專利名稱：：一種與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
：花粉萌發(fā)、花粉管生長是種子植物有性生殖的重要環(huán)節(jié)。種子植物必須依賴花粉管傳遞精子與卵細胞融合，完成受精作用。花粉管中的代謝活動十分活躍，有很高的蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物合成速率，這些物質(zhì)均參與花粉管的頂端擴張和新細胞壁的合成等?；ǚ酃苁堑湫偷捻敹松L細胞，其生長具有方向性，因而花粉管為實驗研究提供了一種特殊的模式系統(tǒng)。有關(guān)花粉與花粉管中細胞骨架的研究結(jié)果多以被子植物為實驗材料觀察所得，裸子植物由于與被子植物的進化存在差別，花粉發(fā)育和精子產(chǎn)生過程更復雜，涉及幾次另外的有絲分裂，因此，裸子植物內(nèi)細胞骨架的分布也有所不同。微管由a和p兩種類型的微管蛋白亞基組成，兩種類型的微管蛋白亞基形成微管蛋白二聚體，微管蛋白二聚體是微管裝配的基本單位，微管是由微管蛋白二聚體組成的長管狀細胞器結(jié)構(gòu)。微管蛋白在植物花粉的萌發(fā)和極性生長中具有重要的作用，目前對于微管在花粉萌發(fā)和花粉管生長中的作用的研究僅限于蛋白水平，而沒有從基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平進行研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白，名稱為/V71^/，來源于松科、云杉屬的青桿(尸/ceaw7soh/MaW.-尸'maWe^s")，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的由l)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由45l個氨基酸殘基組成，為了使1)中的PwTUAl便于純化，3可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標簽。表l.標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述2)中的PwTUAl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述2)中的PwTUAl的編碼基因可通過將序列表中序列1的自5'末端第4-1356位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。上述與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)蛋白的cDNA基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)蛋白的cDNA基因具體可為如下l)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列i的自5'末端第4-1356位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼上述與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼上述與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白的DNA分子。所述步驟4)中的基因，與l)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由1356個堿基組成，其開放閱讀框架(0RF)為自5'末端第4-1356位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的PwTUAl。上述嚴格條件可為在6xSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2xSSC，0.1%SDS和lxSSC，0.1%SDS各洗膜一次。擴增上述尸w7IM/基因全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。含有上述與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)蛋白編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有尸W7IZ4/基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pC腦IA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。攜帶有本發(fā)明與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)蛋白編碼基因Av71^7的植物表達載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導、基因槍法或農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化到植物細胞或組織中。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是擬南芥等被子植物，也可以是青桿等裸子植物。使用尸w77X4/基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育花粉萌發(fā)和/或花粉管生長速度提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育花粉萌發(fā)和/或花粉管生長速度提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)胫参镏校玫交ǚ勖劝l(fā)和/或花粉管生長速度提高的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物可為擬南芥等被子植物，也可為青桿等裸子植物。本發(fā)明從青桿中克隆出Av7I^7基因并將其連接到表達載體上，分別利用基因槍法和農(nóng)桿菌侵染法將該基因?qū)肭鄺U花粉和擬南芥花粉中。實驗結(jié)果表明，所獲得的轉(zhuǎn)基因青桿花粉的萌發(fā)率可達92.4±12%，所獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉的萌發(fā)率可達88士6%;轉(zhuǎn)基因青桿花粉管的生長速度可達13.7土1.38um/h，轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管的生長速度可達63.3土8.7um/h。在硼離子和鈣離子脅迫環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度比野生型或轉(zhuǎn)入空載體的擬南芥花粉管表現(xiàn)出優(yōu)勢。