專利名稱：一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
栽培稻是世界上重要的糧食作物之一，是世界上三分之一以上人口的主要熱量 來源，它的產(chǎn)量、品質(zhì)的提高，對于國計民生、社會穩(wěn)定與糧食安全都是至關(guān)重要
的。栽培稻有11500多年的栽培馴化歷史，為適應不同農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了秈稻和 梗稻兩禾中不同的生態(tài)類型(Morishima et al， Japanese Journal of Breeding, 1981， 31:402-413; Glaszmann et al， Theoretical and Applied Genetics, 1987， 74: 21-30; Blair et al， Theoretical and Applied Genetics, 1999, 98: 780-782)。 在漫長的進化過程中，秈稻和粳稻在許多形態(tài)和生理性狀上產(chǎn)生了明顯的差異
(Wang et al， Acta Genetica Sinica， 1987， 14:262-270)。然而，由于生長環(huán) 境的復雜性，在漫長的秈/粳稻分化過程中，既產(chǎn)生了典型的秈稻或粳稻，也同時 產(chǎn)生了秈粳稻分化不明顯的中間類型，這些分化程度各異的水稻類型很難通過傳統(tǒng) 的方法準確鑒定，給研究水稻起源與演化帶來了困難，也給水稻新品種的培育帶來 了阻礙。也給水稻新品種的選育工作增加了難度。
RNA結(jié)合蛋白是一種含有RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA binding motif)的蛋白質(zhì)，它 廣泛存在于生物體中。RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由80—90個氨基酸殘基組成，RNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域由兩個高度保守的亞序列組成。RNP1由8個氨基酸殘基(K/R) G (F/Y) (G/A) FV X (F/Y)組成，而RNP2由6個氨基酸殘基(L/1) (F/Y) (V/I) (G/K) (G/N) L組成。 RNP1和RNP2分別位于RRM 二級結(jié)構(gòu)P 1- a 1- 0 2- P 3- a 2- P 4中0 3禾口 P 1反向 平行的片層結(jié)構(gòu)中央位置(Dreyfuss et al， Trends Biochem. Sci， 1988， 13: 86-91)。 RNA結(jié)合蛋白廣泛存在于人、動物、植物、真菌、細菌等不同物種中，在 進化上十分保守，是鑒定物種起源與演化及物種間親緣關(guān)系的理想基因。RNA結(jié)合 蛋白參與RNA的合成、加工、降解和運輸?shù)娜窟^程。RNA結(jié)合蛋白基因是水稻中 一類大的基因家族，在水稻生長和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，如RNA結(jié)合蛋白AK061072
(KOME接受號)。

發(fā)明內(nèi)容
4本發(fā)明的一個目的是提供一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法。
本發(fā)明所提供的輔助篩選秈稻和粳稻的方法，是檢測待測水稻基因組中編碼序 列表中序列4所示蛋白的基因的內(nèi)含子中是否缺失如下a)或b)所示片段，若缺 失，則所述待測水稻為候選秈稻，若不缺失，則所述待測水稻為候選粳稻
a) 序列表中序列3中自5'末端第717-855位核苷酸所示的DNA片段；
b) 核苷酸序列與a)限定的序列具有97%以上的同源性、且長度為134bp-144bp 的DNA片段。
其中，所述編碼序列表中序列4所示蛋白的基因為如下1)或2)所示基因
1) 序列表中序列3所示的DNA分子；
2) 與1)限定的DNA分子具有97%以上同源性且編碼序列表中序列4所示蛋白 的DNA分子；
其中，所述缺失可以通過PCR擴增檢測。
所述PCR擴增，可以在所述缺失片段的兩側(cè)設(shè)計引物，使所擴增的目的片段可 以是在上述l)或2)中所述基因中的、至少包括上述a)或b)所述片段的任一片 段。
所述PCR擴增，也可以在缺失片段內(nèi)設(shè)計一條或兩條引物，若擴增得到產(chǎn)物， 則待測水稻為候選粳稻，若擴增得到不產(chǎn)物，則待測水稻為候選秈稻。
所述PCR擴增中所用的引物具體可以是如下引物其中的一條引物序列如序列 表中序列l(wèi)所示，另一條引物序列如序列表中序列2所示。
所述PCR擴增檢測中，在得到PCR.產(chǎn)物后，可以通過電泳、酶切、測序等方法 進一步檢測產(chǎn)物中是否存在上述缺失；所述電泳可以是瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰 胺凝膠電泳等。
