專利名稱：：用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物芯片，特別是涉及用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片。
背景技術(shù)：
：活性污泥是一種十分復(fù)雜的環(huán)境樣品，它是由細(xì)菌等微生物和原生動(dòng)物、后生動(dòng)物等微型動(dòng)物組成的生態(tài)系統(tǒng)，因此，活性污泥具有菌群結(jié)構(gòu)多樣、菌群功能復(fù)雜等特點(diǎn)，而研究活性污泥群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化對(duì)于了解活性污泥菌群分布與功能的關(guān)系、環(huán)境因素改變對(duì)其微生物生態(tài)的影響等則具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的微生物分析測(cè)定方法，包括顯微鏡微生物形態(tài)觀察、最可能計(jì)數(shù)法、選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)、純種分離和生理生化鑒定等，這些方法在環(huán)境樣品研究中都存在選擇性強(qiáng)，工作量大等缺陷且不是所有微生物都能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因此，不能全面客觀的反映復(fù)雜菌群的種類和數(shù)量，據(jù)調(diào)査，培養(yǎng)法只能分離培養(yǎng)到某復(fù)雜菌群0.1%—10%的菌株。近年來，人們開始應(yīng)用微生物生物化學(xué)分類的一些生物標(biāo)記包括呼吸鏈泛醌、脂肪酸等來進(jìn)行純種微生物分析，但由于環(huán)境樣品的復(fù)雜性，該類技術(shù)仍不適合于由多種細(xì)菌組成的環(huán)境樣品菌群分析。目前，環(huán)境樣品微生物菌群研究主要通過DNA指紋圖譜技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，包括變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)、核糖體擴(kuò)增DNA限制性片斷分析(AmplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)、隨意擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)等，這些技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，在不同環(huán)境樣品微生物菌群分析中均有不同程度的應(yīng)用，如SmitE.等利用ARDRA技術(shù)分析了銅污染對(duì)土壤菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響；SusanneL.等則利用DGGE技術(shù)研究了脫氮生物反應(yīng)器中污泥菌群的多樣性；柴麗紅等應(yīng)用DGGE法對(duì)青海相鄰兩鹽湖中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了快速檢測(cè)，RimaB.Franklin等利用RAPD比較區(qū)分了不同水樣的微生物菌群。DNA指紋圖譜技術(shù)相對(duì)培養(yǎng)的方法快速、簡(jiǎn)單，通過DNA指紋區(qū)別圖譜分析可反映出環(huán)境樣品菌群微生物的變化及其狀態(tài)，但是該方法仍存在一定問題，主要有不能提供菌群有關(guān)具體組成和變化的具體詳細(xì)信息、重復(fù)性差等。近年來，也有利用系統(tǒng)寡核苷酸芯片對(duì)堆肥、土壤、活性污泥、鈾污染含水土層等環(huán)境樣品進(jìn)行了微生物檢測(cè)、菌群動(dòng)力學(xué)的報(bào)道，如DeSantis等利用含297，851個(gè)16SrDNA探針的高密度芯片對(duì)三種環(huán)境樣品(水、土壤、氣溶膠)的微生物種類進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該芯片技術(shù)雖然不能鑒定新菌種，但在分析環(huán)境樣品時(shí)能比克隆測(cè)序方法獲得更多的生物多樣性。該技術(shù)雖在一定程度上克服了DNA指紋圖譜技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)或克隆測(cè)序方法的缺陷，但由于有關(guān)研究都是建立在有限的可培養(yǎng)微生物的基礎(chǔ)上，因此提供的菌群種類信息少，不能全面反映環(huán)境樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)，更為關(guān)鍵的是，它不能及時(shí)反映菌群的變化。操作分類單元(OTU，operationaltaxonomicunits)屬于一種分類，位于屬和種之間，目前一般的分類標(biāo)準(zhǔn)是將克隆子序列相似性分別大于80%、85%、90%、92%、94%、97%分別歸于同一個(gè)門、綱、目、科、屬、0UT。