專利名稱：：一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，涉及多菌種的共同發(fā)酵，尤其一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法。
背景技術：
：在許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中，由微生物的群居形成多菌、多酶組成共酵體系，多菌種或酶進行隨時更替，協(xié)同發(fā)酵，人工的方法很難達到其發(fā)酵效果。以醬油發(fā)酵生產(chǎn)為例，醬油因其獨特、渾厚、濃郁的風味而著稱，在食品加工與調(diào)理過程中起著調(diào)整色、香、味、體的作用，營養(yǎng)全面而豐富，醬油的生產(chǎn)是以植物蛋白和碳水化合物為主要原料，經(jīng)過微生物酶的作用，發(fā)酵水解生成多種氨基酸及各種糖類，并以這些物質(zhì)為基礎，再經(jīng)過復雜的生物化學變化，形成具有特殊色澤、香氣、滋味和體態(tài)的調(diào)味品，雖然對醬油的生產(chǎn)己有數(shù)千年的歷史，但是對其中各菌種的具體作用以及他們之間化學協(xié)同作用過程還處于不斷的研究階段。目前，日本的醬油生產(chǎn)主要以高鹽稀態(tài)工藝為主，產(chǎn)品分為濃口醬油、淡口醬油、白醬油、甘露醬油等，其中以濃口醬油產(chǎn)量最大，其具有濃郁的醬香味和獨特的醇香，體態(tài)澄清，久置無沉淀。從上世紀70年代開始，日本在設備更新、微生物研究、技術開發(fā)以及工藝改革等方面都有很大的發(fā)展，就國際市場而言，日本已確立了其在高檔醬油市場中的地位。中國的醬油市場經(jīng)過幾輪的行業(yè)整合和國內(nèi)、國際資本整合之后，已經(jīng)從一個相對滯后的行業(yè)，大跨越地轉(zhuǎn)型為激烈的市場競爭行業(yè)。隨著消費的不斷升級，市場競爭的加劇，醬油表現(xiàn)出向高檔化發(fā)展的趨勢，中高檔市場容量在進一步擴大，品牌產(chǎn)品的市場份額進一步提高，隨著國家對調(diào)味品行業(yè)的不斷規(guī)范，產(chǎn)品的技術含量日益增強，產(chǎn)品質(zhì)量得到進一步提高，但是與日本相比還存在一定的差距。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種根據(jù)透析培養(yǎng)原理建立的快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，本方法可用于探索和研究自然發(fā)生并存在的多菌共酵體系中的生物及化學變化，并具有操作簡便、技術可靠的特點。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，方法的步驟是(1)目標菌種的選擇、活化與擴大培養(yǎng)；(2)透膜發(fā)酵裝置的建立將經(jīng)過處理和檢測的透析膜制成透析袋，將透析袋一端封住，另一端接在去掉底部的有蓋離心管上以制成小發(fā)酵室，選擇一容器作'為大發(fā)酵室，將小發(fā)酵室置于大發(fā)酵室中，制成透膜發(fā)酵裝置；(3)多菌種的共酵在透膜發(fā)酵裝置的大、小發(fā)酵室中分別裝入發(fā)酵液，在小發(fā)酵室中分別接入不同的目標菌種，置于目標菌種的最適溫度下繼續(xù)進行發(fā)酵，通過測定不同透膜發(fā)酵裝置中菌種數(shù)量及發(fā)酵物質(zhì)理化動態(tài)指標，然后比較各指標得到各菌種在共酵過程中的最佳添加量和添加時間，進而確定最佳的發(fā)酵條件。而且，所述透析膜為再生纖維素透析膜。而且，所述透析膜的檢測方法為先用0.1%美藍、0.1。/。玫瑰紅B、0.1%水溶性苯胺藍分別測試，單項比例為4:1，IO分鐘后吸取透析膜內(nèi)的溶液，觀察色素透過情況，然后測定葡萄糖半數(shù)透析時間ET50。而且，所述測定葡萄糖半數(shù)透析時間ET50步驟為取5%葡萄糖溶液加入燒杯中，透析膜內(nèi)為蒸餾水單項透析比為4:1，間隔0.5小時測定一次葡萄糖濃度。而且，所述透膜發(fā)酵裝置的透析比4:1。