專利名稱：：與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的氯離子通道基因片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的氯離子通道基因片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肌內(nèi)脂肪是指肌纖維之間或肌纖維內(nèi)部沉積的脂肪，它與肉質(zhì)密切相關(guān)，是影響肉質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。肌內(nèi)脂肪沉積量的增加可以顯著改善肉的多汁性、色澤、風(fēng)味、嫩度和持水力等指標(biāo)，一般認(rèn)為豬肉肌內(nèi)脂肪沉積量為3.0%的肉質(zhì)較好。由于對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)理了解很少，這一性狀還沒有有效的遺傳標(biāo)記(或分子標(biāo)記)。鑒于肌內(nèi)脂肪沉積這一性狀的遺傳復(fù)雜性，目前在選育中還無法對(duì)這一性狀進(jìn)行有效地選擇，只能利用肌內(nèi)脂肪沉積量高的地方豬種與瘦肉型豬雜交，來提高商品豬的肌內(nèi)脂肪沉積量。由于目前肌內(nèi)脂肪沉積的遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制還不清楚，豬選育中肌內(nèi)脂肪沉積量缺乏可行的選擇指標(biāo)，通常只能通過個(gè)體的B超和后裔的屠宰試驗(yàn)測(cè)定來評(píng)估肌內(nèi)脂肪沉積量。雖然B超法相對(duì)超聲波法有較大改進(jìn)，但由于不了解肌內(nèi)脂肪沉積的遺傳學(xué)規(guī)律，所以在選育中效果一直不理想，達(dá)不到預(yù)期目標(biāo)。另一方面，我國地方豬種的選育程度較低，同一豬種內(nèi)部也包涵豐富的遺傳多樣性，因此利用地方豬種與瘦肉型豬雜交來提高商品豬肌內(nèi)脂肪沉積量、改善肉品質(zhì)的效果參差不齊，無法穩(wěn)定有效地發(fā)揮我國地方豬種肉質(zhì)優(yōu)良的遺傳潛力。由于缺乏有效的選育手段，目前利用雜交選育方法在肌內(nèi)脂肪沉積上難以獲得突破，地方豬種與瘦肉型豬的雜交優(yōu)勢(shì)也難以在隨后的繼代選育中得到保持和固定。總之，就目前的選育和飼養(yǎng)手段而言，增加肌內(nèi)脂肪沉積量即意味著增加皮下脂肪的沉積、瘦肉率降低，因此如何在保持較少皮下脂肪的同時(shí)增加肌內(nèi)脂肪沉積量，是目前肉質(zhì)調(diào)控所面臨的難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與豬肌內(nèi)脂肪沉積量相關(guān)的DNA片段及其應(yīng)用。本發(fā)明提供與豬肌內(nèi)脂肪沉積量相關(guān)DNA片段是序列表的序列1所示的DNA片段。含有所述DNA片段的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增所述DNA片段的全長(zhǎng)及其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)具體可為序列表中的序列3和序列表中的序列4。含有所述引物對(duì)的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述DNA片段可應(yīng)用于輔助檢測(cè)豬肌內(nèi)脂肪沉積量和豬的育種。本發(fā)明還提供了一種輔助檢測(cè)豬肌內(nèi)脂肪沉積量的方法，是檢測(cè)待測(cè)豬的基因型為AA基因型、AB基因型還是BB基因型；所述AA基因型是待測(cè)豬的總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含有序列1所示DNA片段而不含有序列2所示DNA片段的樣本；所述朋基因型是待測(cè)豬的總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含有序列2所示DNA片段而不含有序列1所示DNA片段的樣本；所述AB基因型是待測(cè)豬的總脂A的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含有序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段的樣本。待測(cè)豬中肌內(nèi)脂肪沉積量自高至低依次為AA基因型的豬、AB基因型的豬、BB基因型的豬。所述檢測(cè)待測(cè)豬的基因型的方法具體可為將待測(cè)豬的總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。通過以下標(biāo)準(zhǔn)判讀待測(cè)豬的基因型如果擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種，為序列1所示DNA片段，待測(cè)豬為AA基因型；如果擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種，為序列2所示DNA片段，待測(cè)豬為BB基因型；如果擴(kuò)增產(chǎn)物為序列1所示DNA片段和序列2所示畫A片段的混合物，待測(cè)豬為AB基因型。所述待測(cè)豬具體可為榮昌豬。所述方法可應(yīng)用于豬的育種。本發(fā)明提供了與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的氯離子通道基因片段以及應(yīng)用該DNA片段輔助檢測(cè)豬肌內(nèi)脂肪沉積量的方法。本發(fā)明提供的DNA片段與豬肌內(nèi)脂肪沉積量具有非常顯著的相關(guān)性。與傳統(tǒng)方法相比，應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)出生仔豬進(jìn)行檢測(cè)，可及早預(yù)測(cè)待測(cè)豬的肌內(nèi)脂肪沉積量，并可實(shí)現(xiàn)早選，縮短選育時(shí)間，極大地減少選育費(fèi)用。