截止目前，尚未見利用16SrRNA文庫(kù)構(gòu)建獲得的克隆子設(shè)計(jì)基因芯片探針并制備用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化分析技術(shù)的不足，提供一種信息量大的能敏感、快速用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片，其特征是在玻片或硅片或尼龍膜等材料上固定檢測(cè)細(xì)菌的DNA探針，所述探針為序列表SEQIDNO.1-SEQIDNO.66所述的核苷酸序列，所述探針?biāo)槍?duì)的OTU及其代表克隆子Genbank登錄號(hào)、各OTU最近源菌株及其相似性的關(guān)系如表1;表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>SEQIDNO.140TU30,FJ3485767ZaueraseJe/a"'s，Y17591990TU31,FJ3485857fewerase7e朋"s，Y17591960TU32,FJ348583版臟asp.DNT-1，AB06626296SEQIDNO.470TU32,FJ3485837S朋erasp.DNT-1，AB06626296SEQIDNO.48OTU22,FJ348595叢毛單胞菌科細(xì)菌MWH55,AJ556799990TU34,FJ348586jwfo"iViVar《e^"/7osus菌株0K303，AF48743598SEQIDNO.150TU35,FJ437207脅W,》77.0As"er/歸，TM2，AF14894188SEQIDNO.160TU36'FJ437206未培養(yǎng)的^Ze77oKz力rj'osp.GR2-101，DQ84744589SEQIDNO.17OTU37,FJ3486075ora/^i咖ce〃u7os咖DSM14627，EU240497940TU39,FJ348642辦5^ci/7力a卵on/e/ta，AJ83364795SEQIDNO.180TU37,FJ3486075"ora/wi'wfflce77WosfMDSM14627，EU240497940TU39,FJ348642辦5^o/Aa卵c/7/e"ta,AJ83364795SEQIDNO.490TU38,FJ348640"65^//0朋加/20柳>30^'s咖f朋fsAS03-1，EU29653784SEQIDNO.500TU39,FJ348642^jwo/7力a^acrue/ta,AJ83364795SEQIDNO.51SEQIDNO.19OT,，F(xiàn)J3486325柳/atoasp.M5A，AF11027585SEQIDNO.520TU41,FJ348633Z柳'麼"arfresofe/n'e"w'sW03-356，AM74739395SEQIDNO.530TU42,FJ3486415Ye"otr。/力。/z7o)as鵬7to/7力i7iaG2，EU92714599SEQIDNO.200TU43,FJ348634^SY/"印tococc"5"/zw'"sATCC15914,AY28107699SEQIDNO.540TU44,FJ348630Za"ococcwsraf/7/o7ac"sDSM20443，EF694030990TU45,FJ348637Zsctococci/ssp.Fl16,EF204365930TU46,FJ348612Z:a"oc。c，raf/Y"^"ADSM20443,EF69403094SEQIDNO.210TU44,FJ348630Za"ococ譜raf/i"o/sc"sDSM20443，EF694030990TU46'FJ348612Zs"ococ，ra/yY"o7ac"sDSM20443,EF69403094SEQIDNO.220TU45,FJ348637Zactococc"ssp.F116，EF20436593SEQIDNO.230TU47,FJ348635未培養(yǎng)的fi/力acterAMsp.，AM42221796SEQIDNO.24SEQIDNO.250TU48,FJ348636未培養(yǎng)的5actero/cfessp.LKC3198.17，AY51026294SEQIDNO.26SEQIDNO.550TU49,FJ3486386"e(/////2i6acter/wj!sa7啦"e鵬，EF40787998SEQIDNO.27OT,，F(xiàn)J348629Sec/i/i7/"/力3cter7'咖sa7/B。"e咖，EF40787991SEQIDNO.560TU51,FJ348639未培養(yǎng)的^a"erw'ofe2^s克隆子，CU46672598SEQIDNO.28SEQIDNO.29OTU52'FJ348617未培養(yǎng)的5acteroiofetes克隆子g35，EU97904494SEQIDNO.30OTU53,FJ348616污水處理廠分離的16SrRNA克隆子，CU46673198SEQIDNO.310TU55,FJ348613未培養(yǎng)的細(xì)菌克隆子SXUA031,AY86308195SEQIDNO.570TU56,FJ348643未培養(yǎng)的0^0/7力a《asp.