專利名稱：禽源啟動子表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽源啟動子表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真核表達(dá)載體是分子生物學(xué)研究中最常用的表達(dá)載體之一。目前最常用的是哺 乳動物源啟動子的蛋白表達(dá)載體，可以在哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)蛋白。我國是養(yǎng)禽 業(yè)大國，養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展也促進(jìn)了對禽類生產(chǎn)、疾病預(yù)防與控制等領(lǐng)域的研究，尤其 是抗病育種逐漸被提到日程上來。由于目前尚缺少禽源啟動子的蛋白表達(dá)載體，難 以在禽類體內(nèi)或細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)外源基因。并且，目前使用的真核表達(dá)蛋白載
體構(gòu)建表達(dá)外源基因的載體的過程是通過傳統(tǒng)的連接方法連接的，通過T4DNA連接 酶將載體與目的片段連接成一個完整的質(zhì)粒。傳統(tǒng)的這種酶切的連接方法存在步驟 比較煩瑣，成本高，連接效率較低等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種禽源啟動子表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的禽源啟動子表達(dá)載體，命名為pAPP-Vector,是一種環(huán)狀載體， 包含原核復(fù)制起點(diǎn)、 一個真核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)盒；所述外 源基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有LTR啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號； 所述LTR啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1-607位；所述連接 片段含有EcoRV識別序列。
其中，所述真核復(fù)制起點(diǎn)可為任何現(xiàn)已知的真核生物進(jìn)行DNA復(fù)制的起始點(diǎn)， 具體可為SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。所述多聚腺苷酸加尾信號可為具有終止轉(zhuǎn)錄作用的 所有DNA片段，具體可為牛生長激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原核復(fù)制起始 位點(diǎn)可為任何現(xiàn)已知的原核生物進(jìn)行DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，具體可為大腸桿菌質(zhì)粒 CoIEl復(fù)制起始位點(diǎn)。
pAPP-Vector的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1。
用EcoRV酶切所述禽源啟動子表達(dá)載體得到的線性載體也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述禽源啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
4本發(fā)明所提供的所述禽源啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟
1) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5' v4<^r67TCT7T<XT(%^Ca^r^^^^ 3'和5' fA47TO^(^6^Z4ra:7r6^6CATGCATCTAG 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段A;
2) 以pCDNA3. 0質(zhì)粒為模板，用如下引物5， Cmfi4M7TfgC7TCAGCACAC 3'和5' 6r0^7^"76^0;C46K4A^A4C4 7^7 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段B;
3) 將片段A和片段B導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組將片段A和 片段B連接，獲得重組載體pA;
4) 以重組載體pA為模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC J，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG ，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段D;
5) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC < ，或5，
CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC J， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段C;
6) 將片段C和片段D導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組將片段C和 片段D連接，獲得重組載體pAP-SV40;
7) 以REV病毒DNA為模板，用如下引物5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC
3，和5， CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片
段F;
8) 以重組載體pAP-SV40為模板，用如下引物5' TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3，和5， GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段E;
9) 將片段E和片段F導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組將片段E和 片段F連接，得到所述的載體。
本發(fā)明所述禽源啟動子表達(dá)載體可作為出發(fā)載體，構(gòu)建在禽類細(xì)胞或哺乳動物 細(xì)胞中表達(dá)蛋白的重組表達(dá)載體。
以本發(fā)明的pAPP-Vector為出發(fā)載體構(gòu)建的表達(dá)綠色熒光蛋白的重組表達(dá)載 體，可以在禽類細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)綠色熒光蛋白。以pAPP-Vector為 出發(fā)載體利用同源重組構(gòu)建重組表達(dá)載體，避免了傳統(tǒng)的酶切，連接等環(huán)節(jié)，整個 構(gòu)建過程中不使用內(nèi)切酶與連接酶，且比傳統(tǒng)的連接過程省略了2-3個步驟，連接 的效率也較理想。使用本發(fā)明的pAPP-Vector構(gòu)建表達(dá)外源基因的重組載體的過程簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效，可以快速完成大量外源基因的表達(dá)載體的構(gòu)建。將在轉(zhuǎn)
基因動物研究中發(fā)揮重要作用。


圖1為pAPP-Vector的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果。
具體實施例方式
下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑 獲得。
實施例1、 pAPP-Vector的構(gòu)建 1) pA的構(gòu)建
設(shè)i十弓l物pA Vectorl上游禾口 pA Vectorl下f游、pA Vector2上訪,禾口 pA Vector2 下游，弓l物pA Vectorl上i游禾口 pA Vectorl下幼字、pA Vector2上幼,禾口 pA Vector2 下游的序列如下
pA Vectorl上游5' JC4r677nT7Ta^(^<X6t7^C^(^ 3，；