在用序列表中序列1和序列2所示的引物對擴增，并用瓊脂糖凝膠電泳時，若 所述PCR擴增的產(chǎn)物顯示為大于250bp小于400bp的條帶，則所述待測水稻為候選 秈稻，若所述PCR擴增的產(chǎn)物顯示為大于500bp小于750bp的條帶，則所述待測水 稻為候選粳稻。
用于輔助篩選秈稻和粳稻的引物也癘于本發(fā)明的保護范圍。 所述引物可以為擴增上述l)或2)中所述基因中的、至少包括上述a)或b)
所述片段的任一片段所用的引物。
所述引物具體如下其中的一條引物序列如序列表中序列l(wèi)所示，另一條引物
序列如序列表中序列2所示。本發(fā)明輔助篩選水稻秈粳亞種的方法可在發(fā)育早期篩選秈稻和粳稻品種或地 方種，了解秈稻和粳稻的遺傳分化程度，對秈、粳稻雜種優(yōu)勢的利用和培育高產(chǎn)、 優(yōu)質(zhì)的雜交稻具有重要指導作用，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成 本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應用，為水稻秈粳亞種種
質(zhì)的鑒定提供了一種快捷的選擇方法。


圖1為AK061072基因在日本晴和93-11中的基因組序列比對結(jié)果(來自TIGR 網(wǎng)站)及引物在基因組序列中位置的示意圖。
圖2為以日本晴和93-11的基因組DNA為模板，以RRMF1和RRMR1為引物的PCR 擴增產(chǎn)物的電泳圖。
圖3為17個水稻品種、地方種和2個野生稻基因組畫A為模板，以RRMF1和 RRMR1為引物的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 下述實施例中的水稻品種、地方種和野生稻均來自國家種質(zhì)資源庫。 實施例l、 KOME Accession No. AK061072的基因在秈稻和粳稻中不同表達模式 的發(fā)現(xiàn)
對秈稻(93-11)和粳稻(日本晴)不同發(fā)育時期葉片芯片數(shù)據(jù)進行分析，結(jié) 果基因AK061072在93-11中的表達明顯低于日本晴。推斷，造成基因差異表達的原 因可能是基因第一個內(nèi)含子部分存在插入/或缺失(InDel)。
實施例2、用于輔助篩選秈稻和粳稻的引物設(shè)計
應用比較基因組學的方法，首先對基因AK061072 (序列表中序列3所示基因) 在秈稻品種93-11和粳稻品種日本晴的基因組序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與日本晴 相比，在93-11中基因第一個內(nèi)含子中有139bp的缺失(即序列表中序列3自5， 末端第717-855位核苷酸)(圖l)。
為進一步驗證該差異是否真實存在，根據(jù)日本晴序列在139bp缺失的兩端設(shè)計 引物RRMF1和RRMR1 (序列分別如序列表中序列1和序列2所示)，并用93-11和 日本晴的基因組DNA為模板進行PCR擴增驗證。具體PCR擴增體系如下總反應體 系為25(^1，其中水稻基因組DNA模板10ng， Taq酶1U， 10xPCR緩沖液2. 5|_il， dNTP Mixture (2. 5 mM) 2. 5(il，混合引物(2. 5raM) l|il，余下體積加滅菌水補足到25|al。
6PCR反應條件如下先94。C預變性4min;然后94"C變性45S; 55。C退火45S; 72°C 延伸lmin，共32個循環(huán)；最后72"C保溫10min。 PCR擴增產(chǎn)物通過1. 2%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的大小。結(jié)果如圖2所示，由日本晴擴增得到的產(chǎn)物在瓊脂 糖凝膠上顯示為大于500bp小于750bp的條帶，由93-11擴增得到的產(chǎn)物在瓊脂糖 凝膠上顯示為大于250bp小于400bp的條帶(M為DL2000標記，l為93-11， 2為 日本晴，3為水對照)。
實施例3、用引物RRMF1和RRMR1輔助篩選水稻秈、粳亞種的應用
首先通過形態(tài)指標及相關(guān)文獻檢索隨機挑選8個秈稻和其地方種、9個粳稻和 其地方種和2個典型的粳型普通野生稻，這些材料均來自國家種質(zhì)資源庫93-11 (秈稻)、細麻柞谷(秈稻)、紫糯(秈稻)、桂朝2號(秈稻)、窄葉青(秈稻)、 IR24 (秈稻)、特青(秈稻)、深水稻(秈稻)、日本晴(粳稻)、越富(粳稻)、 光殼粳稻(粳稻)、云峰7號(粳稻)、臺北309 (粳稻)、京系17 (粳稻)、中 花ll (粳稻)、麗江(粳稻)、沈農(nóng)265 (粳稻)、東鄉(xiāng)普通野生稻(粳型普通野 生稻)和元江普通野生稻(粳型普通野生稻)。
分別提取以上材料基因組DNA，在引物RRMF1和RRMR1的引導下進行PCR擴增， 總反應體系25pl，其中水稻基因組DNA模板10ng， Taq酶1U， 10xPCR緩沖液2. 5(il， dNTP Mixture (2. 5 mM) 2. 5jal，混合引物(2. 5慮)lfil，余下體積加滅菌水補足 到25^1。 PCR反應條件為先94。C預變性4min;然后94"變性45S; 55。C退火45S; 72-C延伸lmin，共32個循環(huán)；最后72"C保溫10min。反應結(jié)束，用1. 2%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的大小，實驗設(shè)3次重復。