，AM26811996SEQIDNO.580TU57,FJ348631鞘脂桿菌屬細(xì)菌TP498,EF636197940TU58,FJ348645v^7exife"er郷re《雄IFO15974，AB07803888SEQIDNO.320TU59,FJ348628Runellasp.THWCSN44,AM888195960TU60,FJ348647Runellasp.THWCSN44,AM88819594SEQIDNO.590TU61,FJ348618鞘脂桿菌屬細(xì)菌TP524,EF63619993SEQIDNO.33SEQIDNO.600TU62,FJ348621未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33，EU177727960TU65,FJ348615未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33，EU17772793SEQIDNO.340TU62,FJ348621未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33,EU177727960TU65,FJ348615未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33，EU17772793SEQIDNO.350TU63,FJ348620未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr80，EU17773495SEQIDNO.360TU66,FJ348623尸7arafecten'咖cwc'sR2A45-3，EF12699398SEQIDNO.610TU67,FJ348622尸7arate"eW咖sp.THWCSN34，AM88819195SEQIDNO.62SEQIDNO.370TU68,FJ348611C。cc/"/s"》esre/7Z7ico2aIMCC1411,EF10821286SEQIDNO.63SEQIDNO.380TU69,FJ348625#ic_rQ/W7//"a《7yco議/7/ca，ABO1260797OT腦，F(xiàn)J348627未培養(yǎng)的i/3ti-a印or朋^7'aceae克隆子SHBZ911，EU63927799SEQIDNO.390TU69,FJ348625WcrOjRrwi朋^/7COe"/ca,ABO1260797SEQIDNO.64OT腦，F(xiàn)J348627未培養(yǎng)的T/t—ras/or朋《/aceae克隆子SHBZ911，99SEQIDNO.40EU639277SEQIDNO.410TU11,FJ348605尸aracoccwsa7cah'一7usmku-E2，DQ402044910TU71,FJ348648未培養(yǎng)的cy朋o6a"erj'咖屬細(xì)菌克隆子GL2-53,DQ84744195SEQIDNO,420TU72,FJ348626未培養(yǎng)的浮霉?fàn)罹鷮偌?xì)菌克隆子DEL04,AJ61626098SEQIDNO.430TU73,FJ348624未培養(yǎng)的酸桿菌屬細(xì)菌克隆子1013，AF36818099SEQIDNO.65陽性對(duì)照所有真細(xì)菌SEQIDNO.66陽性對(duì)照_所述為操作分類單元:利用本發(fā)明的群落芯片分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化，具有適時(shí)、靈敏、快速、準(zhǔn)確、高效且獲得菌群變化信息量大等特點(diǎn)。本發(fā)明可以快速分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)，同一張芯片可以同時(shí)檢測(cè)代表不同分類層次(門、綱、目、科、屬)的57種0TUs。圖1為耙基因16SrDNA的基因結(jié)構(gòu)示意圖；排列示意圖；圖3為各OTU的特異性圖譜；圖4為不同C/N下的本發(fā)明芯片雜交圖譜。具體實(shí)施例方式本發(fā)明考慮到死亡細(xì)菌RNA的易降解性，因此通過提取RNA進(jìn)行RT-PCR則更能及時(shí)而敏感的反映菌群的動(dòng)態(tài)變化，并且避免死細(xì)菌核酸的干擾。為了更全面的反映活性污泥微生物菌群的組成，本發(fā)明利用活性污泥16SrRNA基因文庫(kù)的克隆子設(shè)計(jì)各操作分類單元(OTU，operationaltaxonomicunits)(屬于一種分類，位于屬和種之間，目前一般的分類標(biāo)準(zhǔn)是將克隆子序列相似性分別大于80%、85%、90%、92%、94%、97%分別歸于同一個(gè)門、綱、目、科、屬、OTU)代表克隆子的特異性探針，并且通過將各OTU的特異性DNA探針按照一定陣列固定在玻片或硅片或尼龍膜等材料組成本發(fā)明的群落芯片。本發(fā)明的一種用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片的技術(shù)利用兩對(duì)通用引物擴(kuò)增并標(biāo)記不同活性污泥樣品中相應(yīng)細(xì)菌的靶基因，擴(kuò)增產(chǎn)物與正常成熟活性污泥的微生物群落芯片雜交后，可以檢測(cè)和分析不同運(yùn)行條件或功能狀態(tài)污泥樣品中細(xì)菌種類的變化。