專利名稱：棉花雜交種的dna指紋純度檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是，涉及一種棉花雜交種中棉 所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
中棉所48系中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所選育的抗蟲(chóng)雜交棉品種。 該雜交種具有大鈴、優(yōu)質(zhì)的特性，連續(xù)多年在我國(guó)主要棉區(qū)都有較大 的種植面積，現(xiàn)已成為我國(guó)主推棉花品種。隨著棉花品種數(shù)量的曰益 增加和遺傳基礎(chǔ)的日益狹窄，使得完全根據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行棉花品種的 辨別越來(lái)越困難，給種子生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、管理、維權(quán)等諸環(huán)節(jié)帶來(lái)不同 程度的困難，造成諸如品種多、亂、雜的現(xiàn)象。近年來(lái)，分子生物學(xué) 的發(fā)展使品種鑒定進(jìn)入到基因水平，與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和蛋白質(zhì)電 泳技術(shù)相比，DNA標(biāo)記技術(shù)能揭示更多的多態(tài)性，具有準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn) 單快速、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，是品種鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。
與其它分子標(biāo)記相比，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列 (SSR)標(biāo)記在DNA指紋鑒定上顯示了獨(dú)特的優(yōu)越性SSR標(biāo)記數(shù)量 豐富，覆蓋整個(gè)基因組，揭示的多態(tài)性高，以孟德?tīng)柗绞竭z傳，呈共 顯性。SSR標(biāo)記已成為品種純度鑒定首選技術(shù)之一，并已在玉米，水 稻等作物上初步應(yīng)用。
目前，我國(guó)棉種的真實(shí)性與品種純度鑒定仍依靠田間小區(qū)種植鑒 定方法，需投入大量的人力、物力，成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，時(shí)效性差。武 耀廷，張?zhí)煺?，郭旺珍等進(jìn)行了陸地棉品種SSR標(biāo)記的多態(tài)性及用于 雜交種純度檢測(cè)的研究；馬軒，杜雄明，孫君靈等進(jìn)行了18個(gè)彩色棉 品系的SSR指紋分析；殷劍美，陳旭升，狄佳春等進(jìn)行了雜交棉蘇雜 118的SSR指紋圖譜構(gòu)建研究。廣大科研工作者普遍認(rèn)為，利用分子
4標(biāo)記進(jìn)行棉花品種鑒定是可行的。但利用現(xiàn)有的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品 種鑒定缺乏系統(tǒng)性研究，存在鑒別能力不夠高、操作步驟較多、耗費(fèi) 時(shí)間較長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)成本較高等問(wèn)題，不能完全適應(yīng)實(shí)踐檢測(cè)的需要。因 此，有必要針對(duì)限制棉花DNA指紋鑒定實(shí)用化的因素，迅速開(kāi)展我國(guó)
棉花品種DNA指紋鑒定的研究工作，建立高效準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的以 SSR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA指紋鑒定體系，在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)棉花品種純度 和真?zhèn)蜠NA指紋鑒定方法，將為棉花品種質(zhì)量監(jiān)控及品種權(quán)保護(hù)提供 有利的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種棉花雜交種中棉所48DNA指紋純度檢測(cè) 方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)DNA快速提取法、分子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)體系(包括 PCR擴(kuò)增體系、電泳及銀染檢測(cè))、特征引物篩選確定等環(huán)節(jié)進(jìn)行全 面系統(tǒng)的研究，從實(shí)踐上解決限制DNA指紋技術(shù)商業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn) 題，建立了快速準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠的棉花DNA指紋鑒定標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)體系，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)一種適用于棉花雜交種中棉所48純度檢 測(cè)的方法，釆用該方法不僅檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，而且操作簡(jiǎn)單方便， 成本低廉，有利于技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。