當培養(yǎng)基中含有0.1g/L硼酸時，轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為20.0土2.9um/h，轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-1-ZV7IM7的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為42.7±3.7ym/h;當培養(yǎng)基中含有20mM轉(zhuǎn)離子時，轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為16.7土2.3ym/h，轉(zhuǎn)入重組表達載體？81121-1-尸>^71^/的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為35.6士3.1iim/h。將本發(fā)明的蛋白在GenBank中進行比對，結(jié)果表明，該蛋白與已公布的擬南芥、水稻、棉花和楊樹的基因組中的微管蛋白的同源性都比較高，并且該蛋白具有花粉中專一表達的特性。本發(fā)明的與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究，提高植物的花粉萌發(fā)率和/或花粉管生長速度、提早開花、提高植物的生殖效率、縮短育種進程，對于生長發(fā)育緩慢的木本類植物進行生殖發(fā)育調(diào)控、基因工程育種、加速木本類植物的遺傳改良具有重要的理論及實際意義。圖1為Av71^7基因在青桿各組織中的表達情況圖2為轉(zhuǎn)入空載體和轉(zhuǎn)入iV7IZ4/基因的青桿花粉萌發(fā)率的測定結(jié)果圖3為轉(zhuǎn)入空載體和轉(zhuǎn)入/VnZ47基因的青桿花粉管生長速度的測定結(jié)果圖4為轉(zhuǎn)入空載體和轉(zhuǎn)入/V7T^/基因的擬南芥花粉萌發(fā)率的測定結(jié)果圖5為轉(zhuǎn)入空載體和轉(zhuǎn)入iV7IM7基因的擬南芥花粉管增長長度的測定結(jié)果具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例l、與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因/V7I^/的獲得1、基因尸w77X47的中間序列的獲得于青桿(ZhangLY,LinJX，etal.PlantScience,2007，172:1210-1217.)花序開放的晴天上午，用消毒過的鑷子，取下黃色的花粉塊，放在白色潔凈的紙上，然后放入消毒過的干燥玻璃瓶內(nèi)，置于室內(nèi)陰干，再分裝于干燥的玻璃瓶內(nèi)，密封，置于-2(TC冰箱里貯藏備用。提取青桿花粉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以該cDNA為6模板，根據(jù)GenBank中已公布的擬南芥、水稻、棉花和楊樹的微管蛋白編碼基因的高度保守區(qū)設(shè)計簡并引物5，-GATGCHTTCWACACHTTYTTYAG-3，和5'-AGGGCRGCVAGRTCCTCACG-3'，進行PCR擴增。所設(shè)計的引物中，H表示A、T或C，W表示A或T，Y表示C或T，R表示A或G，V表示G、A或C。PCR反應條件先94。C預變性5min;然后94""C30sec，56°C30sec，72°Clmin，共35個循環(huán)；再72"C延伸5min。回收上述PCR反應產(chǎn)物，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得約879bp的條帶，即基因iV7IZ47的中間序列。2、3'RACE的獲得根據(jù)上述步驟1獲得的基因/V7T^7的中間序列設(shè)計3'RACE引物5，-CTGGAACACACCGATGTGGC-3，，利用3，PCR引物5，-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA陽3，禾口上述3，RACE引物進行PC財廣增。PCR反應條件:先94。C預變性5min;然后94。C30sec，62°C30sec，72°Clmin，共35個循環(huán)；再72。C延伸5min?；厥丈鲜鯬CR反應產(chǎn)物，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢湖〖，結(jié)果獲得約774bp的條帶，即基因iV7IM7的3'端序列。3、5'RACE的獲得根據(jù)上述步驟l獲得的基因iV7I^/的中間序列設(shè)計5'RACE引物5，國GAACCGAGACCAGAACCAGTTCC-3，，5，PCR弓|物5，-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3，和上述5，RACE弓I物進行PCR擴增。PCR反應條件:先94。C預變性5min;然后94。C30sec，62°C30sec，72°Clmin，共35個循環(huán)；再72"C延伸5min?；厥丈鲜鯬CR反應產(chǎn)物，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得約452bp的條帶，即基因/V7I/^的5'端序列。4、全長7Vr047基因cDNA序列的獲得為獲得全長尸w7I^/基因的cDNA序列，分別在步驟3和步驟2擴增出的5'RACE和3'RACE序列兩端設(shè)計引物5'-ATGAGAGAGTGCATCTCGATCCAC-3'禾口5'-TCAGTACTCGCCTCCCTCATCACC-3'，以青桿花粉cDNA為模板進行PC財廣增。7PCR反應條件:先94。C預變性5min;然后94。C30sec，56°C30sec，72°C卯sec，共35個循環(huán)；再72'C延伸5min?；厥丈鲜鯬CR反應產(chǎn)物，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得1356bp的條帶，回收該條帶連入pMD18-T克隆載體中并進行序列測定。測序結(jié)果表明，獲得的全長iV7IZ47基因的核苷酸序列如序列表中序列l(wèi)所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。利用BLAST軟件對上述獲得的全長/V7I/力基因與GenBank中己公布的擬南芥、水稻、棉花和楊樹的微管蛋白的編碼基因進行同源性比較，結(jié)果表明，其同源性為分別為88.47%、96.9%、97.78%和99.78%。。實施例2、通過半定量RT-PCR分析iV77X47基因的組織表達特異性分別提取青桿花粉、針葉、樹皮和根組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;然后分別以上述各組織的cDNA為模板，以5'-TGCATGATCTCCAATTCGAC-3'禾口5'-GCACTGTTCTCAACATGAAG-3，為引物進行PCR擴增，檢測尸wra4/基因在青桿不同組織中的表達情況。同時以EFl-a基因作為內(nèi)參，擴增EFl-a基因的5'引物為5，-AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3，，3'引物為5，-AACGACCCAATGGAGGATAC陽3'。PCR反應條件先94。C預變性5min;然后94。C10sec，56°C10sec，72°C20sec，共28個循環(huán)；再72"C延伸5min。iV7I^/基因在各組織中的表達情況如圖l所示。結(jié)果表明，只有花粉中有iVr"47基因的表達，而其他組織中沒有該基因。