專利名稱：一種培育高α-生育酚大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種培育高a-生育酚大豆的方 法，該方法能將野生型大豆中原來占優(yōu)勢形式的Y-生育酚全部轉(zhuǎn)化成a-生育酚。
背景技術(shù)l維生素E是一類人體所必需的脂溶性維生素，為維持人體正常生理功能所 必需。它能夠清除脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的自由基而穩(wěn)定保護生物膜的磷脂雙分子層，使細胞 免受過氧化物的傷害。因而作為一種抗氧化劑能延緩衰老，維持肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血 管正常代謝，臨床上可用來治療與預(yù)防高血壓、冠心病、心肌梗塞、動脈硬化、血栓、不 孕癥、癌癥等疾病。
維生素E的生產(chǎn)可通過化學(xué)合成和天然提取來獲得?；瘜W(xué)合成的產(chǎn)品主要以醋酸脂的 形式存在，副產(chǎn)物多且生物活性低。隨著生活水平的提高，人們對健康越來越重視，世界 范圍內(nèi)對天然維生素E的需求在不斷增長。天然維生素E僅由植物和某些光合細菌所合成。 生育酚的分布非常廣泛，幾乎存在于所有植物的葉片和種子中，而生育三烯酚的分布卻非 常有限，僅存在于禾本科等少數(shù)植物的種子中。在4種生育酚中，a-生育酚活性最高，是 人體優(yōu)先吸收和利用的形式，因為人體中具有優(yōu)先結(jié)合a-生育酚的a-生育酚結(jié)合蛋白 (a-TTP)，而y6、 y、 &生育酚的活性分別是^生育酚的50%、 10%和3%。不同植物組織中 生育酚的組成和含量不盡相同。在綠色的植物組織中，a-生育酚是含量最豐富的生育酚， 但這些組織中的總生育酚水平卻很低(10-50pg/g鮮重)。與光合組織不同，植物的非綠色 組織如大多數(shù)油料作物的種子，常含有高濃度的總生育酚(500-2000Hg/g鮮重)。然而這 些種子中，活性最高的a-生育酚含量很低，如豆油中，活性最高的a-生育酚含量僅占 7 10%，而活性很低的前體形式，生育酚含量卻高達70%以上，導(dǎo)致維生素E總體活性很 低。
植物維生素E代謝合成途徑提示，Y-生育酚甲基化酶是催化Y-生育酚轉(zhuǎn)化成a-生育酚 的主要酶，該酶在野生型植物種子中的表達受到抑制。將編碼Y-生育酚甲基化酶的基因與 植物種子特異性表達啟動子連接構(gòu)建成植物表達載體，然后轉(zhuǎn)化大豆，可提高大豆種子中 a-生育酚的含量，提高其營養(yǎng)價值，該領(lǐng)域已成為VE代謝工程研究的一個熱點，具有重 要的應(yīng)用價值。這一設(shè)想雖然在理論上可行，但尚未見有培育高a-生育酚大豆方法的報道， 特別是針對環(huán)渤海地區(qū)主栽的高油品種更未見報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種培育高a-生育酚大豆的方法。
本發(fā)明所述的培育高a-生育酚大豆的方法，涉及從甘藍型油菜中分離的Y-生育酚 甲基轉(zhuǎn)移酶基因，核苷酸長度為1044bp，編碼347個氨基酸。
本發(fā)明所述的培育高a-生育酚大豆的方法，涉及將甘藍型油菜Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移 酶基因(GenBank登陸號為DQ508019)與pGl、 pFAEl等種子特異性啟動子進行功能性組 合構(gòu)建成植物表達載體；然后再將帶有Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的植物表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法感染大豆胚尖，經(jīng)含50mg/L卡那霉素培養(yǎng)基連續(xù)抗性篩選獲得再生芽及植株。
采用本發(fā)明的方法培育高a-生育酚大豆，具有取材方便，轉(zhuǎn)化效率高，培養(yǎng)周期短(2個月左右即可獲得轉(zhuǎn)基因植物)，操作簡單，移栽成活率高的特點，且轉(zhuǎn)基因大豆中原有的，生育酚全部轉(zhuǎn)化為a-生育酚。該法同樣適用于其他油料作物維生素E成分的改造。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果