下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例l活性污泥RNA的提取取一定量預(yù)處理后的污泥樣品并加入溶菌酶(20mg/mL)于37'C作用10min后，加入1mLTRIzol(為商品名稱)，漩渦振蕩5min后，10000r/min離心10min;取上清加入200叱氯仿，漩渦振蕩15s后，10000r/min離心10min;取上清并加入等體積異丙醇，-20。C放置20min;10000r/min離心10min，棄上清；加入75%乙醇洗滌沉淀后，10000r/rain離心5min，棄上清并風(fēng)干沉淀；經(jīng)少量焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解核酸沉淀后，加入脫氧核糖核酸酶I(無核糖核酸酶污染)并于37'C作用15min;進(jìn)一步采用RNA純化試劑盒純化RNA。其中，所有耗材都要經(jīng)過DEPC處理及高壓滅菌。實(shí)施例2活性污泥菌群待分析菌株16SrRNA基因片段的獲得(1)利用cDNA試劑盒(Tiangen，中國(guó))獲得活性污泥總cDNA;(2)采用細(xì)菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')直接擴(kuò)增總cDNA中的細(xì)菌16SrDNA片段；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)iy。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara，中國(guó))回收目的片段；(4)通過TA克隆技術(shù)將擴(kuò)增的16SrDNA片段轉(zhuǎn)化到E.coliDH5d中，藍(lán)白斑篩選挑取450個(gè)陽性克隆子，建立16SrDNA克隆文庫(kù)；(5)采用RFLP方法對(duì)克隆子進(jìn)行分析，選出酶切帶譜不同的重組子進(jìn)行測(cè)序；(6)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用Blast搜索程序從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16SrRNA基因序列。采用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，將克隆子序列相似性大于97%的歸于同一個(gè)操作分類單元(OTU)并將不同OTU的代表序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并獲得核酸序列注冊(cè)登錄號(hào)。(7)選擇各OTU的代表克隆子為研究對(duì)象，以pMD18-T載體通用引物(BcaBESTPrimerRV-M:5，-GAGCGGATAATTTCACACAGG-3，與BcaBESTPrimerM13-47:5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3')為上游引物和下游引物，利用PCR獲得活性污泥菌群待分析菌株16SrRNA基因片段。實(shí)施例3通用引物的設(shè)計(jì)以16SrRNA基因?yàn)榘一?圖1)(1)采用DNAMAN軟件，對(duì)活性污泥樣品16SrRNA文庫(kù)各0TU代表克隆子進(jìn)行序列比對(duì)。得到堿基序列比對(duì)(2)根據(jù)堿基序列比對(duì)圖，在16SrRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物；根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和活性污泥各0TU代表變異區(qū)域存在位點(diǎn)，分別選擇含有V3可變區(qū)的410-600bp區(qū)域(A區(qū)域)和含有V5、V6可變區(qū)的860-1130區(qū)域(B區(qū)域)為PCR擴(kuò)增區(qū)域。所述引物為2對(duì)，分別為<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例4探針的設(shè)計(jì)群落基因芯片技術(shù)是一種反相固相雜交技術(shù)，其菌群分析功能主要依賴芯片上所固定的特定探針，探針的序列和種類是制備基因芯片的關(guān)鍵。1)采用DNAMAN軟件，對(duì)活性污泥樣品16SrRNA文庫(kù)各OTU代表克隆子進(jìn)行序列比對(duì)。得到堿基序列比對(duì)2)根據(jù)堿基序列比對(duì)圖，在16SrRNA基因的V3、V5和V6區(qū)域設(shè)計(jì)探針；設(shè)計(jì)出各OTU探針后，將候選序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，篩選出特異性較好的探針并在其5'端加入由15個(gè)T組成的斷臂分子同時(shí)5'末端氨基化修飾。