本發(fā)明提供一種棉花雜交種中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法， 使用選自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322 中的 一個(gè)或多個(gè)特征引物進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明棉花雜交種中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，包括DNA 提取、使用選自NAU1190、 CIR246、 CIR105、 BNL1705、 BNL4030 和NAU1322中的一個(gè)或多個(gè)特征引物進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增、電泳和銀染
一、特征引物的篩選確定
1)資料初篩廣泛收集整合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料上公布的棉花SSR引物信息，依據(jù)以下引物篩選原則a.在染色體上已明確定位，且位 置是唯一的；b.多態(tài)性基因型數(shù)>3。初篩出分布在棉花全基因組26 條染色體上的單位點(diǎn)多態(tài)性SSR引物400對(duì)，作為品種鑒定的候選引 物。
2)中棉所48純度檢測(cè)特征引物
從候選引物中進(jìn)一步篩選出在中棉所48父本、母本和雜交種F, 間表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)帶型的引物，并通過(guò)田間常規(guī)鑒定與室內(nèi)鑒定比 較，驗(yàn)證引物可靠性，確定出適用于中棉所48純度檢測(cè)的特征引物6 個(gè)NAU1190、 CIR246、 CIR105、 BNL1705、 BNL4030和NAU1322。 使用其中任 一 特征引物均可對(duì)中棉所48進(jìn)行純度檢測(cè)，不同特征引物 的檢測(cè)結(jié)果可相互驗(yàn)證，同時(shí)使用還可對(duì)中棉所48進(jìn)行真?zhèn)螜z測(cè)。
二、利用上述篩選出的引物對(duì)中棉所48進(jìn)行純度檢測(cè)，包括以下 步驟
1 ) DNA快速提取法
經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)與比較研究，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種適用于單粒棉種 DNA快速提取的方法釆用電動(dòng)種子粉碎器將去殼棉種充分粉碎后， 加入800pl SDS提取液，漩渦充分后，65。C水洛30min，間隔10min左 右輕搖一次。加入等體積80(Hd酚、氯仿和異戊醇的混合液(其體積 比依次為25: 24: 1 ),混勾至不分層，10000rpm離心10min。取上清， 加入ijilRNase(10mg/ml), 37。C水洛30min。重復(fù)抽提一次后離心取上 清，加入0.7倍體積異丙醇，待DNA成團(tuán)析出后，70n/。乙醇洗滌DNA 沉淀2次，加入200iilTE或ddH2O充分溶解DNA,備用。該方法相比常 規(guī)的以葉片為材料的CTAB提取法不僅能獲得高質(zhì)量的DNA,而且簡(jiǎn) 單快速，省去了育苗時(shí)間和液氮研磨等環(huán)節(jié)，降低實(shí)驗(yàn)成本的同時(shí)大 大提高了工作效率。
2) SSR-PCR擴(kuò)增體系
本發(fā)明在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，建立了一套穩(wěn)定的適用于棉種純度鑒定的SSR-PCR反應(yīng)體系 20nl反應(yīng)液中包括1.5mmol/LMgCl2, O.lmmol/LdNTP, 1 x Buffer, 0.3^mol/LSSR引物(選自NAU1190、 CIR246、 CI詣5、 BNL1705、 BNL4030和NAU1322中的一個(gè)或多個(gè)特征引物)，1U Taq DNA聚合 酶，2plDNA模板。
反應(yīng)程序95X:預(yù)變性2min, —個(gè)循環(huán)；94'C變性45s， 55。C退 火45s， 72。C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸7min, —個(gè)循環(huán)；4°C 保存待用。該SSR-PCR擴(kuò)增體系穩(wěn)定可靠，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù) 性。
3) 電泳
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物釆用6。/。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒功率80W電泳 lh。相比非變性膠和瓊脂糖凝膠電泳，6%變性膠更適于高分辨率的 棉種DNA指紋鑒定，不僅有效提高品種指紋鑒別能力，而且縮短了電
泳時(shí)間。
4) 銀染檢測(cè)
釆用快速銀染法，流程如下
固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)固定10min;—雙蒸水快速漂 洗l次；—0.2。/。AgN03溶液染色5min;—雙蒸水快速漂洗l次；—顯影 液(3。/。NaOH, 0.5%甲醛)顯影；—固定液(10%無(wú)水乙醇，0.5%冰 醋酸)定影。該銀染法操作簡(jiǎn)單，背景容易掌握，靈敏度高，且減少 了冰醋酸的使用量，30分鐘內(nèi)即可獲得背景清晰的染色效果。
本發(fā)明棉花雜交種中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法具有以下有 益效果
