專利名稱：制備降解木質(zhì)纖維素的酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備降解木質(zhì)纖維素的酶的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素由木質(zhì)素、半纖維素和纖維素組成，是潛在的可再生資源,可以被 降解產(chǎn)生二糖或單糖。單糖本身就是一種能源物質(zhì)，其還可以被加工成醇等其它能
源物質(zhì)。木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的天然有機(jī)物，占植物界碳含量的50°/。以上， 其來源廣泛，如棉花、木材、麻、麥稈、稻草、甘蔗渣等都是纖維素的豐富來源。 在當(dāng)今能源緊迫的形勢下，降解木質(zhì)素既能產(chǎn)生能源物質(zhì)，又能變廢為寶，是個一 舉雙得的事情。
近年來，木質(zhì)纖維素降解己成為研究的熱點(diǎn)。降解木質(zhì)纖維素的方法有水解、 氧化、生物分解等。對于木質(zhì)纖維素的生物分解，以往的研究多集中在純化菌或酶 的分離。但在人工培養(yǎng)條件下，依靠純培養(yǎng)微生物、酶等難以直接分解天然木質(zhì)纖 維素。目前生產(chǎn)中木質(zhì)纖維素的降解效率還不高，遠(yuǎn)沒有達(dá)到生產(chǎn)需求，因此需要 尋找一種高效降解木質(zhì)纖維素的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備降解木質(zhì)纖維素的酶的方法。
本發(fā)明所提供的制備降解木質(zhì)纖維素的酶的方法，包括如下步驟用培養(yǎng)基I 培養(yǎng)經(jīng)過處理的秸稈，得到培養(yǎng)物I ，從所述培養(yǎng)物I中得到降解木質(zhì)纖維素的酶; 所述培養(yǎng)基I的組成為每升所述培養(yǎng)基I中含有蛋白胨4-6g，酵母提取物 0. 8-1.2g， NaCl 4-6g， K2HP040 . 8-1. 2g， MgS047 H200. 30-0. 40g， CaC032 . 5- 3 . 5g， 秸稈O. 1-0.2g，溶劑為水。
所述培養(yǎng)基I優(yōu)選為每升所述培養(yǎng)基I中含有所述蛋白胨5g，所述酵母提取 物lg，所述NaCl 5g，所述K2HP04lg，所述MgS04 7H20 0, 35g，所述CaC033g，所 述秸稈O. 15g，溶劑為水。
所述培養(yǎng)的條件包括溫度為28-32'C、好氧、pH值為6.8-7.2;所述溫度優(yōu) 選為3(TC，所述pH值優(yōu)選為7.0。
所述培養(yǎng)的條件還可包括振蕩；所述振蕩的速度為120-180rpm/min，旋轉(zhuǎn)半徑為13mm;所述振蕩的速度優(yōu)選為150 rpm/min。
所述方法中，所述從培養(yǎng)物I中得到降解木質(zhì)纖維素的酶的方法可包括如下步
驟將所述培養(yǎng)物i接種于培養(yǎng)基n中進(jìn)行再次培養(yǎng)，得到培養(yǎng)物n，從培養(yǎng)物n 中得到降解木質(zhì)纖維素的酶；所述培養(yǎng)基n的組成為每升所述培養(yǎng)基n中含有胰
蛋白胨8-12g，牛肉膏8-12g，酵母粉2.5-3.5g， NaCl 4-6g，半胱氨酸鹽酸鹽 0.45-0.55g，醋酸鈉2. 5-3. 5g ， CaC03 2. 5-3. 5g，秸稈9-12g，溶劑為水。
所述培養(yǎng)基n優(yōu)選為每升所述培養(yǎng)基n中含有所述胰蛋白胨io.og，所述牛
肉膏10.0g，所述酵母粉3g，所述NaCl 5.0g，所述半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g，所述醋 酸鈉3.0g，所述CaC03 3.0g，所述秸稈10. 5g,溶劑為水。
所述再次培養(yǎng)的條件可為溫度為33-35°C、好氧、pH值為7. 0-7. 4、培養(yǎng) 時間為40-56小時；所述溫度優(yōu)選為34i:，所述pH值優(yōu)選為7.2;所述培養(yǎng)時間 優(yōu)選為48小時。
其中，所述處理的方法為將所述秸稈堆成垛，在溫度為-2(TC至2(TC、相對濕 度為20-30%的條件下放置至秸稈腐爛。
所述秸稈具體可為稻草、麥秸、玉米稈、高梁稈、花生藤、紅薯藤、大豆稈、 酒糟、甘蔗渣、甜菜渣等。
由上述任一所述方法制得的降解木質(zhì)纖維素的酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本 發(fā)明方法中是以秸稈等為原料制備得到酶的，由生物本身產(chǎn)酶特點(diǎn)(即同一種生物 會產(chǎn)生多種酶)決定，本方法制得的酶應(yīng)該是一種復(fù)合酶系。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法制得的酶的活性高，純度高，分解木質(zhì)纖維素的效率高， 糖耗少，能將纖維素有效的轉(zhuǎn)化為糖，副產(chǎn)物少，實(shí)現(xiàn)了能源再生，突破了以往方 法無法分解天然纖維素的局限；同時該方法還具有成本低廉、操作簡單的特點(diǎn)。因 此，本發(fā)明方法在降解纖維素方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 木質(zhì)纖維素由木質(zhì)素、半纖維素和纖維素組成。
