專利名稱：一種產(chǎn)丁醇梭菌的細胞固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞固定化方法，固定化細胞為產(chǎn)丁醇梭菌，固定化 載體為玉米秸稈，對玉米秸稈預(yù)處理后，直接吸附指數(shù)生長期的梭菌培養(yǎng) 基，得到固定化細胞，可用來發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇。
背景技術(shù)：
丙酮和丁醇作為重要的溶劑，具有廣泛的用途。從20世紀50年代以來 丙酮和丁醇發(fā)酵工業(yè)受到石油工業(yè)的嚴重沖擊，丙酮和丁醇發(fā)酵工業(yè)走向
衰退。隨著石油資源逐步走向枯竭，世界原油價格的飛漲，古老的丙酮和 丁醇發(fā)酵技術(shù)，作為一項有效的、利用生物質(zhì)資源生產(chǎn)燃料的生物轉(zhuǎn)化技 術(shù)，又重新被人們所認識，特別是丁醇作為一種極具潛力的新型燃料已經(jīng) 引起國內(nèi)外的高度重視，2005年美國進行了完全以丁醇為燃料的汽車實 驗，前景廣闊，纖維素丁醇作為第二代生物燃料的代表，使用木質(zhì)纖維素 糖化原料作為碳源，不僅原料來源豐富，在確保國家糧食安全，減少大氣 碳排放等方面，均具有重大的戰(zhàn)略意義。
發(fā)酵生產(chǎn)丙酮和丁醇，主要通過丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌等產(chǎn)溶劑微 生物，通過ABE (acetone-butanol-ethanol)發(fā)酵過程得來。傳統(tǒng)的ABE發(fā) 酵，產(chǎn)溶劑梭菌先經(jīng)歷一個階段的產(chǎn)酸期，首先生成乙酸、丙酸、丁酸， 然后改變代謝，吸收有機酸，并生成溶劑。因為溶劑對微生物的抑制作用， 發(fā)酵液中的溶劑濃度很低，傳統(tǒng)的ABE批次發(fā)酵工藝往往需要大型的發(fā)酵 罐和較長的發(fā)酵周期，溶劑的產(chǎn)率一般在0.1-0.3gl-lh-l之間。近20年來， 許多工程手段被用來提高ABE的產(chǎn)率，其中提高細胞濃度和利用率是目前 提高ABE產(chǎn)率的一個重要思路。細胞回收和細胞固定化是最為廣泛研究的 細胞富集策略。細胞回收利用膜過濾、離心等方式將微生物細胞與發(fā)酵液 分離后再返回反應(yīng)器進行利用。但在處理如纖維素糖化液等富含雜質(zhì)的發(fā) 酵液時，容易遇到膜堵塞以及固體雜質(zhì)積累等問題，同時濾膜的造價以及更換頻率問題也使得細胞回收策略難以在工業(yè)大規(guī)模應(yīng)用時采用。
細胞固定化作為另一種細胞富集策略，將細胞固定于載體之上，并使 細胞在載體上生長分裂，以得到高濃度的細胞。細胞固定化主要有三種方 式包埋，共價結(jié)合，吸附。包埋和吸附需要用到額外的化學(xué)試劑，不僅 提高了生產(chǎn)成本，而且對細胞的生長和分裂產(chǎn)生了影響。細胞吸附利用微 生物自然的吸附屬性，固定于載體之上，并且在載體上生長分裂，吸附載 體的開發(fā)研究作為細胞固定化的熱門見于諸多報道。有人使用多孔陶瓷， 塑料等載體作為產(chǎn)溶劑微生物的固定化載體，雖然細胞富集效果較好，但 造價太高；后來也有人用木屑，黏土磚，骨渣等價格便宜的載體，但其生 物過量生長堵塞后固定床廢棄載體的處理同樣成為工業(yè)化放大的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)丁醇梭菌的細胞固定化方法，此方法可 以提高丙酮丁醇的生產(chǎn)速率，延長反應(yīng)器生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，并且 固定化材料可被降解，便于處理，環(huán)境友好。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的方法，采用產(chǎn)丁醇梭菌(拜氏梭菌或 者丙酮丁醇梭菌)，在厭氧條件下游離培養(yǎng)至指數(shù)生長期進行固定化吸附。 吸附固定化細胞載體采用玉米秸稈，將玉米秸稈去葉削皮后，使用小刀或