pA Vectorl下游5' fi^nC7^C4(24Z47r67r^6CATGCATCTAG 3'。
pA Vector2上游5' OT(S4■ m:AGCACAC 3'(劃線部分為
EcoR V酶識別位點(diǎn))；
pA Vector2下游5， 070^7^fO^(T(^6K4^6^4C47Z r 3'。
以pEGFP-Nl (Invitrogen)質(zhì)粒為模板，用引物pA Vectorl上游和pA Vectorl
下游PCR擴(kuò)增片段A;以pCDNA3. 0質(zhì)粒為模板，用引物pA Vector2上游和pA Vector2
下游PCR擴(kuò)增片段B。
PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5HL，上游、下游引物各l叱，DNA模板1叱，
MgC12 (25mM) 3叱，dNTPs (各2. 5raM) 3叱，Pfu-Taq (5U/I40 0. 5A，最后補(bǔ)水至
50PL。
反應(yīng)條件94。C熱變性5min; 94。C變性45s， 53。C退火45s， 72。C延伸6min， 共30個循環(huán)；72。C最后延伸10min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
50pl感受態(tài)細(xì)胞中加入片段A和B后混勻，片段A和B質(zhì)量比為100 ng: 500 ng?；靹蚝篌w系冰浴30 min。 42"水浴熱激90秒，然后冰上放置3 min，加入預(yù) 熱的LB培養(yǎng)基900 nl，置于37。C下，180rpm振搖90 min，收集菌體，用LB液體
6培養(yǎng)基重懸菌體，取200 pl重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37 。C培養(yǎng) 12 h。挑取單克隆提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pA。
2) pAP-Vector的構(gòu)建
設(shè)計引物SV (40)上游和SV (40)下游、pAP Vector (l)上游和pAP Vector (1)
下游，序列如下
SV (40)上游5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCCJ，；
SV (40)下游5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTCJ，。
pAP Vector (l)上游5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3，；
pAP Vector (l)下游5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG3，。
以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用引物SV (40)上游和SV (40)下游PCR擴(kuò)增片段
C;以pA質(zhì)粒為模板，用引物pAP Vector (1)上游和pAP Vector (l)下游PCR擴(kuò)
增片段D。
PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2 (25 mM) 3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3吣，Pfu-Taq(5 U/叱)0.5叱，最后補(bǔ) 水至50 PL。
反應(yīng)條件94。C熱變性5 min; 94。C變性45 s， 53 。C退火45s， 72 。C延伸6 min， 共30個循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
5(^1感受態(tài)細(xì)胞中加入片段C和D后混勻，片段C和D質(zhì)量比為100ng: 500ng。 混勻后體系冰浴30 min。 42。C水浴熱激90秒，然后冰上放置3 min，加入預(yù)熱的 LB培養(yǎng)基900 pl，置于37。C下，200 rpm振搖90 min，收集菌體，用LB液體培 養(yǎng)基重懸菌體，取200 pl重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37i:培養(yǎng)16h。 挑取單克隆提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pAP-SV40。
3) pAPP-Vector的構(gòu)建
設(shè)計引物PAPP上游和PAPP下游、LTR上游和LTR下游，引物序列如下 pAPP上游5， TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3，； pAPP下游5， GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3，。 LTR上游5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3'; LTR下游5， CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3，。 以pAP-SV40質(zhì)粒為模板，用引物pAPP上游和pAPP下游PCR擴(kuò)增片段E;以REV病毒(Reticuloendotheliosis. In: Saif, Y. M. ， Barnes, J. ， Glisson， J.， Macdougal， L. ， Swayne， D. (Eds.) ， Diseases of Poultry, 11th ed. Iowa State Press, Ames, pp. 517 - 535.)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué))的DNA為模板，用引物L(fēng)TR上游 和LTR下游PCR擴(kuò)增片段F。
PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2(25 raM) 3叱，dNTPs(各2.5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/WJ 0.5叱，最后補(bǔ)水 至50 HL。
反應(yīng)條件94 。C熱變性5 rain; 94 。C變性45 s， 53 。C退火45 s， 72 。C延伸 6 rain，共30個循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
50pl感受態(tài)細(xì)胞中加入片段E和F后混勻，片段E和F質(zhì)量比為100ng: 500ng。 混勻后體系冰浴30min。 42。C水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預(yù)熱的LB 培養(yǎng)基90(^1，置于37。C下，180rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基重 懸菌體，取200pl重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37。C培養(yǎng)12h。挑取單 克隆提取質(zhì)粒，該載體命名為pAPP-vector, pAPP-vector圖譜如圖1所示。
挑取單克隆提取質(zhì)粒，將pAPP-vector測序，測序結(jié)果表明，pAPP-vector的核 苷酸序列如序列表中的序列1，序列1自5'末端第1-607位為LTR啟動子，自5 '末端第692-698位為EcoRV酶的識別序列，自5'末端第670-1023位為BGH Ploy A，，自5'末端第1024-1205位為SV40 Origin,自5'末端第1224-1843位為大 腸桿菌質(zhì)粒CoIEl復(fù)制起始位點(diǎn)，自5'末端第1844-3001位為氨芐青霉素抗性基 因。序列1的自5'端第695-710位的核苷酸序列和序列1的自5'端第711-726位 的核苷酸序列為能與外源基因上的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生同源序列重組的序列。
實施例2、 pAPP-vector表達(dá)蛋白的能力
1)表達(dá)綠色熒光蛋白的pAPP-EGFP-Vector的構(gòu)建
設(shè)計引物EGFP上游和EGFP下游，引物序列如下