本發(fā)明建立了快速準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠的棉花DNA指紋鑒 定標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)體系，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了一種適用于棉花雜交種中棉所 48純度檢測(cè)的方法，利用該方法對(duì)棉花雜交種中棉所48的純度進(jìn)行 檢測(cè)， 一份樣品(IOO粒種子)從送樣到出結(jié)果僅需2d，且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，容易統(tǒng)計(jì)。 一般種子檢驗(yàn)室只需具備常規(guī)的分子生物學(xué)設(shè) 備就可按提供的操作步驟進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)。


圖l為中棉所48純度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)圖譜，圖中l(wèi)-6依次為引物 NAU1190、 BNL1705、 CIR246、 CIR105、 NAU1322、 BNL4030對(duì)中 棉所48的父本、F,雜交種及母本的標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增的 電泳圖譜；
圖2為引物BNL1705對(duì)20份中棉所48種子DNA樣品純度檢測(cè)圖 譜，圖中左邊依次為分子量Marker、中棉所48父本、雜交F1及母本 標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳譜帶。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)基于PCR技術(shù)的SSR分析實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但 不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1
對(duì)中棉所48種子樣品進(jìn)行純度檢測(cè)包括以下步驟，其中，本方法 中所用引物信息見(jiàn)表l;所用的試劑配制見(jiàn)表2。 1、單粒棉種DNA提取
(1) 將單粒棉花種子去殼，充分粉碎后轉(zhuǎn)入2ml的離心管中。
(2) 加入800ul DNA提取液(1。/。SDS， 0.01M EDTA 8.0, 0.7M NaCl， 0.05MTris-HCl, 0.5%山梨醇，1%PVP, 1%|3-巰基乙醇)，漩 渦至充分混勻后，65。C水洛30min,間隔10min左右輕搖一下。
(3) 水洛結(jié)束后，加入等體積800pl苯酚、氯仿和異戊醇的混合 液(其體積比依次為2-5: 24: 1),上下顛倒混勻至不分層，10000rpm 離心10min。
(4) 吸取上清液轉(zhuǎn)移到另一2ml離心管中，加入luL RNase酶 (10mg/ml),混勻后37。C水洛30min。
(5) 加入等體積800ul的苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1 ),上下顛倒混勻至不分層，10000rpm離心10min。
(6) 將上清液轉(zhuǎn)移到另一2ml離心管中，加入0.7倍體積異丙醇 緩慢搖動(dòng)幾次，靜置30min，絮狀DNA成團(tuán)析出。
(7) 用剪口槍頭吸取DNA轉(zhuǎn)移至盛有70。/。乙醇的離心管中，浸 泡兩次，第一次約2小時(shí)，第二次浸泡過(guò)夜。
(8) 倒掉乙醇，自然通風(fēng)干燥DNA,加入200ulTE (pH8.0)或 ddH20,充分溶解備用。
(9) 紫外檢測(cè)DNA濃度，用ddH20將DNA原液稀釋至使用濃度 20ng/|il, 4t:保存?zhèn)溆谩?br> 2、 SSR-PCR擴(kuò)增
SSR引物可選用NAU1190、 BNL1705、 CIR246、 CIR105、 NAU1322 和BNL4030中的一個(gè)或多個(gè)，PCR反應(yīng)體系如下
STOCK (使用濃度)Final20|^1
模板DNA(20ng/pl)40ng2.0 pl
ddH20-14.5(^1
10 x Buffer (含Mg2+/15mM )1 x2.0 pi
dNTP(2.5mM)O.lmM0都1
Primer (20岸)0.3,
Tag(2.5U/(al)1U0.4 (il
反應(yīng)程序95'C預(yù)變性2min,一個(gè)循環(huán)；94°C變性45s, 55°C
退火45s， 72。C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸7min， 一個(gè)循環(huán)；4 'C保存待用。
3、電泳檢測(cè)
(1) 清洗玻璃板用自來(lái)水沾上洗滌靈把玻璃板反復(fù)擦 洗干凈，用純水擦洗一遍，再用95%酒精擦洗一遍。在方板 上涂上lml Binding Silane(0.5%)，凹板上涂上lml Repel silane ( 2%)。操作過(guò)程中防止兩塊玻璃板互相污染。
(2) 6%膠的制備
9STOCK_Final_1000ml
ddH20 - to 1000ml
Urea 45% 450g
10 x TBE 1 x 100ml
40% PA膠_^_150ml
60ml膠灌膠前現(xiàn)加現(xiàn)用
TEMED 1^1/ml 60ul
10%APS 0.03% 200ul
注40% PA膠190g acrylamide+10g bisaciylamide用水稀釋至 5 00ml 。
TEMED和10。/。APS在灌膠前加入。
(3)灌膠灌膠過(guò)程中防止出現(xiàn)氣泡，輕輕插入梳子，使其聚 合2小時(shí)以上。
(4 )變性20|il PCR樣品加上5pl 6 x Loaling buffer,混勻后， 在PCR儀上運(yùn)行變性程序95'C變性5分鐘，4'C冷卻10分鐘(或置于 冰上冷卻)。