采用本發(fā)明提供的利用甘藍型油菜y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的種子特異性表達載體培育高a-生育酚大豆，具有取材方便，轉(zhuǎn)化效率高，培養(yǎng)周期短(2個月左右即可獲得轉(zhuǎn)基因植物)，操作簡單，移栽成活率高的特點，且轉(zhuǎn)基因大豆原有的"生育酚全部轉(zhuǎn)化為a-生育酚，而普通大豆中a-生育酚含量僅占生育酚總量的7-10% 。該法同樣適用于其他油料作物維生素E成分的改造。

圖1是植物表達載體的示意圖。pGl: Gl啟動子；y-TMT:，生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因；UTT和Nos-T:轉(zhuǎn)錄終止序列；NPTII:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
圖2是大豆胚尖植株再生體系。A胚尖培養(yǎng)在6-BA濃度為3.5mg/L的培養(yǎng)基上;B培
養(yǎng)24h后的胚尖；C胚尖再生出不定芽；D不定芽生長成的小苗。
圖3是轉(zhuǎn)Y-TMT大豆在卡那霉素培養(yǎng)基上的抗性篩選。
圖4是轉(zhuǎn)Y-TMT大豆抗性植株的PCR鑒定。M: DNA分子量標準(bp); 1空白對照2，3:轉(zhuǎn)基因植株；4， 8:野生型植株對照；5:y-TMT質(zhì)粒；6,7:轉(zhuǎn)基因植株；9: FAE1質(zhì)粒。
圖5是移栽成活的轉(zhuǎn)基因大豆。
具體實施方式
實施例1、從甘藍型油菜中分離y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶核苷酸
以甘藍型油菜品系'墾Cr的幼葉為材料，利用天根的RNAsimple Total RNAKit提取葉總RNA，以此為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(Promega)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank已有y-TMT序列，設(shè)計一對兼并引物，TMT-1: 5' ATGAAAGCRACTCTMGCASCAC 3'(R=A或G， M=A或C， S=C或G); TMT-2 5' TTAGAGWGGCTTCTGGCAAGY 3' (W=A或T， Y-C或T)，以cDNA為模板，擴增保守區(qū)間的序列。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，克隆到pMD18-T上，再轉(zhuǎn)化進DH5a-FT。篩選陽性轉(zhuǎn)化子后進行序列測定。
依據(jù)測序結(jié)果，分別設(shè)計3'-RACE引物R3 (5' TATGCCTGACAAGGCCAAG 3')和5'-RACE引物R5 (5' AACTTGGCCTTGTCAGGCATA 3')。以R3和Oligo(dT)-Gan [5'CGCAGAGTC(T)30 3']為引物擴增出y-TMT的3'端。5'端的擴增則先用Smart-5-end (5'GGTATCAACGCAGAGTACGCGGG 3')和TMT-2為引物進行第一輪擴增，再以
4Smart-5-end與R5為引物進行巢式擴增。3'端和5'端序列獲得后，與中間序列拼接成甘藍型油菜y-TMT全長cDNA，命名為S r,，同時在GenBank注冊，注冊號為DQ508019。該基因全長1254 bp， 5'端起始密碼子ATG前有一長為41bp的非編碼區(qū)，3'端終止密碼子TAA后有一長為169bp的非編碼區(qū)，開放閱讀框架長1044bp。編碼347個氨基酸，在N端有一由47個氨基酸組成的葉綠體導(dǎo)肽。在該蛋白質(zhì)的第129-137和第219-228位置上各有一保守的SAM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與報道的其他物種y-TMT有較高的同源性，據(jù)此認定該cDNA是完整的，其編碼的蛋白質(zhì)是依賴SAM提供甲基的y-TMT。
實施例2、含甘藍型油菜，生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的植物表達載體的構(gòu)建
本實例只限于植物表達載體pGlTMT的構(gòu)建
