 可見，此橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組和兩個(gè)經(jīng)β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物組 的Cmax和Tmax水平相類似，認(rèn)為BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化能夠?qū)⒊绕ぼ账鉃槌绕に亍Ａ硗?，由于既往橙皮苷和橙皮素藥代?dòng)力學(xué)方面的研究均是單獨(dú)進(jìn)行，所以本研 究是首次在同一實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的橙皮苷和橙皮素口服給藥及靜脈給藥兩種給藥方式的藥 代動(dòng)力學(xué)平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。綜上可見，當(dāng)靜脈給藥時(shí)，與葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用組相比，橙皮苷 提取物對(duì)照組吸收較慢、AUC值減小約2倍；當(dāng)灌胃給藥時(shí)，橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn) 品組之間的AUC值之間相差3倍，而經(jīng)與不經(jīng)β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用橙皮苷 提取物組間AUC值之間的差別達(dá)到4倍多。灌胃給藥結(jié)果與靜脈給藥結(jié)果相類似的是，由 于橙皮苷提取物中可能還含有其他植物性化合物成分，這些植物性化合物會(huì)干擾橙皮苷體 內(nèi)吸收與代謝過程，因此橙皮苷提取物經(jīng)口服給藥的大鼠藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果與其標(biāo)準(zhǔn)品之間 也存在很大不同。表5單次口服給藥后大鼠血漿總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(7± s，η = 5) a橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品的AUCObs之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。b橙皮苷提取物+BlgA蛋白組AUCObs，Vz, CL和橙皮苷提取物對(duì)照組之間的差別 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。討論本發(fā)明結(jié)果亦顯示此BglA蛋白具有葡萄糖苷酶活性，是葡萄糖苷酶同 工酶，體外可將橙皮苷水解為橙皮素(圖6)。迄今，已克隆表達(dá)出的真菌BglA蛋白均具有 β -葡萄糖苷酶活性，其氨基酸序列分析結(jié)果表明這些真菌的BglA蛋白互相之間具有很高 同源性，表現(xiàn)出的β-葡萄糖苷酶活性均屬于糖基水解酶家族1的B亞科，而此亞科包含的 酶均能夠水解β-葡萄糖苷類。本研究克隆S. singularis的bglA基因，將之與表達(dá)載體 pQE30-Xa相連接組成重組質(zhì)粒pQE-30Xa_bglA，并成功在E. coli中表達(dá)。本發(fā)明體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)真菌菌株的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白對(duì) 橙皮苷具有水解作用，提取自S. singularis菌株和表達(dá)自E. coli菌株的BglA蛋白均可 將橙皮苷水解為橙皮素(圖6)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠通過口服或靜脈給藥方式攝入經(jīng) β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物后，相比較于橙皮苷提取物對(duì)照組， 大鼠體內(nèi)血漿總橙皮素藥代動(dòng)力學(xué)有很大變化(圖7和圖8)，如血漿總橙皮素濃度明顯增 高，達(dá)到最大血藥濃度的時(shí)間Tmax明顯縮短。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)經(jīng)β-葡萄糖苷酶同工酶 BglA蛋白作用的橙皮苷提取物組中，大鼠血漿總橙皮素的藥代動(dòng)力學(xué)與橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組的 相類似，并明顯高于橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品組(表4和表5)。因此，利用葡萄糖苷酶同工酶BglA 蛋白對(duì)陳皮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可提高陳皮中橙皮苷的生物利用度。在本發(fā)明中，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白具有將橙皮苷水 解為其苷元的能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明橙皮苷提取物經(jīng)β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生 物轉(zhuǎn)化后，生物利用度提高。既往經(jīng)Caco-2細(xì)胞模型、大鼠體內(nèi)及人體體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí) 驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)橙皮素比橙皮苷吸收得快。因此結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為相比較于橙皮 苷提取物對(duì)照組，BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化組橙皮苷生物利用度提高是由于在β -葡萄糖苷酶同 工酶BglA蛋白作用下橙皮苷被轉(zhuǎn)化為橙皮素。本發(fā)明使用β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物轉(zhuǎn)化陳皮中的主要活性成分橙 皮苷，口服給藥和靜脈給藥兩種給藥途徑的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果均表明此酶的生物轉(zhuǎn)化作用提 高了橙皮苷的生物利用度，因此本研究方法有助于將苷轉(zhuǎn)化為苷元，消除苷類中藥人群中 應(yīng)用個(gè)體差異，提高苷類中藥生物利用度，進(jìn)而提高苷類中藥藥效。