蛋白胨購自北京化學(xué)試劑公司，產(chǎn)品目錄號為10014938;酵母提取物購自北京 化學(xué)試劑公司，產(chǎn)品目錄號為69024894;胰蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé) 任公司，產(chǎn)品目錄號為01-002;牛肉膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品目錄號為01-009;酵母粉購自北京化學(xué)試劑公司，產(chǎn)品目錄號為69024994;
實(shí)施例1、降解木質(zhì)纖維素的酶的制備
將秸稈進(jìn)行如下處理將水稻秸稈堆積成垛，然后在一2(TC至+ 2(TC溫度、相 對濕度為20-30%條件下放置3年以上，直至垛底部的秸稈腐爛；取腐爛的秸稈作為 樣品來制備酶。
1、 初步培養(yǎng)取上述腐爛的秸稈5.0 g，將其接種到盛有150 ml培養(yǎng)基I和 l個l era X 6 cm濾紙條的500 ral三角瓶中，在如下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為30 。C、好氧、pH值為7. 0、以150rpm/min的速度振蕩，旋轉(zhuǎn)半徑為13mm;當(dāng)濾紙條 顏色變?yōu)辄S色時即濾紙條被降解時，將三角瓶中的培養(yǎng)物以5%的體積比接種到盛有 150 ml培養(yǎng)基I和1個1 cm X 6 cm濾紙條的500 ml三角瓶中，在溫度為30°C、 好氧、pH值為7.0、以150 rpra/min的速度振蕩的條件下培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)半徑為13mm， 當(dāng)濾紙條顏色變?yōu)辄S色時即濾紙條被降解時，將培養(yǎng)物以5%的體積比接種到盛有 150 ml培養(yǎng)基I和1個1 cm X 6 cm濾紙條的500 ml三角瓶中，在相同條件下培 養(yǎng)；如此傳代培養(yǎng)；
期間對每代中培養(yǎng)物對秸稈的分解率和培養(yǎng)物降解木質(zhì)纖維素的酶比活進(jìn)行 測定，測定方法如下
培養(yǎng)物對秸稈的分解率的測量方法分別稱量分解前和分解后的秸稈重量，按 照下述公式計(jì)算得到分解率分解率=(分解前的秸稈重量-分解后的秸稈重量)/ 分解前的秸稈重量。
培養(yǎng)物降解木質(zhì)纖維素的酶比活的測定方法培養(yǎng)物經(jīng)0. 22Mffl濾膜過濾作為 粗酶液，用于測定酶活。酶活定義為lmin內(nèi)產(chǎn)生ly g葡萄糖所需要的還原能力 為一個單位(U)。以(IUPAC)推薦測定酶活的方法測定，分別以2%微晶纖維素 粉末Avicel (Merck Germany) 、 15. OmM纖維二糖、50mg Whatman No. 1濾紙為底 物，測定內(nèi)切酶、外切酶、e-糖苷酶和總纖維素酶活性，用檸檬酸鉀鈉緩沖液稀 釋酶液，于50° C反應(yīng)30min-120min，加3. OmlDNS，劇烈煮沸5. Omin用于比色。 測定儀器為Varian公司CARY100Bio型紫外分光光度計(jì)540 nm波長下比色，采用 水楊酸DNS顯色。以不同濃度的葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
當(dāng)培養(yǎng)物對秸稈的分解率大于等于60%、培養(yǎng)物降解木質(zhì)纖維素的酶比活大于 等于400U/ml時，取此代的培養(yǎng)物進(jìn)行如下再次培養(yǎng)。
2、 再次培養(yǎng)取步驟l中分解率為70%、酶比活為600U/ml的培養(yǎng)物，將其以5%的體積比接種于培養(yǎng)基(1)，在34"、好氧、靜止、pH值為7.2的條件下 培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)液I;再將培養(yǎng)液I以5%的體積比接種到培養(yǎng)基11， 34°C、好 氧、靜止、pH值為7.2的條件下培養(yǎng)48小時，得到培養(yǎng)液II;
培養(yǎng)基(1)的組成為每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨5g,酵母提取物lg， NaC15g， K臭lg， MgS04'7H20 0 . 35g， CaC033g，溶劑為水。