在獲得甘藍型油菜Y-TMT基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計引入限制性內(nèi)切酶位點的引物TMT-P (5' -aaactgcagatgaaagcgactctcgcacc-3'，下劃線為Pst I酶切位點)和TMT-E4(5' -acgcgtcgacttagagaggtttctggcaagtgatg-3'，下劃線為Sal I酶切位點)，以甘藍型油菜全長cDNA為模板擴增Y-TMT全長基因。PCR體系為15 u L，包含3 nmol dNTPs、 1.9pmol兩種引物、0. 375 U Blend Taq DNA聚合酶和2. 0 ng模板DNA。 PCR條件為94。C 5 min;94°C 40 s; 58°C 32 s; 72°C 100 s; 40個循環(huán)；72°C 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，16X:下與pMD18-T過夜連接，再轉(zhuǎn)化進DH5a-FT，然后涂布在含IPTG、 X-gal和氨芐青霉素(50[Xg/mL)的LB篩選平板上，過夜培養(yǎng)。挑選白色轉(zhuǎn)化子，堿法小量提取質(zhì)粒進行質(zhì)粒PCR篩選，陽性轉(zhuǎn)化子再經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析，以檢査插入片段大小及方向，篩選正向插入的克隆命名為pMD18-T-TMT。
用CTAB法(Saghai-Maroof等，1984)提取大豆葉片基因組DNA，根據(jù)GenBank現(xiàn)有大豆球蛋白G7基因的啟動子序列，設(shè)計合成引物Gl-F(5'-ccccMgQfltagcctaagtacgtactcaaaatgcc-3'， 下劃線為i^w^HI酶切位點)禾口 Gl-R(5'-aaaa^tgeagggtgatgactgatgtgttaagg-3'，下劃線為PW I酶切位點)，擴增G7啟動子片段。擴增方法同上。擴增產(chǎn)物同樣經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，/^Kini/尸對I酶切后，與同樣經(jīng)歷mUII/iV I酶切的pMD18-T-TMT重組質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化itDH5a-FT， PCR法和限制性內(nèi)切酶篩選陽性克隆，并將其命名為pMD18-T-Gl-TMT。用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切植物表達載體pBin438，回收大片段，以切除其上的Q增強子和CaMV35S雙啟動子。將G1-TMT片段與pBin438大片段連接，轉(zhuǎn)化進DH5a-FT，涂布到含20 mg/L卡那霉素的LB篩選平板上。PCR及酶切鑒定獲取的陽性重組子，即所構(gòu)建的pGlTMT植物表達載體。實施例3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化1大豆胚尖的組織培養(yǎng)及不同基因型反應(yīng)的差異
選取表面光滑、無病斑、成熟大豆種子，0.1%升滎消毒處理10 min，無菌水洗4~5次后，28。C無菌水浸泡24h。去掉種皮，把下胚軸連同剛萌動的胚尖與兩片子葉剝離，去掉原葉。胚尖向上垂直接種至培養(yǎng)基(MSB+3.5 mg/L 6-BA)上預(yù)培養(yǎng)24 h (溫度25-28°C ，光照16h)，外植體的體積明顯加倍增大，并且呈鮮綠色。然后將其轉(zhuǎn)移至誘芽培養(yǎng)基上
5(1/2MSB+0.2 mg/L6-BA+0.2 mg/LIBA)，每10天繼代一次，20天即可分化出不定芽。1 個月內(nèi)不定芽即可生長成3~5 cm的小苗。
在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中，基因型的選擇是非常重要的環(huán)節(jié)。我們比較了 12種大豆基因型 胚尖再生反應(yīng)的差異，從外植體得率(胚的剝離難易)、外植體再生頻率、再生外植體的 出芽數(shù)、外植體的褐化程度及有無愈傷產(chǎn)生等方面，對其再生能力進行了比較。由表l可 見冀nf37，五星2號，冀豆17，冀豆13和冀豆15的外植體得率和再生頻率比其它品種 較高，而在外植體的再生芽數(shù)方面，冀nf37、冀豆15的平均每個外植體的再生芽數(shù)最多 ，外221、五星1號、中作00484的再生芽數(shù)最少，其他品種的再生芽數(shù)中等。綜合其它 指標，同時考慮冀nf37、五星2號、冀豆13是高油品種，本實驗選擇它們作為后續(xù)遺傳 轉(zhuǎn)化的植物受體。