實(shí)施例5用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片的制備在玻片或硅片或尼龍膜等材料上固定檢測(cè)細(xì)菌的DNA探針，所述探針為序列表SEQIDNO.1-SEQIDNO.66所述的核苷酸序列，所述探針?biāo)槍?duì)的OTU及其代表克隆子Genbank登錄號(hào)、各OTU最近源菌株及其相似性的關(guān)系如表1;1.探針排列見圖2，在圖2中1，20TU2;30TU3;4,5OTU5;6OTU7,12;7OTU8,9;8，90TU13;10OTU16;11,44OTU17;120T謂；13OTU22;14OTU30，31,32;15OTU35;160TU36;17，180TU37，39;19OTU40;20OTU43;21OTU44，46;22OTU45;23,24OTU47;25，260TU48;27OTU50;28，560TU51;29OTU52;30OTU53，54;31OTU55;32OTU59，60;33,59OTU61;34,60OTU62,65;35OTU63;36OTU66;37,63OTU68;38,39OTU69;40,64OTU70;41OTUll,71;42OTU72;43OTU73;45OTU20;46OTU23;470TU32;48OTU22,34;49,OTU38;50,51OTU39;520TU41;53OTU42;54OTU44,45,46;55OTU49;57OTU56;58OTU57,58;61,62OTU67;65,66陽性對(duì)照；67,陰性對(duì)照(50%DMSO).2.基因芯片的制備過程采用50%二甲基亞砜溶解探針，使其終濃度為llag/pL，然后依次轉(zhuǎn)移到384孔板中，將其置于基因芯片點(diǎn)樣儀(Spotarray72)上。啟動(dòng)Spotarmy的控制軟件，運(yùn)行程序，按照?qǐng)D2所示的排布方式將各探針點(diǎn)在醛基化的玻片上的點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，點(diǎn)之間的距離為5mm，每種探針重復(fù)點(diǎn)樣3次。將點(diǎn)好樣的芯片室溫下過夜干燥后，在45'C的烘箱內(nèi)干燥2h，用交聯(lián)儀(UVPcl-2000MultracioletCrosslinker)600J交聯(lián)2次后即可使用。實(shí)施例6熒光待測(cè)樣品的制備1.cDNA第一條鏈的合成采用隨機(jī)引物獲得活性污泥樣品總cDNA。RT反應(yīng)體系5XAMVbuffer4叱隨機(jī)引物(10pmolA4j1叱dNTP(10pmol/PL)2叱AMV(5U/叱)1叱Rnase抑制劑(40U/叱)0.5叱模板(RNA)5叱加入DEPC處理水至反應(yīng)體系總體積為20叱。反應(yīng)條件42。C延伸60min后，72。C處理10min。2.樣品的熒光標(biāo)記方法樣品的熒光標(biāo)記采用不對(duì)稱PCR法。不對(duì)稱PCR由兩輪完成。第1輪反應(yīng)體系如下所示。待第1輪反應(yīng)完成后，將200^LPCR產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化并最后定容至50iaL，具體方法按說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系A(chǔ)l或Bl(10pmol/nL)1pLA2或B2(10pmol/nL)1pLTaqmix25pL模板(總cDNA或各OTU的16SrRNA基因片段)5iiL或lpL加入ddH20至反應(yīng)體系總體積為50叱。PCR反應(yīng)條件:94°C，5min;94°C，25s，55°C，25s，72°C，25s,30個(gè)循環(huán);72°C，5min。第2輪反應(yīng)條件同上。PCR反應(yīng)體系A(chǔ)2或B2(10pmol批)2Taq0.3dNTP(10mmol/L)0.25pLCy3標(biāo)記的dUTP(25nmo1)0.35XPCRbuffer5pL模板(純化后的一輪PCR產(chǎn)物)40|nL加入ddH20至反應(yīng)體系總體積為50叱。實(shí)施例7芯片雜交和檢測(cè)將A、B區(qū)域二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各1pL與8pL雜交液(UnihybTelechem公司)混合后，點(diǎn)到基因芯片上探針陣列區(qū)域(載玻片已放入雜交盒并蓋上蓋片)，注意蓋片與載玻片之間不可留有氣泡，同時(shí)向盒內(nèi)加入100^iL水以保持濕度。擰緊雜交盒并放入50。C水浴鍋內(nèi)保溫60min后取出雜交盒，拿出玻片，依次將玻片分別放入WBA(1XSSC，10%SDS)、WBB(0.05XSSC，腦SDS)、WBC(0.05XSSC)洗脫液中各洗滌1min。采用Genepixpersonal4100A生物芯片掃描儀對(duì)雜交后的微生物群落芯片進(jìn)行信號(hào)掃描和檢測(cè)，結(jié)果分析軟件及版本為GenepixPro6.0，掃描分辨率為10ym，掃描結(jié)果分別保存為.tiff和.jpg格式。