三次重復所得的實驗結(jié)果完全一致，如圖3所示，1一19編號分別為93-11、 細麻柞谷、紫糯、桂朝2號、窄葉青、IR24、特青、深水稻、日本晴、越富、光殼 粳稻、云峰7號、臺北309、京系17、中花ll、麗江、沈農(nóng)265、東鄉(xiāng)普通野生稻 和元江普通野生稻。
PCR檢測結(jié)果表明樣品編號l-8產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為大于250bp小于 400bp的條帶，為秈稻，而樣品編號9一19產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為大于500bp 小于750bp的條帶，為粳稻。20為水對照，則無擴增產(chǎn)物。
對照形態(tài)指標及相關(guān)文獻結(jié)果，引物RRMF1和RRMR1輔助篩選水稻秈粳亞種、 地方種和普通野生稻的準確率為100%，因此引物RRMF1和RRMR1可用作水稻秈粳亞 種的輔助篩選標記。序列表
〈110〉中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所
<120>—種輔助篩選秈稻和粳稻的方法及其專用引物
〈130〉CGGNAC92083
<160>4
〈210〉1
〈211〉20
<212>腿
<220> <223〉
<400>1
g鄉(xiāng)a3tcca ctagatgagg 20
<210>2
〈211>20
〈212〉DNA
<220> <223〉
〈400〉2
gggagtatac tcacgtatcc 20
<210〉3
<211>2400
<212>腿
<213>水稻屬水稻(C>o;za ra//vfl var. Nipponbare)
8<400〉3
CCtt3tCttC
ccaccctctt ccgcgccgcc cgccaccggc tggaggagga ttgttggtaa ccggctccgt tcatagtttc
3ttt3t3C3t
ctaggattta tsgtagttas aactacagag
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3tC"ttt3tct
gtatacaatg ttattgattg ggccatggat ttstctsccc tctgcccttt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 114〇 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 174 0 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 24 00
<210〉 4 〈211〉 264 〈212〉 PRT
<213〉 tK稻屬tK稻(Oyzasaf/vavar. Nipponbare) <400〉4
Met Ala Ala Thr Leu Phe Ser Thr Ser Leu Thr Pro Thr Phe Leu Pro 15 10 15
Ala Val Pro Cys Pro Lys Pro Ala Pro Pro Ala Ser Ala Cys Phe Pro
920 25 30
Cys Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ala Leu Ala Ala Pro Pro Ala Pro Leu 35 40 45
Arg Arg Arg Leu Ser Pro Val Ala Val Ala Val Ser Ser Glu Val Glu 50 55 60
Glu Glu Glu Gly Gly Ala Glu Ser Glu Gly Glu Phe Ala Glu Asp Leu 65 70 75 80
Lys Val Phe Val Gly Asn Leu Pro Phe Ser Val Asp Ser Ala Gin Leu 85 90 95
Ala Gly Leu Phe Glu Gin Ala Gly Ser Val Glu Met Val Glu Val Val 100 105 110
Tyr Asp Arg Gin Thr Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Phe Val Thr Met 115 120 125
Ser Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ala Ala lie Glu Gin Phe Asn Gly Tyr 130 135 140
Thr Phe Gin Gly Arg Pro Leu Arg Val Asn Ser Gly Pro Pro Pro Pro 145 150 155 160