培養(yǎng)基I的組成為每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨5g，酵母提取物lg， NaCl 5g， K2HPCUg， MgS04 7H20 0. 35g， CaC033g，水稻秸稈0. 15 g，溶劑為水。
培養(yǎng)基II的組成為每升培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母 粉3g， NaCl 5.0g,半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，醋酸鈉3. Og， CaC03 3. Og， 10. 5g高 溫滅菌的玉米秸稈，溶劑為水；pH用NaOH調(diào)節(jié)至7.2。
3、 酶的提取及酶比活測定將培養(yǎng)液II以4000g的速度離心10niin，取上清， 即得降解木質(zhì)纖維素的酶的粗提液；
酶比活測定方法同步驟1中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果測得所得粗提液中降解木質(zhì)纖維素的酶 的比活為1000U/ml粗提液。
4、 粗提液的濃縮
用冷凍干燥法對粗提液進(jìn)行濃縮，步驟如下
向步驟3得到的粗提液中加入DMSO，使DMSO在粗提液中的終濃度為1% (體 積百分含量) ，進(jìn)行預(yù)凍、干燥，得到酶制劑；將酶制劑密封保存，可在室溫下避 光長期J)G存，需要使用時，加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液，即可恢復(fù)到凍干前的 狀態(tài)。
實(shí)施例2、降解木質(zhì)纖維素的酶的制備
將秸稈進(jìn)行如下處理將玉米秸稈堆積成垛，然后在一2(TC至+ 2(TC溫度、相 對濕度為20-30%條件下放置3年以上，直至垛底部的秸稈腐爛；取腐爛的秸稈作為 樣品來制備酶。
1、初步培養(yǎng)取上述腐爛的秸稈5.0 g，將其接種到盛有150 ml培養(yǎng)基I和 l個l cm X 6 cm濾紙條的500 ml三角瓶中，在如下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為28 "C、好氧、pH值為6. 8、以120rpm/min的速度振蕩，旋轉(zhuǎn)半徑為13mm;當(dāng)濾紙條 顏色變?yōu)辄S色時即濾紙條被降解時，將三角瓶中的全部培養(yǎng)物以5%的體積比接種到 盛有150 ml培養(yǎng)基I和1個1 cm X 6 cm濾紙條的500 ml三角瓶中，在溫度為
728°C、好氧、pH值為6.8、以120 rpm/min的速度振蕩的條件下培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)半徑為 13mra，當(dāng)濾紙條顏色變?yōu)辄S色時即濾紙條被降解時，將培養(yǎng)物以5%的體積比接種到 盛有150 ml培養(yǎng)基I和1個1 cm X 6 cm濾紙條的500 ml三角瓶中，在相同條
件下培養(yǎng)；如此傳代培養(yǎng)；
期間對每代中培養(yǎng)物對秸稈的分解率和培養(yǎng)物中降解木質(zhì)纖維素的酶的比活
進(jìn)行測定，測定方法分別與實(shí)施例1中所述一致。
當(dāng)培養(yǎng)物對秸稈的分解率大于等于60%、培養(yǎng)物降解木質(zhì)纖維素的酶比活大于 等于400U/ml時，取此代的培養(yǎng)物進(jìn)行如下再次培養(yǎng)。
2、 再次培養(yǎng)取步驟l中分解率為60%、酶比活為500U/ral的培養(yǎng)物，將其 以5%的體積比接種于培養(yǎng)基(1)，在33'C、好氧、靜止、pH值為7.0的條件下 培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)液I;再將培養(yǎng)液I以5%的體積比接種到培養(yǎng)基11，在33i:、 好氧、靜止、pH值為7.0的條件下培養(yǎng)40小時，得到培養(yǎng)液II;
培養(yǎng)基(l)的組成為每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨4g，酵母提取物0. 8g， NaCl 4g， K2HP040 . 8g， MgS047 H20: 0. 30g， CaC032 . 5g，溶劑為水。
培養(yǎng)基I的組成為每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨4g，酵母提取物0. 8g， NaCl 4g， K2HP040 . 8g， MgS047 H20: 0. 30g， CaC032 , 5g，水稻秸稈0. lg，溶劑為水。