(5)電泳用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡，擦入樣品梳子， 每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入3nl樣品。80W ( 1600V/50mA)恒功率電泳至上部 的Loadingbuffer帶(二甲苯青)至膠板的另一前沿(約l小時(shí))。電泳結(jié) 東后，小心分開(kāi)兩塊玻璃板，膠會(huì)緊貼在涂Bindingsilane的玻璃板上。
4、 銀染
固定10%無(wú)水乙醇+0.5%冰醋酸固定液，輕輕晃動(dòng)10分鐘；
漂洗雙蒸水快速漂洗，不超過(guò)10秒；
染色0.2。/。AgN(V溶液中染色5分鐘；
漂洗雙蒸水快速漂洗，時(shí)間不超過(guò)10秒；
顯影3。/。NaOH+0.5。/。甲醛顯影液，輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)；
定影；固定液中定影5分鐘；
5、 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，參照中棉所48父本、母本及F一示準(zhǔn)電泳圖 譜(見(jiàn)圖l),確定代表父本帶型、母本帶型、其他雜株帶型及F,帶型 的各種基因型，只有同時(shí)具有親本特異條帶的種子才為真正的中棉所
48Fi種子，統(tǒng)計(jì)代表各種類型的基因型數(shù)，即可計(jì)算出待檢中棉所48 種子純度百分率及雜株率。多個(gè)特征引物同時(shí)使用，取平均值即為待 檢樣品純度。
表l中棉所48純度檢測(cè)特征引物基本信息表
引物名稱染色體 位置重復(fù)序列引物序列(5' —3')NAU11903CGGC)6上游 下游:CCATGTCCGTATCCATGTTA; TAAGGCAAGATAGGGTCAGG
CIR24614(TG)6上游: 下游:TTAGGGTTTAGTTGAATGG; ATGAACACACGCACG
CIR10515(AC)9上游GTCTCTTGTCTTTCTTTCTTAC;
下游:AACCAAACTGAACCCA
BNL170521(AG)27上游GCCAATTTAGTATAGGAAGCAAGT;
下游:CATGTATTATTTTCACCCCTCTCT
BNL403022(GT)IO上游: 下游:CCTCCCTCACTTAAGGTGCA; ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC
NAU132224(CATCTC)3上游 下游:CTCCAATCGAATGATTTTT; GGTAGGGTTTTGGAGGTTTT
表2實(shí)施例l的試劑配制
試劑配制
dNTP超純水稀釋原液至2.5mM的工作液
DNA模板紫外檢測(cè)確定濃度，超純水稀釋至工作液濃度
20ng/ul
引物超純水稀釋左右引物至40uM,等體積混合至20uM
的工作液
6 x變性加樣緩去離子甲酰胺49ml， 0.5M的EDTA(pH8.0)lml,
沖液溴酚蘭0.125g， 二甲苯青0.125g
0.5M EDTA186.lg Na2EDTA.2H20溶于800ml純水中，調(diào)pH
值至8.0，定容至1000ml
Bind緩沖液50ml用量49.75ml無(wú)水乙醇+250ul冰醋酸Bind工作液1ml Bind緩沖液加入5ulBind原液
Repei工作液三氯甲烷475ml+剝離硅烷25ml
10% APSlml用量O.lg過(guò)硫酸銨用0.9ml超純水稀釋
40%PA膠190g acrylamide+10g bisacrylamide, 用水稀釋至
500ml
10 x TBE存儲(chǔ)Tris堿108g，硼酸55g, 0.5M EDTA 37ml，定容至
液1000ml
1 x TBE工作液10 x TBE 500ml ，力卩水4500ml混勻
實(shí)施例2
按照實(shí)施例l的步驟，采用特征引物BNL1705對(duì)中棉所48種子樣 品進(jìn)行純度檢測(cè)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析結(jié)果如下
圖2所示為特征引物BNL1705對(duì)20份中棉所48種子樣品的純度檢 驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照?qǐng)D1中所示中棉所48父本、母本和雜交種F，的標(biāo)準(zhǔn)電泳 譜帶可知①父本帶型16號(hào)樣品；②母本帶型7號(hào)和20號(hào)樣品； ③其他雜株帶型13號(hào)樣品；④真實(shí)雜交種帶型除以上三種雜株帶 型外，其他16份樣品均為真實(shí)雜交種帶型。因此，這20份中棉所48 種子樣品純度為80%;雜株率為20%(其中父本雜株率為5%,母本雜 株率為10%，其他品種雜株率為5%)。序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 〈120>棉花雜交種中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法 <130> KHP08113336. 5 <勝 12
〈170> Patentln version 3. 5
<210> 1
<211> 20
<212〉 隱
<213>人工序列
〈400> 1
ccatgtccgt atccatgtta <210> 2 <211〉 20 <212> 廳 <213> 人工序列 <400> 2
taaggc卿a tagggtc鄉(xiāng) 〈210〉 3 〈211> 19 〈212> ■ <213>人工序列 <400> 3
ttagggttta gttg肌tgg <210> 4 <211> 15 <212> DNA
20
20
19<213> 人工序列 <400> 4
3tg3ElC3CglC gC3Cg
<210> 5 <211> 22 <212>醒 〈213〉人工序列 <400> 5