粉碎機切成體積0.05-lcn^小塊，使用0.2-2% (v/v體積比)的鹽酸或硫酸 100。C水浴浸煮10-60分鐘，或者116-12rC蒸煮5-30分鐘后，使用2-5倍 體積清水洗滌2-5次，80-12(TC烘干到恒重后，滅菌用于細胞吸附?；蛘?洗滌后滅菌直接用于細胞吸附。
吸附時將上述方法處理過的玉米秸稈浸入指數(shù)生長期的產(chǎn)丁醇梭菌 細胞培養(yǎng)液中，靜止吸附或以0.05-0.2h—1的稀釋率連續(xù)或循環(huán)流過載體進 行吸附固定化。吸附時間為12-48小時，溫度為30-40°C。固定化后的細 胞可用于反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)丙酮丁醇。
本發(fā)明在工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)時，向反應(yīng)器中的載體柱中連續(xù)通入指數(shù)生 長期的產(chǎn)丁醇梭菌細胞培養(yǎng)液，稀釋率在0.2-2h"之間，可穩(wěn)定生產(chǎn)15-30 天，細胞富集濃度達到20-60g/l，溶劑生產(chǎn)速率可達6g/l.h"，與游離發(fā)酵 水平相比，具有明顯提升。
4本發(fā)明的細胞固定化載體，使用與處理后的玉米秸稈來固定化產(chǎn)溶劑 微生物。使用該固定化方法，不僅能夠提供效率高，使用期長的固定化細 胞連續(xù)反應(yīng)器，而且材料便于降解，結(jié)合目前的纖維素燃料丁醇生產(chǎn)，廢 棄的固定化載體還能夠水解處理，為丁醇發(fā)酵提供碳源和氮源。
具體實施方式
實施例1
產(chǎn)溶劑菌種采用拜氏梭菌ATCC 55025，使用RCM培養(yǎng)基(牛肉膏 10g/l，蛋白胨10g/1，酵母提取物3g/1，葡萄糖5g/1，無水醋酸鈉3g/1，氯 化鈉5g/l)37士rC在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)9小時。厭氧環(huán)境為80%氮氣，15% 二氧化碳，.5%氫氣。
將當(dāng)年收割的玉米秸稈去葉削皮后，用小刀切成0.5cn^方形小塊，使 用0.2% (v/v)的硫酸溶液浸煮IO分鐘后，使用2倍體積的清水，洗滌3 次，于12rC下滅菌15分鐘后，填入反應(yīng)器的填充柱中。將處于指數(shù)生長 期的RCM培養(yǎng)基通入填充柱中，在37士rC下浸泡載體12小時，使游離 細胞自動吸附于玉米秸稈的表面以及進入玉米秸稈的空隙中。吸附后繼續(xù) 向填充柱內(nèi)連續(xù)通入產(chǎn)溶劑培養(yǎng)基，該產(chǎn)溶劑培養(yǎng)基的成分為60g/l葡萄 糖，lg/1酵母提取物，0.5% (v/v，體積比)P2儲液維生素儲液(對氨基 苯甲酸0.1g/l， Vbl 0.1g/l，生物素0.001g/l)無機物儲液(MgSCV7H20 20g/l， MnS04'H20 lg/l， FeS04'7H20 lg/l， NaCl lg/1)緩沖液儲液(K2HP04 50g/l， 醋酸銨220g/l)。在稀釋率為0.5h—'的情況下，連續(xù)生產(chǎn)20天，得到的發(fā) 酵液溶劑總量為12g/l，溶劑的生產(chǎn)速率為6g/Hi—1。最后反應(yīng)器停止因為 填充柱內(nèi)菌體的過量生長導(dǎo)致堵塞所致。最后的細胞濃度為33g/l。