而且，所述菌種數(shù)量的測定方法分別為乳酸菌計數(shù)用雙層平板稀釋傾注計數(shù)法，酵母計數(shù)用普通平板計數(shù)法、乳酸菌計數(shù)或雙層平板計數(shù)法。而且，所述發(fā)酵物質(zhì)理化指標的動態(tài)分析包括發(fā)酵物質(zhì)的pH、還原糖含量、總酸含量、乙醇含量以及有機酸含量變化分析。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為1、本發(fā)明可以得到多菌種發(fā)酵過程中主要微生物的最佳添加(繁殖與衰減)時間、添加量，能夠有效地控制pH的變化，掌握總酸和還原糖等的變化規(guī)律，進而合理調(diào)整釀造工藝，充分發(fā)揮醬醪中各種酶的生物作用，形成更多的風味物質(zhì)，協(xié)調(diào)發(fā)酵產(chǎn)品的口味，使中國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品得到真正傳承和發(fā)展。2、本發(fā)明在合理選擇透析膜基礎上建立透膜發(fā)酵裝置，采用透過分子量適宜的再生纖維素透析膜制成若干小發(fā)酵室，各小發(fā)酵室置于一大發(fā)酵室中，小發(fā)酵室分別接入不同的微生物后置于大發(fā)酵室在適宜的條件下發(fā)酵，其優(yōu)點是各菌種能單獨發(fā)酵，不干擾其營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的自由流通和相互融合，該裝置還可有效探明多菌種發(fā)酵體系的各種微生物之間的生物量和主要代謝物的產(chǎn)量變化，發(fā)現(xiàn)其中各種微生物間的拮抗和協(xié)同調(diào)節(jié)作用，進而優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量和出品率。3、采用本發(fā)明的方法得到了醬油發(fā)酵過程中耐鹽乳酸菌和酵母菌的最佳添加時間與添加量，具體為在高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵前期添加耐鹽乳酸菌和T酵母，中前期添加S酵母，前期乳酸菌可以促進T酵母的生長，后期可以與S酵母相互促進，添加耐鹽乳酸菌能有效控制pH值的下降，有利于醬醪中蛋白酶對原料蛋白類的分解，其中還原糖的變化呈平緩下降的趨勢、酒精含量呈平穩(wěn)上升的趨勢，經(jīng)過調(diào)節(jié)最終得到風味豐富的成熟醬醪。圖1為本發(fā)明耐鹽乳酸菌細胞形態(tài)照片(2040倍，放大800倍)；圖2為本發(fā)明T酵母細胞形態(tài)照片(20x40倍，放大800倍)；圖3為本發(fā)明S酵母細胞形態(tài)照片(20x40倍，放大800倍)；圖4為本發(fā)明多菌種透膜發(fā)酵裝置；圖5為本發(fā)明空白對照氣相色譜圖6為本發(fā)明添加耐鹽乳酸菌氣相色譜圖。具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。需要首先說明的是:本實施例以生產(chǎn)醬油的過程為例來說明本多菌種間透膜發(fā)酵方法的實施，采用耐鹽乳酸菌、T酵母和S酵母等優(yōu)良菌株為發(fā)酵菌株，上述菌種均由天津科技大學菌種保藏中心提供，同時本方法不僅限于醬油生產(chǎn)，也適合其它多菌共酵的發(fā)酵生產(chǎn)，進行菌種間最佳發(fā)酵條件的探索。一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法(1)目標菌種的選擇、活化與擴大培養(yǎng)①耐鹽乳酸菌的擴大培養(yǎng)菌種—活化培養(yǎng)10mL/管3(TC48h"^擴大培養(yǎng)以5%的接種量200mL/300mL三角瓶3(TC培養(yǎng)24h)，其形態(tài)見圖l。②耐鹽酵母的擴大培養(yǎng)(包括T、S酵母)試管菌種~~>斜面活化培養(yǎng)3(TC48h)——級培養(yǎng)10mLYEPD液體培養(yǎng)30°C培養(yǎng)2411_^級振蕩培養(yǎng)100mL/250mL三角瓶，接種量為10%，30°C培養(yǎng)20h—三級振蕩培養(yǎng)200mL/500mL三角瓶，接種量為10%，30°C培養(yǎng)16h，其形態(tài)見圖2、3。