gtctcttgtc tttctttctt ac
<210> 6
<211〉 16
<212> 腿
<213〉人工序列
<400> 6
aaccaasctg saccca <210> 7 〈211> 24 <212> ■ <213> 人工序列 〈400> 7
gccaatttag tataggaagc aagt
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400〉 8
catgtattat tttcacccct ctct
15
22
16
24
24
14〈210> 9 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 〈400> 9
cctccctcac ttaaggtgca 〈210> 10 〈211> 20 <212> 醒 <213> 人工序列 <400> 10
atgttgtaag ggtgc肪ggc <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 〈400> 11
ctccaatcga atgattttt 〈210> 12 <211> 20 <212> 廳 〈213〉人工序列 <400> 12
ggtagggttt tggaggtttt
20
20
19
20
權(quán)利要求
1、一種棉花雜交種中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，其特征在于，使用選自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一個(gè)或多個(gè)特征引物進(jìn)行檢測(cè)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，其特 征在于，包括DNA提取、使用選自NAU1190、 CIR246、 CIR105、 BNL1705 、 BNL4030和NAU1322中的 一 個(gè)或多個(gè)特征引物進(jìn)行 SSR-PCR擴(kuò)增、電泳和銀染檢測(cè)步驟。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，其特 征在于，所述DNA提取包括以下步驟將去殼棉種充分粉碎后，加入 800|ul SDS提取液，漩渦充分后，65。C水浴30min,間隔10min輕搖一 次；加入等體積800)iU酚、氯仿和異戊醇的混合液(其體積比依次為2 5: 24: 1 )，混勻至不分層，10000rpm離心10min;取上清，加入lplRNasc (10mg/ml), 37。C水浴30min;重復(fù)抽提一次后離心取上清，加入0.7 倍體積異丙醇，待DNA成團(tuán)析出后，70。/。乙醇洗滌DNA沉淀2次，加 入200jilTt:或ddH2O充分溶解DNA,備用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，其特 征在于，所述SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中20nl反應(yīng)液中包括 1.5mmol/L MgCl2， O.lmmol/L dNTP， 1 x Buffer, 0.3|a mol/L SSR引物， UJTaqDNA聚合酶，2|il DNA模板；反應(yīng)程序?yàn)?5。C預(yù)變性2min, 一個(gè)循環(huán)；94。C變性45s, 55。C退火45s， 72。C延伸2min,共30個(gè)循環(huán); 72。C延伸7min, —個(gè)循環(huán)；4'C保存待用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，其特 征在于，所述電泳步驟中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物釆用6。/。變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳，恒功率80W電泳lh。
6、根據(jù)權(quán)利要求2所述中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，所述 銀染檢測(cè)包括以下步驟用10%乙醇和0.5%冰醋酸組成的固定液固定10min;用雙蒸水快速漂洗l次；用0.2。/。AgN03溶液染色5min;用雙蒸 水快速漂洗l次；用3MNaOH和0.5M甲醛組成的顯影液顯影；用.0% 無(wú)水乙醇和0.5%冰醋酸組成的固定液定影。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種棉花雜交種中棉所48 DNA指紋純度檢測(cè)方法，該方法利用SSR標(biāo)記技術(shù)，使用選自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一個(gè)或多個(gè)特征引物進(jìn)行檢測(cè)，該方法包括下述步驟DNA提取、使用選自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一個(gè)或多個(gè)特征引物進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增、電泳和銀染檢測(cè)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確穩(wěn)定，僅需2d即可完成1份送檢樣品(100粒)的純度檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101560556SQ20091007674
公開(kāi)日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者馮新愛(ài), 猛 匡, 周大云, 楊偉華, 王延琴, 許紅霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所