EGFP上游GGAATTCTGCAGATTCGCCACCATGGTGAG;
EGFP下游ATGCATGCTCGAGGATTTACTTGTACAGCTCG。
引物中GGAATTCTGCAGAT和ATGCATGCTCGAGGAT序列為能與序列1的自5'端第 695-710位的核苷酸序列和序列1的自5'端第711-726位的核苷酸序列發(fā)生同源重 組的序列。
8以pEGFP-Nl為模板，用引物EGFP上游和EGFP下游PCR擴(kuò)增EGFP基因片段。 反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5吣，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱，
MgCl2(25 raM)3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (511/叱)0.5叱，最后補(bǔ)水
至50 PL。
反應(yīng)條件94 r熱變性5 min; 94 。C變性45 s， 50 °(3退火45 s， 72 。C延伸 1 min，共30個循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
pAPP-Vector用EcorV內(nèi)切酶酶切線性化，回收線性化的pAPP-Vector。
酶切體系如下
10XD bufferlO(il， BSA l|il， EcoR V 2 u 1 (20U PR0MEGA公司)，pAPP-Vector 50ul，補(bǔ)水至100nl， 37° C酶切過夜。
酶切產(chǎn)物在1XTAE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，120v，電泳30分鐘，DNA回收
試劑盒回收目的片段。
感受態(tài)細(xì)胞中加入線性化的pAPP-Vector和上述PCR擴(kuò)增的EGFP基因片 段后混勻，線性化的pAPP-Vector和EGFP基因片段質(zhì)量比為lOOng: 500ng?；靹?后體系冰浴30min。 42"C水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預(yù)熱的LB培養(yǎng) 基900)al，置于37"下，180rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基重懸菌 體，取200(il重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37'C培養(yǎng)12h。挑取單克隆 提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pAPP-EGFP-Vector。 2)綠色熒光蛋白的的檢測
取10 ul lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)加入到250 ul的0PTI-MEMI 培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，室溫放置5分鐘，獲得溶液1;將5ug pAPP-EGFP-Vector質(zhì)粒加入到250 ul的0PTI-MEMI培養(yǎng)基中，獲得溶液2;將溶 液1和2混合，室溫孵育20分鐘，再加入500 ul的OPTI-MEMI培養(yǎng)基，得到溶液 3。
將雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)(北京實驗動物研究中心)和293T細(xì)胞分別置 于6孔細(xì)胞板中培養(yǎng)，等待細(xì)胞長至60。/。時將細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后分別加入 溶液3， 37"C孵育5個小時，分別吸出溶液3，加入新鮮的OPTI-MEMI培養(yǎng)基，繼 續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)情況。
以轉(zhuǎn)染pAPP-Vector質(zhì)粒的CEF細(xì)胞作為對照。熒光顯微鏡結(jié)果如圖2所示，表明pAPP-EGFP-Vector轉(zhuǎn)染后24小時的CEF細(xì) 胞和293T細(xì)胞有較強(qiáng)的熒光信號，而對照沒有熒光，說明pAPP-EGFP-Vector質(zhì)粒 可以在CEF細(xì)胞與293T表達(dá)綠色熒光蛋白。
圖2中，A為pAPP-EGFP-Vector轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，B為pAPP-EGFP-Vector轉(zhuǎn) 染的CEF細(xì)胞，C為對照。
上述實驗結(jié)果說明，pAPP-Vector載體可作為出發(fā)載體，構(gòu)建在禽類細(xì)胞或哺 乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白的重組表達(dá)載體。<formula>formula see original document page 11</formula>attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 960
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 1020
gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgatcc cgcccctaac tccgcccagt 1080
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 1140
gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 1200
tgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gc犯aaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 1260
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 1320
aagtcagagg tggcgaa^cc cgacaggact ataaagatac caggcgtttx cccctggaag 1380
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 1440
cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 1500
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 1560
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agcagccact ggt犯cagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagt1:ctt 1680
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gaagccag"tt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 1800
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 1860
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 1920
agggatt"ttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 1980
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 2040
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aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 2220
cggaagggcc gagcgcag33 gtggtcctgc犯ctttatcc gcctccatcc agtctatt犯 2280
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 2340