同時(shí)，本發(fā)明的方法是直接針對(duì)具有效應(yīng)的功能DNA片段進(jìn)行選擇，提高了選育準(zhǔn)確性，減少了人力物力的浪費(fèi)。本發(fā)明具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實(shí)施例1、與豬肌內(nèi)脂肪沉積量相關(guān)的DNA片段的發(fā)現(xiàn)一般而言，榮昌豬肌內(nèi)脂肪沉積量約為4.0%-5.0%，是瘦肉型豬的2倍左右。在重慶榮昌進(jìn)行日糧賴氨酸/消化能比值對(duì)榮昌豬肌內(nèi)脂肪沉積影響的飼養(yǎng)試驗(yàn)和屠宰試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有個(gè)別榮昌豬肌內(nèi)脂肪超級(jí)沉積，肌內(nèi)脂肪沉積量可以達(dá)到8.8%-9.1%，幾乎是普通榮昌豬的l倍。利用豬的Affymetrix(Affymetrix,Inc.,USA)寡核苷酸芯片，對(duì)肌內(nèi)脂肪超級(jí)沉積的榮昌豬的背最長(zhǎng)肌組織的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜進(jìn)行掃描，得到若干DNA片段作為備選片段。一、DNA片段的擴(kuò)增根據(jù)備選片段中的一個(gè)設(shè)計(jì)引物對(duì)如下上游引物(序列表的序列3):5，-CAGAAAGAACATCCAGGACC-3，；下游引物(序列表的序列4):5'-CTTAGCACAGGCATGACGAT-3'。以1000頭60kg的榮昌豬的肌肉組織的cDNA為模板，利用所述引物對(duì)進(jìn)行PC財(cái)廣增。PCR擴(kuò)增條件(D94。C，4min;(2)94°C，30s;(3)54.2°C，30s;(4)72°C，40s;(5)Goto(2)35cycles;72°C，8min。二、DNA片段的序列測(cè)定與分析①PCR產(chǎn)物切膠、純化回收將100叱PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠呈像儀(VilberLourmat，Tex-20LM，F(xiàn)rance)下切膠，利用膠回收試劑盒(北京盈信陽光生物技術(shù)有限公司，北京)回收純化。②與T載體連接，反應(yīng)體系如下T一vector1PLc薩4PLLigationmix_5PL合計(jì)10叱16'C水浴過夜，16h，得到連接產(chǎn)物。③轉(zhuǎn)化用100叱DH5a感受態(tài)細(xì)胞(寶生物工程(大連)有限公司)，加10PL連接產(chǎn)物；冰浴30min，42。C水浴熱激90s，冰浴2-5min;每管加800叱LB液體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)lh;100-150叱培養(yǎng)液涂板，37。C培養(yǎng)12h。挑20個(gè)單個(gè)菌落劃線，37'C培養(yǎng)12h。④序列分析每個(gè)樣本取4-5個(gè)菌斑，用滅菌牙簽挑起，投入含有篩選培養(yǎng)基(在5mlLB液體培養(yǎng)基中加入IO叱濃度為100mg/ml的氨芐青霉素)的滅菌試管中，封好塞子，放入搖床，37°C、255r/min過夜，分裝菌液，送三博遠(yuǎn)志科技有限公司(北京)1000個(gè)樣本中83個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物只有一種，PCR產(chǎn)物為序列表的序列1所示的DNA片段，將其命名為AA基因型；500個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物只有一種，PCR產(chǎn)物為序列表的序歹"2所示的DNA片段，將其命名為BB基因型；333個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物為序列1所示的DNA片段和序列表的序列2所示的DNA片段的混合物，將其命名為AB基因型。三、DNA片段與豬肌內(nèi)脂肪沉積量的相關(guān)性分析檢測(cè)步驟一的83頭AA基因型的豬、500頭BB基因型的豬和333頭AB基因型的豬的背最長(zhǎng)肌組織中的肌內(nèi)脂肪沉積量。檢測(cè)結(jié)果表明AA基因型豬的肌內(nèi)脂肪沉積量最高，達(dá)8.15%;AB基因型豬的肌內(nèi)脂肪沉積量約為4.5y。；BB基因型豬的肌內(nèi)脂肪沉積量最低，約為2.9%。結(jié)果分析鑒于不同基因型的豬肌內(nèi)脂肪沉積量差異顯著的情況，該基因型確實(shí)是導(dǎo)致我國地方豬肌內(nèi)脂肪沉積呈多樣性的主要原因。實(shí)施例2、與豬肌內(nèi)脂肪沉積量相關(guān)的DNA片段的應(yīng)用以36頭90kg的榮昌豬的肌肉組織的cDNA為模板，利用如下引物對(duì)進(jìn)行PC財(cái)廣增上游引物(序列表的序列3):5，-CAGAAAGAACATCCAGGACC-3，；下游引物(序列表的序列4):5，-CTTAGCACAGGCATGACGAT-3，。然后檢測(cè)該36頭榮昌豬的背最長(zhǎng)肌組織中的肌內(nèi)脂肪沉積量，結(jié)果見表1。表l90kg不同基因型榮昌豬肌內(nèi)脂肪的沉積量(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>相同字母表示基因型間差異不顯著，不同字母表示基因型間差異顯著。在90kg榮昌豬中，同樣是AA基因型的豬肌內(nèi)脂肪沉積量最高，AB基因型的次之，BB基因型的豬肌內(nèi)脂肪沉積量最低。