另一方面，由本研究結(jié)果，苷的最大血藥濃度Cmax相對(duì)較低，而Tmax相對(duì)較長(圖8)，可見橙皮苷的吸收差、排泄快，但是其半衰期較長(6h)。形成此長半衰期的原因首先是 由于橙皮苷吸收相長于橙皮素吸收相(表5)。研究已知機(jī)體內(nèi)只有回腸和結(jié)腸部富含能 夠分泌葡萄糖苷酶的細(xì)菌，所以攝入體內(nèi)的大部分苷(即橙皮苷)需要進(jìn)入回腸和結(jié) 腸代謝后才能被吸收。在回腸和結(jié)腸部，苷被腸道細(xì)菌產(chǎn)生的葡萄糖苷酶水解為相應(yīng) 苷元而被吸收。正是由于苷在吸收前需要先經(jīng)腸道細(xì)菌水解為相應(yīng)苷，而只有在結(jié)腸和回 腸部苷才會(huì)被逐步水解為大量苷元，所以苷攝入后出現(xiàn)相對(duì)較長的Tmax，導(dǎo)致苷的吸收相延 長。 橙皮苷體內(nèi)代謝半衰期較長的另外一個(gè)原因是在體內(nèi)，其苷元橙皮素在被腸道細(xì) 胞吸收后要參與腸道再吸收和肝腸循環(huán)兩個(gè)循環(huán)，本研究結(jié)果亦表明單次攝入橙皮苷時(shí)， 血漿總橙皮素濃度在攝入后24h仍然保持在一定水平(圖7和圖8)。苷被攝入體內(nèi)后，先 被水解為其苷元，繼而苷元被吸收入腸上皮細(xì)胞內(nèi)。在腸上皮細(xì)胞內(nèi)苷元在II相酶作用下 被進(jìn)一步代謝，發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成代謝結(jié)合物，如經(jīng)葡萄糖醛酸化反應(yīng)生成橙皮素葡萄糖 醛酸化合物和經(jīng)硫酸酯化反應(yīng)生成橙皮素硫酸酯化合物。這些代謝化合物生成后一部分被 腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞排泄出體外，而另一部分被重新外排到腸腔中，如圖9所示。在回結(jié)腸 部，這些代謝化合物可被腸道細(xì)菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶或/和硫酸酯酶水解而再次釋 放出苷元，水解釋放出苷元可被重吸收入血液循環(huán)。本研究認(rèn)為相比較于橙皮苷提取物對(duì)照組，β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用 組和橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品組生物利用度提高的另一個(gè)原因是由于苷在體內(nèi)的清除率(clearance， CL)較快。清除率是指單位時(shí)間從體內(nèi)消除的含藥血漿體積或單位時(shí)間從體內(nèi)消除的藥物 表觀分布容積。從研究結(jié)果可知，在口服給藥和靜脈注射給藥這兩種給藥方式下觀察，苷的 CL均快于苷元(表4和表5)。由于本實(shí)驗(yàn)是首次在同一實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)進(jìn)行的橙皮苷及其 苷元藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，所以本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次說明橙皮苷(苷)在體內(nèi)比橙皮素(其苷元) 清除得快。目前研究認(rèn)為造成苷生物利用度低的原因包括苷在腸道細(xì)胞上的低透過性、苷 被細(xì)胞膜上的載體如多重耐藥相關(guān)蛋白(Multidrug resistance-associated protein 2， MPR2)等的外排效應(yīng)、以及當(dāng)苷被消化成苷元而被吸收后的被進(jìn)一步代謝過程’但尚未有關(guān) 于苷的體內(nèi)清除與苷生物利用度低之間關(guān)系的報(bào)道，因此本研究結(jié)果是對(duì)現(xiàn)有苷低生物利 用度現(xiàn)象解釋的補(bǔ)充。綜上所述，本發(fā)明是在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，同時(shí)進(jìn)行橙皮苷及其苷元，同時(shí)進(jìn)行靜脈 給藥和口服給藥的較全面的比較性研究。研究結(jié)果首次表明血漿快速清除率和目前已知的 低透過性、低水溶性、或/和腸道外排作用類似，都與類黃酮苷類的生物利用度低有關(guān)。由 于橙皮苷的苷元，橙皮素比其苷易于吸收、且清除較慢，從而苷元生物利用度高，因此遵循 傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，使用真菌的BglA蛋白作用于陳皮，可使陳皮中橙皮素的含量增多，生物 利用度提高，進(jìn)而增強(qiáng)陳皮的生物活性。在詳細(xì)說明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述 申請(qǐng)專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所 作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說明 書中所舉實(shí)例實(shí)施方式的限制。序列表
〈110〉天津醫(yī)科大學(xué)〈120〉β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途<160>4<210>1 <211>1785bp<212>DNA<213>S. singularis bglA 菌株<400>1atgatgctgc atgcggcact gctcgttgcg ctcccctgcg tggttcttgc tcgtcccgcc60ggtgcagtta cctaccccgg tgcgattcca cttagcttga ccagcaatta cgagacgccg120agtccgaccg ccatccccct ggagccgacc ccaacggcga ccggaaccgc cgaacttgat180gcgctctgga atttggtgga agcacagtac cctgttcaga cggcggctgt caccaccctg240gtgacggtgc ccgacgacta caagtttgaa gcagaccctc cttcctatgc tcttgctggc300tacgagacat