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 2400
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 2460
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 2520
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 2580
tgagtactca acc犯gtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 2640
ggcgtcaata cgggatetata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 2700
aaaacgttct tcggggcgaa肌ctctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccag"ttcgat 2760
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttxacca gcgtttctgg 2820
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 2880
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttat"tgaagc atttatcagg gttattgtct 2940
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaagLaataaa caaatagggg ttccgcgcac 3000
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcca aaagcctagg cctcca犯犯agcctcctca 3060
1權(quán)利要求
1、一種環(huán)狀載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、一個真核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有LTR啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號；所述LTR啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述連接片段含有EcoRV識別序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述真核復(fù)制起點(diǎn)為SV40病毒復(fù) 制起點(diǎn)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的載體，其特征在于所述多聚腺苷酸加尾信號為 牛生長激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于所述原核復(fù)制起始位點(diǎn)為大腸桿菌質(zhì)粒CoIEl復(fù)制起始位點(diǎn)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于所述載體的核苷酸序列為序列表 中的序列1。
6、 一種線性的載體，是用EcoRV酶切權(quán)利要求l至5中任一所述的載體得到的 線性載體。
7、 權(quán)利要求5所述載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟1) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5' ^^7^770T7ra^ar(^CZ4^6^ 3' 和5' 6^776T60fi4Z47trr0^6CATGCATCTAG 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段A;2) 以pCDNA3. 0質(zhì)粒為模板，用如下引物5' Cr6mW7TTgCUMTiXAGCACAC 3'和5' arr67^^7(%^< 6M6K4A4(X^<^7^r 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段B;3) 將片段A和片段B導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組將片段A和片 段B連接，獲得重組載體pA;4) 以重組載體pA為模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC < ，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG < ，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段D;5) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5' GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC T或5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC ， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段C;6) 將片段C和片段D導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組將片段C和片 段D連接，獲得重組載體pAP-SV40;7) 以REV病毒DNA為模板，用如下引物5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3，和5，CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3 ， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段F;8) 以重組載體pAP-SV40為模板，用如下引物5'TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3,和5，GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC 3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段E;9) 將片段E和片段F導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組將片段E和片段F連接，得到權(quán)利要求5中所述的載體。
8、權(quán)利要求1至5中任一所述的載體在禽類細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽源啟動子表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。該禽源啟動子表達(dá)載體是一種環(huán)狀載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、一個真核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒自上游至下游依次含有LTR啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號；所述LTR啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述連接片段含有EcoRV識別序列。使用本發(fā)明的pAPP-Vector構(gòu)建表達(dá)外源基因的重組載體的過程簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效，可以快速完成大量外源基因的表達(dá)載體的構(gòu)建。將在轉(zhuǎn)基因動物研究中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK101481703SQ20091007638
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月14日
發(fā)明者傅光華, 劉芹防, 劉金華, 畢玉海, 娟 蒲, 馬婧姣 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)