(2)透膜發(fā)酵裝置的建立①透析膜的處理將分子量為8000-14000道爾頓的再生纖維素透析膜置于500mL含lmmol/LEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉pH8.0)的2^碳酸氫鈉溶液中煮沸10min后，再經(jīng)蒸餾水煮沸、漂洗后即可使用。②透析膜(袋)通透性的測定用0.1%美藍(分子量373)，0.1。/。玫瑰紅B(分子量479),0.1%水溶性苯胺藍(分子量737)分別測試，單項比例為4:1，IO分鐘后吸取透析膜內(nèi)的溶液，觀察色素透過情況。③葡萄糖半數(shù)透析時間(ET50)的測定取5%葡萄糖溶液加入燒杯中，透析膜內(nèi)為蒸餾水單項透析比為4:1，間隔0.5小時測定一次葡萄糖濃度，經(jīng)測定葡萄糖半數(shù)透析時間(ET50)為1小時40分鐘。④透膜發(fā)酵裝置的制作將透析袋一端封住，另一端接布去掉底部的有蓋離心管上，制成小發(fā)酵室，選擇適當?shù)娜萜髯鳛榇蟀l(fā)酵室，其中包含四個小發(fā)酵室，制成透析比4:l的透膜發(fā)酵裝置，見圖4。(3)多菌種的共酵本實施例中為耐鹽乳酸菌與S、T酵母菌的共酵①在5組透膜發(fā)酵裝置中分裝入發(fā)酵醬醪汁后，在小發(fā)酵室內(nèi)按照設定的時間分別接種目的菌，置于目的菌種的最適溫度下繼續(xù)進行發(fā)酵，通過以下方法有效評價與分析，得到各菌在發(fā)酵中的最佳添加量和添加時間。,將高鹽稀態(tài)前期發(fā)酵醬醪，均勻分裝5個容器中，模擬生產(chǎn)發(fā)酵條件，放到15'C的生化培養(yǎng)箱讓其發(fā)酵，每天攪拌一次，到醬醪發(fā)酵的15d，添加菌種，其中耐鹽酵母的加入量均為1()S個/mL，耐鹽乳酸菌的添加量均為1(^個/mL。每周二、周五攪拌兩次，此后，每天將溫度提升rC，到醬醪發(fā)酵30d溫度達到并保持在3(TC，到發(fā)酵90d左右醬醪發(fā)酵溫度控制在25'C直到發(fā)酵結束，整個發(fā)酵周期為180d，添加的時間和順序如下1號樣品為發(fā)酵的第15d添加T酵母、發(fā)酵的第45d添加S酵母；2號※樣品(注※標記為最佳工藝)為發(fā)酵的第15d同時添加耐鹽乳酸菌和T酵母、發(fā)酵的第45d添加S酵母；3號樣品為發(fā)酵的第15d添加耐鹽乳酸菌、第30d添加T酵母、發(fā)酵的第45d添加S酵母；4號樣品為發(fā)酵的第15d添加T酵母、第30d添加耐鹽乳酸菌、發(fā)酵的第45d添加S酵母；5號樣品添加方法為發(fā)酵的第15d添加耐鹽乳酸菌。②酵母菌與乳酸菌生長速率評價酵母計數(shù)以普通平板計數(shù)法；乳酸菌計數(shù)以雙層平板稀釋傾注計數(shù)法分別計數(shù)，酵母計數(shù)普通平板計數(shù)法、乳酸菌計數(shù)、雙層平板計數(shù)法。③理化指標的檢測及最佳工藝的生產(chǎn)條件的確定pH的測定，還原糖含量的測定，總酸含量的測定，乙醇含量的測定均采用常規(guī)分析方法。有機酸的測定采用高效液相色譜方法，條件為色譜柱HydrosphereC18250><4.6mml.D，流動相0.02mol/LKH2P04(磷酸調(diào)pH為3.0)，檢測波長215nm，流速0.5mL/min，進樣量20nL。15種主要風味物質(zhì)生成量比較發(fā)酵結束后各樣品主要風味物質(zhì)的氣相色譜測定，結果表明，各個樣品檢測出的主要風味物質(zhì)略有不同，特色風味物質(zhì)的含量差異較大，只有2號※樣品中的這些物質(zhì)比例相對協(xié)調(diào)合理，它不但含有突出的特色味道更賦予產(chǎn)品濃郁的酒香氣和酯香氣，統(tǒng)計圖譜中已知峰和未知峰數(shù)量，也可以明顯看出，香氣總數(shù)也是2號※樣品最多為127種，見附圖5、6，以及表l、2。(4)檢測結果為耐鹽乳酸菌、S、T酵母菌在醬醪發(fā)酵中的生物量動態(tài)曲線及pH值、總酸、氨基態(tài)氮、還原糖、酒精、無鹽固形物等理化指標的動態(tài)曲線均表明2號※樣品為最佳，即菌種最佳添加時間為在高鹽稀態(tài)醬醪前期發(fā)酵15d添加耐鹽乳酸菌和T酵母；中前期45d添加S酵母為最佳，最佳添加量為發(fā)酵前期醬醪汁中添加耐鹽乳酸菌為104個/mL,分別添加耐鹽T酵母和S酵母1()S個/mL。