培養(yǎng)基II的組成為每升培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨8.0g，牛肉膏8.0g，酵母粉 2. 5g， NaCl 4. 0g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 45g，醋酸鈉2. 5g， CaC03 2. 5g， 9. 0g高溫 滅菌的水稻秸稈，溶劑為水；pH用NaOH調(diào)節(jié)至7.0。
3、 酶的提取及酶活測定將培養(yǎng)液II以4000g的速度離心10min，取上清，即 得降解木質(zhì)纖維素的酶的粗提液；
酶活測定方法同步驟1中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果測得所得粗提液中降解木質(zhì)纖維素的酶 的比活為600U/ml粗提液。
4、 粗提液的濃縮 與實(shí)施例1中所述一致。
實(shí)施例3、降解木質(zhì)纖維素的酶的制備
將秸稈進(jìn)行如下處理將大豆秸稈堆積成垛，然后在一2(TC至+ 2(TC溫度、相 對濕度為20-30%條件下放置3年以上，直至垛底部的秸稈腐爛；取腐爛的秸稈作為 樣品來制備酶。1、 取上述腐爛的秸稈5. 0 g，將其接種到盛有150 ral培養(yǎng)基I禾P 1個1 cm X 6 cin濾紙條的500 ml三角瓶中，在如下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為32°C、好氧、pH 值為7.2、以180rpm/min的速度振蕩，旋轉(zhuǎn)半徑為13mm;當(dāng)濾紙條顏色變?yōu)辄S色 時即濾紙條被降解時，將三角瓶中的全部培養(yǎng)物以5%的體積比接種到盛有150 ml 培養(yǎng)基I和l個l cm X 6 cm濾紙條的500 ml三角瓶中，在溫度為32°C、好氧、 pH值為7.2、以180rpm/min的速度振蕩的條件下培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)半徑為13 ，當(dāng)濾紙 條顏色變?yōu)辄S色時即濾紙條被降解時，將培養(yǎng)物以5%的體積比接種到盛有150 ml 培養(yǎng)基I和l個l cm X 6 cm濾紙條的500 ml三角瓶中，在相同條件下培養(yǎng)；如 此傳代培養(yǎng)；
期間對每代中培養(yǎng)物對秸稈的分解率和培養(yǎng)物降解木質(zhì)纖維素的酶活進(jìn)行測 定，測定方法分別與實(shí)施例1中所述一致。
當(dāng)培養(yǎng)物對秸稈的分解率大于等于60%、培養(yǎng)物降解木質(zhì)纖維素的酶比活大于 等于400U/ml，取此代的培養(yǎng)物進(jìn)行如下再次培養(yǎng)。
2、 再次培養(yǎng)取步驟l中分解率為70%、酶比活為600U/ml的培養(yǎng)物，將其 以5%的體積比接種于培養(yǎng)基(1)，在35。C、好氧、靜止、pH值為7.4的條件下 培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)液I;再將培養(yǎng)液I以5%的體積比接種到培養(yǎng)基11， 35°C、好 氧、靜止、pH值為7.4的條件下培養(yǎng)56小時，得到培養(yǎng)液II;
培養(yǎng)基(l)的組成為每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨6g，酵母提取物1. 2g， NaCl 6g， K2HP041.2g， MgS047 H20: 0. 40g， CaC033. 5g，溶劑為水。
培養(yǎng)基I的組成為每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨6g，酵母提取物1. 2g， NaCl 6g， K2HP041.2g， MgS047 H20 : 0 . 40g， CaC033 . 5g，大豆秸稈0. 2g，溶劑為水。
培養(yǎng)基II的組成為每升培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨12.0g，牛肉膏12.0g，酵母 粉3.5g， NaCl 6.0g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 55g，醋酸鈉3. 5g， CaC03 3 . 5g， 12g高 溫滅菌的大豆秸稈，溶劑為水；pH用NaOH調(diào)節(jié)至7.3。
3、 酶的提取及酶比活測定將培養(yǎng)液II以4000g的速度離心10min，取上清， 即得降解木質(zhì)纖維素的酶的粗提液；
酶比活測定方法同步驟1中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果測得所得粗提液降解木質(zhì)纖維素的酶的 比活為1000U/ml粗提液。
4、 粗提液的濃縮與實(shí)施例1中所述一致。
權(quán)利要求