cagaaattgc cggcttgaag ttcccgaagg ggttcaagtt tggcgtggcc360ggcgcggcta ttcaagtgga aggcgcagcg aaagcagagg gacgaggccc atccacttgg420gattacttgt gccaccatta cgcgtccaca cagtgcaaca actatgatcc tgacattacg480acgaaccatt actaccttta ccctcttgat ttcgcccggc tccagcatct aggcatcaac540acgtattcgt tttcaatctc ctggactcgt atataccctc tgggtgctgg ctacgttaac600gaagccggtt tggcgcatta cgacgcggta atccactcgg ccaagaagta cgggctggag660cctgtcggaa cagtatttca ctgggacacc cctctcagcc tcatgctcaa atatggcgcg720tggcaagata ccggcgacca gatcgttaaa gatttcgtca catacgccac caccgtcttc780aaacgatacg gtaatgaagt caagacctgg ttcacgttca atgagcctcg cgtgttctgt840tctcaaaaca gtggccttcc ctataacctc acgtatcctg agggaatcaa ctcaacttca900gccgtcttcc ggtgtactta taacgtcctg aaagcccatg gccacgcggt taaggtttac960cgggatctcg ttgccagcgg aaccattgct gctggagaga tcggcttcaa gtcggacgac1020aactacccaa tcccagcgcg gcccggaaac gcggacgacg aggaatccgc caaacgtcac1080gaagcgttcc gaatcggaat ctttgcccag ccagtttacg gaaacggcga ctatcctgat1140gtagtaaaag agaccgttgg cgacatgctg cccgccctga cggatgagga caagggctac1200atcaagggca gcggcgacat cttcgccatt gacggttacc ggaccgatat ctcgcatgcc1260gcactgaatg gaatcgcgaa ttgcatcaga aaccagtcgg accctaactg gcctgtttgc1320gaggaagggt ctgacccgtt cgcccacgta tacccgtctg gtttcgccat cggccagtcc1380gccgatccgc tgtcgtcatg gctcgtcaac tccgccccat ttattcgcga ccagctgaag1440ttcctcactc aaacgtaccc ggcaaaggga ggtatttact tcagcgagtt tgggtgggcc1500gaggatgcgg agtacgaccg ccagctgttg taccaaatca cctgggacgg tcttaggacc1560cagtatctca ctgactacct gtcccaactc ctgctcgccg tccataagga tgggattaat1620cttcgcggcg cgttaacctg gagtttcgtc gacaactggg aatggggact ggggatgcaa1680cagaaattcg gattccagtt tgtcaatcag tcggacccag atctcaccag gaccttcaaa1740ctctctgcgc acgcttacgc tcaatttggt cgcaaccacc tctga1785<210>2
<211>594<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN <222>(1). . (594)<400>2Met Met Leu His Ala Ala Leu Leu Val Ala Leu Pro Cys Val Val Leu151015Ala Arg Pro Ala Gly Ala Val Thr Tyr Pro Gly Ala lie Pro Leu Ser202530Leu Thr Ser Asn Tyr Glu Thr Pro Ser Pro Thr Ala lie Pro Leu Glu354045Pro Thr Pro Thr Ala Thr Gly Thr Ala Glu Leu Asp Ala Leu Trp Asn505560Leu Val Glu Ala Gln Tyr Pro Val Gln Thr Ala Ala Val Thr Thr Leu65707580Val Thr Val Pro Asp Asp Tyr Lys Phe Glu Ala Asp Pro Pro Ser Tyr859095Ala Leu Ala Gly Tyr Glu Thr Ser Glu lie Ala Gly Leu Lys Phe Pro100105110Lys Gly Phe Lys Phe Gly Val Ala Gly Ala Ala lie Gln Val Glu Gly115120125Ala Ala Lys Ala Glu Gly Arg Gly Pro Ser Thr Trp Asp Tyr Leu Cys130135140His His Tyr Ala Ser Thr Gln Cys Asn Asn Tyr Asp Pro Asp lie Thr145150155160Thr Asn His Tyr Tyr Leu Tyr Pro Leu Asp Phe Ala Arg Leu Gln His165170175Leu Gly lie Asn Thr Tyr Ser Phe Ser lie Ser Trp Thr Arg lie Tyr180185190Pro Leu Gly Ala Gly Tyr Val Asn Glu Ala Gly Leu Ala His Tyr Asp195200205Ala Val lie His Ser Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Glu Pro Val Gly Thr210215220Val Phe His Trp Asp Thr Pro Leu Ser Leu Met Leu Lys Tyr Gly Ala225230235240Trp Gln Asp Thr Gly Asp Gln lie Val Lys Asp Phe Val Thr Tyr Ala245250255