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120〉與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的氯離子通道基因片段及其應(yīng)用〈130〉CGG膽Y92028〈160〉4<210〉1<211〉355<212〉飄<213〉豬屬豬(Sus)<400〉1atcc3gg3cca^taMattgatttggtttggcttgtttgcttttaMggc60gacttgcc犯ttgctgaattaalcagcdtgttagtgtcca120aaetELCtcctctggggagctattccacccgggggagctactctacctgggggacctaactc180C3CCtgggggagctaactccacctgggggagctaactccacctgggggsgctattccacc240tgggcatcctcttttctctgtcgctggctgtgtt"tctcaggtatacttca300ctctgtgggtctcagga^aigtaaactgcctcttagatcgtcatgcctgtg355〈210〉2〈211〉334〈212〉DNA<213〉豬屬豬(Sus)<400〉2caga犯ga^catccaggacc^t^tattgatttggtttggcttgtttgcttttaaaggc60tgtgtttaaagacttgccaattgctgaattaatc8gceitgttagtgtcca1207aaaactcctctggggagctattccacccgggggagctactctacctagaagagctactct180acctgggggacctactccacctgggggagctattccacctgggcatcctcttttctctgt240cgctggctgtgtttctcaggtatacttcaagaacagcacctctgtgggtctcaggaaagt300aaactgcctcttagatcgtcatgcctgtgctaag334〈210〉3<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉〈400〉3cagaaagaacatccaggacc20〈210〉4〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉4cttagcacaggcatgacgat20權(quán)利要求1、核苷酸序列為序列表的序列1所示的DNA片段。2、含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。3、擴(kuò)增權(quán)利要求1或2中所述DNA片段的全長(zhǎng)及其任一片段的引物對(duì)。4、如權(quán)利要求3所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)為序列表中的序列3和序列表中的序列4。5、權(quán)利要求1所述DNA片段在輔助檢測(cè)豬肌內(nèi)脂肪沉積量和豬的育種中的應(yīng)用。6、含有權(quán)利要求3或4所述引物對(duì)的試劑盒。7、輔助檢測(cè)豬肌內(nèi)脂肪沉積量的方法，是檢測(cè)待測(cè)豬的基因型為AA基因型、AB基因型還是BB基因型；所述AA基因型是待測(cè)豬的總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含有序列1所示DNA片段而不含有序列2所示DNA片段的樣本；所述BB基因型是待測(cè)豬的總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含有序列2所示DNA片段而不含有序列1所示DNA片段的樣本；所述AB基因型是待測(cè)豬的總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含有序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段的樣本。8、如權(quán)利要求7所示的方法，其特征在于所述檢測(cè)待測(cè)豬的基因型為AA基因型、AB基因型還是BB基因型的方法為將待測(cè)豬的總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用權(quán)利要求3或4所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。9、如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待測(cè)豬為榮昌豬。10、權(quán)利要求7至9中任一所述的方法在豬的育種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的氯離子通道基因片段及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的與豬肌內(nèi)脂肪沉積量相關(guān)的DNA片段是序列表的序列1所示的DNA片段。本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述DNA片段輔助檢測(cè)豬肌內(nèi)脂肪沉積量的方法。本發(fā)明提供的DNA片段與豬肌內(nèi)脂肪沉積量具有非常顯著的相關(guān)性。與傳統(tǒng)方法相比，應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)出生仔豬進(jìn)行檢測(cè)，可以及早獲知待測(cè)豬的肌內(nèi)脂肪沉積量，并可以實(shí)現(xiàn)早選，縮短選育時(shí)間，極大地減少選育費(fèi)用。同時(shí)，本發(fā)明的方法是直接針對(duì)具有效應(yīng)的功能DNA片段進(jìn)行選擇，提高了選育的準(zhǔn)確性，減少了人力物力的浪費(fèi)。本發(fā)明具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。文檔編號(hào)C12N15/12GK101463353SQ200910076200公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2009年1月13日優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日發(fā)明者飛任,尹靖東,尼健君,李鳳娜,李德發(fā),馬潤(rùn)林申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)