1、一種制備降解木質(zhì)纖維素的酶的方法，包括如下步驟用培養(yǎng)基I培養(yǎng)經(jīng)過處理的秸稈，得到培養(yǎng)物I，從所述培養(yǎng)物I中得到降解木質(zhì)纖維素的酶；所述培養(yǎng)基I的組成為每升所述培養(yǎng)基I中含有蛋白胨4-6g，酵母提取物0.8-1.2g，NaCl 4-6g，K2HPO40.8-1.2g，MgSO4·7H2O 0.30-0.40g，CaCO32.5-3.5g，秸稈0.1-0.2g，溶劑為水。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基I的組成為每升 所述培養(yǎng)基I中含有所述蛋白胨5g，所述酵母提取物lg，所述NaCl 5g，所述 K異lg，所述MgSO"7H20 0. 35g，所述CaC03 3g，秸稈0. 15g，溶劑為水。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件包括溫度為28-32'C、好氧、pH值為6.8-7.2;所述溫度優(yōu)選為30。C，所述PH值優(yōu)選為 7. 0。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件還包括振蕩； 所述振蕩的速度為120-180rpm/rain，旋轉(zhuǎn)半徑為13mm;所述振蕩的速度優(yōu)選為150 rpm/min。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述從所述培養(yǎng)物I 中得到降解木質(zhì)纖維素的酶的方法包括如下步驟將所述培養(yǎng)物I接種于培養(yǎng)基n中進(jìn)行再次培養(yǎng)，得到培養(yǎng)物n，從培養(yǎng)物n中得到降解木質(zhì)纖維素的酶；所述培 養(yǎng)基n的組成為每升所述培養(yǎng)基n中含有胰蛋白胨8-i2g，牛肉膏8-i2g，酵母粉2. 5-3. 5g， NaCl 4-6g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 45-0, 55g，醋酸鈉2. 5-3. 5g ， CaC0:i 2.5-3.5g，秸稈9-12g，溶劑為水。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基II的組成為每升所述培養(yǎng)基n中含有所述胰蛋白胨io.og，所述牛肉膏io.og，所述酵母粉3g，所述NaC15.0g，所述半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g，所述醋酸鈉3. 0g，所述CaC03 3. 0g，所 述秸稈10.5g，溶劑為水。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述再次培養(yǎng)的條件為 溫度為33-35°C、好氧、pH值為7.0-7.4、培養(yǎng)時間為40-56小時；所述溫度優(yōu)選 為34。C，所述pH值優(yōu)選為7.2;所述培養(yǎng)時間優(yōu)選為48小時。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述處理的方法為將所述秸稈堆成垛，在溫度為-2(TC至2(TC、相對濕度為20-30%的條件下放置至所述秸稈腐爛。
9、權(quán)利要求1-8中任一所述方法制得的酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備降解木質(zhì)纖維素的酶的方法。該方法包括如下步驟用培養(yǎng)基I培養(yǎng)經(jīng)過處理的秸稈，得到培養(yǎng)物I，從所述培養(yǎng)物I中得到降解木質(zhì)纖維素的酶；所述培養(yǎng)基I的組成為每升所述培養(yǎng)基I中含有蛋白胨4-6g，酵母提取物0.8-1.2g，NaCl 4-6g，K₂HPO₄0.8-1.2g，MgSO₄7 H₂O0.30-0.40g，CaCO₃2.5-3.5g，秸稈0.1-0.2g，溶劑為水。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法制得的酶的活性高，純度高，分解天然木質(zhì)纖維素的效率高，糖耗少，能將纖維素有效的轉(zhuǎn)化為糖，副產(chǎn)物少，實(shí)現(xiàn)了能源再生；同時該方法還具有成本低廉、操作簡單的特點(diǎn)。因此，本發(fā)明方法在降解纖維素方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N9/24GK101451128SQ20091007622
公開日2009年6月10日 申請日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者崔宗均, 曹燕篆, 慧 王, 王小娟, 王小芬, 鵬 郭 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)