Thr Thr Val Phe Lys Arg Tyr Gly Asn Glu Val Lys Thr Trp Phe Thr260265270Phe Asn Glu Pro Arg Val Phe Cys Ser Gln Asn Ser Gly Leu Pro Tyr275280285 Asn Leu Thr Tyr Pro Glu Gly lie Asn Ser Thr Ser Ala Val Phe Arg290295300Cys Thr Tyr Asn Val Leu Lys Ala His Gly His Ala Val Lys Val Tyr305310315320Arg Asp Leu Val Ala Ser Gly Thr lie Ala Ala Gly Glu lie Gly Phe325330335Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Pro lie Pro Ala Arg Pro Gly Asn Ala Asp340345350Asp Glu Glu Ser Ala Lys Arg His Glu Ala Phe Arg lie Gly lie Phe355360365Ala Gln Pro Val Tyr Gly Asn Gly Asp Tyr Pro Asp Val Val Lys Glu370375380Thr Val Gly Asp Met Leu Pro Ala Leu Thr Asp Glu Asp Lys Gly Tyr385390395400lie Lys Gly Ser Gly Asp lie Phe Ala lie Asp Gly Tyr Arg Thr Asp405410415lie Ser His Ala Ala Leu Asn Gly lie Ala Asn Cys lie Arg Asn Gln420425430Ser Asp Pro Asn Trp Pro Val Cys Glu Glu Gly Ser Asp Pro Phe Ala435440445His Val Tyr Pro Ser Gly Phe Ala lie Gly Gln Ser Ala Asp Pro Leu450455460Ser Ser Trp Leu Val Asn Ser Ala Pro Phe lie Arg Asp Gln Leu Lys465470475480Phe Leu Thr Gln Thr Tyr Pro Ala Lys Gly Gly lie Tyr Phe Ser Glu485490495Phe Gly Trp Ala Glu Asp Ala Glu Tyr Asp Arg Gln Leu Leu Tyr Gln500505510lie Thr Trp Asp Gly Leu Arg Thr Gln Tyr Leu Thr Asp Tyr Leu Ser515520525Gln Leu Leu Leu Ala Val His Lys Asp Gly lie Asn Leu Arg Gly Ala530535540Leu Thr Trp Ser Phe Val Asp Asn Trp Glu Trp Gly Leu Gly Met Gln545550555560Gln Lys Phe Gly Phe Gln Phe Val Asn Gln Ser Asp Pro Asp Leu Thr
565570575Arg Thr Phe Lys Leu Ser Ala His Ala Tyr Ala Gln Phe Gly Arg Asn580585590His Leu<210>3<211>28bp
<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcggatcca tgatgctgca tgcggcac28<210>4<211>27bp<212>DNA<213>人工序列<400>4cccaagcttt cagaggtggt tgcgacc2權(quán)利要求
一種編碼β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的基因，該基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種編碼β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶，它具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸 序列。
3.—種重組表達(dá)質(zhì)粒，它含有權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶編 碼基因。
4.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒的載體為pQE30-Xa-bglA。
5.權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶基因在制備提高苷類化合物 生物利用度藥物方面的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶基因在制備提高陳皮中橙皮 苷的生物利用度藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了編碼β-葡萄糖苷酶同工酶BglA的基因SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明利用ATCC標(biāo)準(zhǔn)真菌菌株S.singularis，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，克隆、表達(dá)具有高β-葡萄糖苷酶活性的BglA蛋白，利用其生物轉(zhuǎn)化橙皮苷，將苷轉(zhuǎn)化為苷元，消除苷類中藥人群中應(yīng)用個(gè)體差異，提高苷類中藥生物利用度，進(jìn)而提高苷類中藥有效成分的藥理作用。本發(fā)明首次在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)進(jìn)行橙皮苷和橙皮素的口服給藥和靜脈給藥兩種給藥方式的藥代動(dòng)力學(xué)平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)橙皮素比橙皮苷易于吸收且清除較慢，從而補(bǔ)充了橙皮苷生物利用度低于其苷元的原因。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101864439SQ20091006849
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者張晶, 朱澤, 李偉霞, 李光明, 李詠梅, 杜文才, 胡明 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)