表1不同大豆基因型胚尖再生能力的比較 大豆品 外植體 再生頻 再生外植體的褐化程 有無愈
種 得率 率 出芽數(shù) 度 傷
外221高85.01.04低有
冀nf37高90.04.07低無
五星2高86.72.96低有
號
冀豆17高85.02.02低無
冀豆13高86.73.04中有
冀豆15高88.34.04中有
五星3中66.72.10低無
號
no5中45.02.98中有
五星l低53.31.10低有
號
冀豆12低58.31.12強無
冀豆16低55.02.09中無
中作低51.70.97中有
00484
2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化
采用凍融法將構(gòu)建好的植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子單菌 落接種至LB(含20 mg/L鏈霉素和100 mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，28°C ， 200 rpm培 養(yǎng)至A(Krl.3， 3000rpm， 4'C離心10min去上清，菌體重懸于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MSB+6 mg/LBAP+200fiM乙酰丁香酮)，調(diào)整v4,至0.5， 28。C侵染預(yù)培養(yǎng)24 h的胚尖20 h。然后轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)基上暗處共培養(yǎng)5 6d。用無菌水沖洗后，再轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基(1/2MSB + 0.2 mg/L 6-BA+ 0.2mg/L IBA+ 300 mg/L頭孢霉素)上25-28。C ，光照培養(yǎng)。6 7天后，再將外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(1/2MSB+0.2 mg/L 6-BA + 0.2mg/L EBA +300 fflg/L頭孢霉素+ 100mg/L卡那霉素)上進行抗性篩選培養(yǎng)，每10d繼代一次。等抗性芽長至3~5cm(大約1個月)將其切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上(l/2MSB+2.0mg/L生根劑)誘導(dǎo)生根，生根率達100%。
實施例4、轉(zhuǎn)基因大豆的分子生物學(xué)分析
本實例只限于轉(zhuǎn)pFAElTMT表達載體轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
用微量CTAB法提取卡那霉素抗性植株葉片的基因組DNA，分別用啟動子片段特異性引物FAE1-F/FAE1-R和y-TMT基因片段特異性引物TMT-P/TMT-E4進行PCR擴增進行進一步的篩選，28株抗性植株中共檢測到3株陽性轉(zhuǎn)化植株，均能擴增出1.0kb的y-TMT基因和0.9kb的FAE1啟動子片段。
轉(zhuǎn)基因植株的HPLC分析
稱取種子0.2~0.58，在液氮中磨碎，轉(zhuǎn)入21111含0.8%丁羥甲苯的酒精中，震蕩，然后7500rpm下離心2min去掉殘渣和碎片。濾液經(jīng)0.2um濾膜過濾，放到2ml炮彈管中-20'C保存，充N2干燥。測定時重新溶解于異辛烷四氫呋喃(85: 15， F/F)。利用Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫科技有限公司)系統(tǒng)測定，層析條件為TCC-100柱，流動相為異辛烷四氫呋喃(97.5:2.5， P7F)，流速固定在1.2 mL，min—、檢測激發(fā)波長為290nm，發(fā)射波長為325nm。取3次平均值。
結(jié)果如表2所示。野生型種子中Y-生育酚、8-生育酚分別占73.2%和17.6%，在轉(zhuǎn)基因植株中，原有的，生育酚全部轉(zhuǎn)化成了a-生育酚，S-生育酚全部轉(zhuǎn)化成了 P-生育酚，這種轉(zhuǎn)化發(fā)生得很徹底，僅其中一個株系中含有微量的y-生育酚。
表2轉(zhuǎn)基因植株中各生育酚的含量
株系總生育酚含量a-生育酚P-生育酚Y-生育酚s-生育酚
(ng/mg種子)(%)(%)(%)(%)