各OTU特異的雜交圖譜見圖3。實(shí)施例8用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片的應(yīng)用將用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片與發(fā)生污泥膨脹之前不同階段(通過改變進(jìn)水水質(zhì)C/N實(shí)現(xiàn)污泥膨脹，進(jìn)水C/N分別為16(I)、41(11)、43(III)、49(IV)、52(V))的污泥PCR產(chǎn)物與同一張芯片上的不同陣列進(jìn)行雜交，觀察污泥膨脹過程中菌群變化情況。不同C/N下的本發(fā)明芯片雜交圖譜結(jié)果見圖4。序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所〈120〉用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片〈160〉66<210〉1〈211〉20<212>腿〈213>人工合成<220>〈221〉gene<222〉(1)…(20)〈400〉1tcctttctcgcaagagacac20<210>2〈211〉18〈212>DNA<213〉人工合成〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)…(18)〈400>2gtgaccgttccagagatg18〈210>3〈211〉18〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉gene<222〉(1)…(18)<400>3tatcgcggcctcagagat18〈210〉4<211>18<212>DNA<213〉人工合成〈220>〈221〉gene<222〉(1)…(18)<400>4ttagcgaccgactccgaa1813<210>5<211〉20〈212〉DNA<213>人工合成<220>〈221〉gene〈222〉(1)…(20)<400>53g肪atgglCgCg333Ct3gg20〈210>6〈211>16<212〉DNA〈213〉人工合成<220〉〈221〉gene〈222>(1)…(16)〈400〉6tgccacgacgacttcc16〈210>7<211〉15<212〉薩〈213>人工合成〈220>〈221〉gene〈222〉(1)…(15)〈400>7cggtcgcggtttcca15<210〉8〈211〉20<212〉DNA<213〉人工合成〈220〉〈221〉gene<222〉(1)…(20)〈400〉8gcgtgttacccagagagatt20〈210>9〈211〉19<212〉DNA<213>人工合成〈220>〈221〉gene<222>(1)…(19)<400>9atttggggtccacttcggt19<210〉10〈211>23〈212>廳〈213〉人工合成<220>〈221〉gene<222>(1)…(23)〈400>10gtgatcgtaggtttcagaaatgt23<210〉11〈211〉19<212>醒〈213〉人工合成〈220〉〈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"num="0001"wi="174"></tables><tablesid="tabl0002"num="0002"wi="156"></tables><tablesid="tabl0003"num="0003"wi="170"></tables>所述OTU為操作分類單元。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的群落芯片，是在玻片或硅片或尼龍膜等材料上固定檢測(cè)細(xì)菌的DNA探針，所述探針為序列表SEQIDNO.1-SEQIDNO.66所述的核苷酸序列，所述探針?biāo)槍?duì)的OTU及其代表克隆子Genbank登錄號(hào)、各OTU最近源菌株及其相似性的關(guān)系如表1；利用本發(fā)明的群落芯片分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化，具有適時(shí)、靈敏、快速、準(zhǔn)確、高效且獲得菌群變化信息量大等特點(diǎn)。本發(fā)明可以快速分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)，同一張芯片可以同時(shí)檢測(cè)代表不同分類層次(門、綱、目、科、屬)的57種OTUs。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101633954SQ20091007001公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2009年8月3日優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日發(fā)明者李君文,王新為,王景峰,諶志強(qiáng),邱志剛,敏金,陳照立申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所