實施例2
產(chǎn)溶劑菌種采用丙酮丁醇梭菌ATCC 824，采用實施例1的方法得到 指數(shù)生長期發(fā)酵液。將玉米秸稈按實施例1處理后，使用粉碎機切碎，用 篩網(wǎng)篩選體積0.05-0.1cr^的碎塊。使用l%(v/v)的鹽酸浸泡后，于121°C 蒸煮30min。使用2倍體積清水洗滌3次后，于8(TC烘箱過夜干燥至恒重。
將處理好的玉米秸稈填入填充柱中后，通入指數(shù)生長期的梭菌培養(yǎng) 基，以0.5h"的稀釋率循環(huán)流過填充柱進行吸附固定。吸附48小時后，通入如實施例1所述產(chǎn)溶劑培養(yǎng)基，稀釋率為2h"。反應(yīng)器連續(xù)運行14天后， 菌體過度生長反應(yīng)器堵塞，得到的發(fā)酵液溶劑總量為6g/1，溶劑的生產(chǎn)速
率為12g/l，h—1。最后的細胞濃度為46g/1。
權(quán)利要求
1、一種產(chǎn)丁醇梭菌的細胞固定化方法，是用處于指數(shù)生長期的產(chǎn)丁醇梭菌菌液，通過秸稈吸附制成固定化細胞，主要步驟如下A)將玉米秸稈粉碎成小塊，用稀鹽酸或稀硫酸于80—100℃水浴浸煮10-60分鐘，清洗后烘干至恒重；B)將步驟1處理的玉米秸稈浸入處于指數(shù)生長期的產(chǎn)丁醇梭菌細胞培養(yǎng)液中，于30-40℃下靜止吸附12-48小時。
2、 如權(quán)利要求l所的方法，其中，步驟A中是將玉米秸稈去葉削皮 后，使用小刀或粉碎機切成體積為0.05-lcr^的小塊。
3、 如權(quán)利要求1所的方法，其中，步驟A是用稀鹽酸或稀硫酸于 跳120。C蒸煮5-30分鐘。
4、 如權(quán)利要求1或3所述的方法，其中，步驟A中的稀鹽酸或稀硫 酸的濃度按體積比為0.2-2%。
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，步驟B中是將處于指數(shù)生長期 的產(chǎn)丁醇梭菌細胞培養(yǎng)液以0.05-0.2h—1的稀釋率流過載體進行吸附固定 化。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，處于指數(shù)生長期的產(chǎn)丁醇梭菌 細胞培養(yǎng)液是連續(xù)或循環(huán)流過載體進行吸附固定化。
7、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，產(chǎn)丁醇梭菌為拜氏梭菌或丙酮 丁醇梭菌。
全文摘要
一種產(chǎn)丁醇梭菌的細胞固定化方法，是用處于指數(shù)生長期的產(chǎn)丁醇梭菌菌液，通過秸稈吸附制成固定化細胞，主要步驟如下A)將玉米秸稈粉碎成小塊，用稀鹽酸或稀硫酸于80-100℃水浴浸煮10-60分鐘，清洗后烘干至恒重；B)將步驟1處理的玉米秸稈浸入處于指數(shù)生長期的產(chǎn)丁醇梭菌細胞培養(yǎng)液中，于30-40℃下靜止吸附12-48小時。本發(fā)明的固定化方法具有成本低廉，細胞富集效果顯著，固定化細胞活性高，連續(xù)發(fā)酵時溶劑生產(chǎn)效率高的特點。
文檔編號C12N11/00GK101475932SQ20091007695
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月14日
發(fā)明者張春輝, 張躍冬, 楊芳曉, 馬玉久 申請人:青島生物能源與過程研究所