野生型365. 78.40.873.217.6
FAE-1378.289.910.1— —
FAE-2390.687.812.1——
FAE-3386.585.614.20.2SEQUENCE LISTING
<110>南開大學(xué)
<120>—種培育高01-生育酚大豆的方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1254
<212>DNA
<213>油菜(Bra抓'cat C(3t/wpe血.")<400> 1
gagccacatttgttgtttct ccaaccaacc tctcattata aatgaaagcg actctcgcac60
caccctcctctctcataagc ctcccaaggc acaaagtatc ttctctccgt tcaccgtcgc120
ttctccttcagtcccaacgg ccatcctcag ccttaatgac aacgacggca tcacgtggaa180
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1、一種培育高α-生育酚大豆的方法，其特征在于該方法包括1)用一種表達載體轉(zhuǎn)化大豆細胞，所述的表達載體為雙元載體pBin438，啟動子為種子特異性啟動子pG1或pFAE1，含有從甘藍型油菜中分離出γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，GenBank登陸號為DQ508019；2)將帶有γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法感染大豆胚尖，經(jīng)含50mg/L卡那霉素培養(yǎng)基連續(xù)抗性篩選獲得再生芽及植株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的培育高a-生育酚大豆的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化方法是利用大豆胚尖作為外植體，20d即可分化出不定芽，l個月即可長成3 5cm的小苗。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培育高a-生育酚大豆的方法，其特征在于將再生小苗轉(zhuǎn)入含生根劑2mg/L的生根培養(yǎng)基中，生根率達100%，移栽成活率高。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的培育高a-生育酚大豆的方法，其特征在于所述的大豆為環(huán)渤海地區(qū)主栽的高油大豆品種冀nf37、五星2號、冀豆13，這些品種的再生頻率高，是合適的遺傳轉(zhuǎn)化受體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的培育高a-生育酚大豆的方法，其特征在于種子中的原來占優(yōu)勢形式的Y-生育酚全部轉(zhuǎn)化成a-生育酚。
全文摘要
本發(fā)明提供一種培育高α-生育酚大豆的方法，步驟如下從甘藍型油菜中分離出γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，將其與種子特異性啟動子連接構(gòu)建成植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法感染大豆胚尖，經(jīng)含50mg/L卡那霉素培養(yǎng)基連續(xù)抗性篩選獲得再生芽，然后將其轉(zhuǎn)入含生根劑2mg/L的培養(yǎng)基中，生根率達100％。本發(fā)明所提供的方法具有取材方便，轉(zhuǎn)化效率高，培養(yǎng)周期短，操作簡單，移栽成活率高的特點。本發(fā)明所培育的大豆種子中原有的γ-生育酚全部轉(zhuǎn)化為α型。鑒于α-生育酚抗氧化活性高，是人體優(yōu)先利用的形式，因此本發(fā)明所培育的大豆維生素E營養(yǎng)價值高，有助于通過食物鏈使普通民眾均享受到維生素E所帶來的健康福利。該方法也適用于其他油料作物維生素E組分的改造。
文檔編號C12N15/82GK101671693SQ20091006885
公開日2010年3月17日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日 公開號200910068851.9
發(fā)明者明 張, 王永芹, 邢旭光, 陳喜文, 陳德富 申請人:南開大學(xué)