耐鹽乳酸菌的添加有效控制了pH值的下降，且始終保持在4.8以上，還原糖的變化呈平緩下降的趨勢、酒精含量呈平穩(wěn)上升的趨勢。表1發(fā)酵結束的醬醪主要風味物質(zhì)的含量(mg/100g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2發(fā)酵結束各樣品產(chǎn)香氣總數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，其特征在于方法的步驟是(1)目標菌種的選擇、活化與擴大培養(yǎng)；(2)透膜發(fā)酵裝置的建立將經(jīng)過處理和檢測的透析膜制成透析袋，將透析袋一端封住，另一端接在去掉底部的有蓋離心管上以制成小發(fā)酵室，選擇一容器作為大發(fā)酵室，將小發(fā)酵室置于大發(fā)酵室中，制成透膜發(fā)酵裝置；(3)多菌種的共酵在透膜發(fā)酵裝置的大、小發(fā)酵室中分別裝入發(fā)酵液，在小發(fā)酵室中分別接入不同的目標菌種，置于目標菌種的最適溫度下繼續(xù)進行發(fā)酵，通過測定不同透膜發(fā)酵裝置中菌種數(shù)量及發(fā)酵物質(zhì)理化動態(tài)指標，然后比較各指標得到各菌種在共酵過程中的最佳添加量和添加時間，進而確定最佳的發(fā)酵條件。2、根據(jù)權利要求1所述的一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，其特征在于所述透析膜為再生纖維素透析膜。3、根據(jù)權利要求1所述的一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，其特征在于所述透析膜的檢測方法為先用0.1%美藍、0.1。/。玫瑰紅B、0.1%水溶性苯胺藍分別測試，單項比例為4:1，IO分鐘后吸取透析膜內(nèi)的溶液，觀察色素透過情況，然后測定葡萄糖半數(shù)透析時間ET50。4、根據(jù)權利要求3所述的一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，其特征在于所述測定葡萄糖半數(shù)透析時間ET50步驟為取5%葡萄糖溶液加入燒杯中，透析膜內(nèi)為蒸餾水單項透析比為4:1，間隔0.5小時測定一次葡萄糖濃度。5、根據(jù)權利要求1所述的一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，其特征在于所述透膜發(fā)酵裝置的透析比4:1。6、根據(jù)權利要求1所述的一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，其特征在于所述菌種數(shù)量的測定方法分別為乳酸菌計數(shù)用雙層平板稀釋傾注計數(shù)法，酵母計數(shù)用普通平板計數(shù)法、乳酸菌計數(shù)或雙層平板計數(shù)法。7、根據(jù)權利要求1所述的一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，其特征在于所述發(fā)酵物質(zhì)理化指標的動態(tài)分析包括發(fā)酵物質(zhì)的pH、還原糖含量、總酸含量、乙醇含量以及有機酸含量變化分析。全文摘要本發(fā)明涉及一種快速多菌種間透膜發(fā)酵的方法，步驟是(1)目標菌種的選擇、活化與擴大培養(yǎng)；(2)透膜發(fā)酵裝置的建立；(3)多菌種的共酵。通過本發(fā)明的方法可以得到多菌種發(fā)酵過程中主要微生物的最佳添加(繁殖與衰減)時間、添加量，能夠有效地控制pH的變化，掌握總酸和還原糖等的變化規(guī)律，進而合理調(diào)整釀造工藝，充分發(fā)揮醬醪中各種酶的生物作用，協(xié)調(diào)發(fā)酵產(chǎn)品的口味，形成更多的風味物質(zhì)，使中國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品得到真正傳承和發(fā)展。文檔編號C12P1/00GK101649329SQ20091007038公開日2010年2月17日申請日期2009年9月8日優(yōu)先權日2009年9月8日發(fā)明者侯麗華,曹小紅,王春玲,魯梅芳申請人:天津科技大學