Arg Asp Asp Phe Ala Pro Arg Ser Pro Arg Gly Gly Gly Ser Asn Phe 165 170 175
Asp Ser Ser Asn Lys Leu Tyr Val Gly Asn Leu Ala Trp Gly Val Asp180 185 190
Asn Ser Thr Leu Glu Asn Leu Phe Ser Glu Gin Gly Thr Val Leu Asp 195 200 205
Ala Lys Val lie Tyr Asp Arg Glu Ser Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly 210 215 220
Phe Val Thr Tyr Gly Ser Ala Glu Glu Val Asn Asn Ala lie Ser Asn 225 230 235 240
Leu Asp Gly Val Asp Leu Asp Gly Arg Gin lie Arg Val Thr Val Ala 245 250 255
Glu Ser Lys Pro Arg Arg Gin Phe 260
權(quán)利要求
1、一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法，是檢測待測水稻基因組中編碼序列表中序列4所示蛋白的基因中是否缺失如下a)或b)所示片段，若缺失，則所述待測水稻為候選秈稻，若不缺失，則所述待測水稻為候選粳稻a)序列表中序列3中自5’末端第717-855位核苷酸所示的DNA片段；b)核苷酸序列與a)限定的序列具有97％以上的同源性、且長度為134bp-144bp的DNA片段。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述編碼序列表中序列4所示蛋白的基因為如下l)或2)所示基因1) 序列表中序列3所示的DNA分子；2) 與1)限定的DNA分子具有97。/。以上同源性且編碼序列表中序列4所示蛋白的DNA分子。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述缺失是通過PCR擴增檢測的。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中，所用的引物序列位于所述基因的序列內(nèi)、并且其中至少一條引物的序列位于所述片段的序列內(nèi)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中，所用的引物序列位于所述基因的序列內(nèi)、并分別位于所述片段的兩側(cè)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中所用的引物如下其中的一條引物序列如序列表中序列l(wèi)所示，另一條引物序列如序列表中序列2所示。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述PCR擴增檢測包括對所述PCR擴增的產(chǎn)物進行電泳的步驟。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述電泳為瓊脂糖凝膠電泳；在所述瓊脂糖凝膠上，若所述PCR擴增的產(chǎn)物顯示為大于250bp小于400bp的條帶，則所述待測水稻為候選秈稻，若所述PCR擴增的產(chǎn)物顯示為大于500bp小于750bp的條帶，則所述待測水稻為候選粳稻。
9、 用于輔助篩選秈稻和粳稻的引物，為擴增在權(quán)利要求l中所述基因中的、至少含有權(quán)利要求1中所述片段的任一片段的引物。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的引物，其特征在于其中的一條引物序列如序列表 中序列1所示，另一條引物序列如序列表中序列2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法及其專用引物。該方法，是檢測待測水稻基因組中編碼序列表中序列4所示蛋白的基因中是否缺失如下a)或b)所示片段，若缺失，則所述待測水稻為候選秈稻，若不缺失，則所述待測水稻為候選粳稻a)序列表中序列3中自5’末端第717-855位核苷酸所示的DNA片段；b)核苷酸序列與a)限定的序列具有97％以上的同源性的DNA片段。本發(fā)明輔助篩選水稻秈粳亞種的方法可在發(fā)育早期篩選秈稻和粳稻品種或地方種，了解秈稻和粳稻的遺傳分化程度，對秈、粳稻雜種優(yōu)勢的利用和培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的雜交稻具有重要指導作用，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應用，為水稻秈粳亞種種質(zhì)的鑒定提供了一種快捷的選擇方法。
文檔編號C12Q1/68GK101487055SQ20091007779
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者朱立煌, 李德軍, 李曉兵 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所