實施例3、培育花粉萌發(fā)率和花粉管生長速度高的轉(zhuǎn)基因青桿花粉和擬南芥1、表達載體的構(gòu)建將質(zhì)粒PBI121(購自Clontech公司)和含有Lat52啟動子的質(zhì)粒pLat52-7(DavidTwell,RodWing，JudyYamaguchietal.Isolationandexpresstionofananther-specificgenefromtomato,MolGenGenet,1989,217:240245;DavidTwell,TheodoreMKlein,MichaelEFrommetal.Transientexpressionofchimericgenesdeliveredintopollenbymicroprojectilebombardment.PlantPhysiol,1989,91:12701274.)分別用限制性內(nèi)切酶州'^////和5"附7//進行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物相連接獲得重組載體PBI121-1;取2nl上述實施例l獲得的7V7I^/基因與pMD18-T載體相連接，操作步驟按照Promega公司產(chǎn)品pMD18-TVectorsystem的說明書進行；將獲得的連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶^al和SamM進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的質(zhì)粒PBI121-1相連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc感受態(tài)細胞，并涂布在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-卩-D-半乳糖苷、X-gal和100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜并進行菌落PCR鑒定；同時堿法提取質(zhì)粒DNA進行序列測定。測序結(jié)果表明，尸w7I^7基因已正確連接到質(zhì)粒PBI121-l上，將得到的重組表達載體命名為PBI121-l-尸w77X^。2、基因槍法瞬時轉(zhuǎn)化/V7I^/基因于青桿花粉中以及轉(zhuǎn)基因花粉萌發(fā)率和花粉管生長速度的測定將青桿花粉用培養(yǎng)基(含有15%質(zhì)量百分含量蔗糖、0.03%質(zhì)量百分含量硝酸鈣、0.01X質(zhì)量百分含量硼酸和5mM檸檬酸-磷酸緩沖液，pH5.8)懸浮培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中部，形成直徑2cm的圓斑。分別將lug、2.5ug和5ug的上述步驟l構(gòu)建的重組表達載體PBI121-l-Av7I^/用鎢粉包裹后，利用PDS-1000/He基因槍(購自美國Bio-Rad公司)轟擊上述培養(yǎng)的青桿花粉。同時以未轉(zhuǎn)入任何質(zhì)粒的青桿花粉和轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PBI121-1的青桿花粉作為對照。將上述基因槍轟擊過的青桿花粉在室溫(25±1°C)下萌發(fā)。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因青桿花粉的萌發(fā)和生長情況，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒12h和24h時，轉(zhuǎn)基因花粉的萌發(fā)率和花粉管生長速度的測定結(jié)果如圖2和圖3所示。其中CK表示未轉(zhuǎn)入任何質(zhì)粒的青桿花粉，0表示轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PBI121-1的青桿花粉。實驗設(shè)三次重復。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入重組表達載體81121-1-/^71^7的轉(zhuǎn)基因花粉的萌發(fā)率提高，萌發(fā)率可達92.4±12%;且轉(zhuǎn)基因花粉的花粉管生長速度也明顯加快，轉(zhuǎn)基因花粉管的生長速度可達13.7士1.38um/h。3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的培育用上述步驟1構(gòu)建的重組表達載體PBI121-1-PwTUA1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-l-PwTUAl的農(nóng)桿菌的單克隆接種于含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28。C振蕩培養(yǎng)兩天。將發(fā)酵液3000rpm/min離心5分鐘，所得農(nóng)桿菌沉淀用含5。/。蔗糖和0.03。/。SilwetL-77的侵染液懸浮。采用沾花浸染法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型野生型擬南芥(Col-0)，收獲該當代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株所接的種子(T!代)，在含有50mg/LGM的MS培養(yǎng)基篩選萌發(fā)的種子。將在上述培養(yǎng)基上萌發(fā)的Ti代幼苗移到培養(yǎng)土中，收獲種子(T2代)，然后經(jīng)相同的篩選過程得到純合的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。最后將T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子直接播種到培養(yǎng)土中，長出的丁3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在長日照條件下生長兩周左右開花。同時以未轉(zhuǎn)入任何質(zhì)粒的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PBI121-1的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥作為對照。取上述轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PBI121-1的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥和上述T3代轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-l-PwTUAl的轉(zhuǎn)基因擬南芥的即將開放的花的花藥，進行花粉的萌發(fā)和培養(yǎng)。將花藥在室溫下放置2小時，使其失水；然后將花藥置于花粉萌發(fā)培養(yǎng)基上(花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的組成為18g/L蔗糖，0.01g/L硼酸，lmM硫酸鎂，lmM氯化鈣，lmM硝酸鈣和0.5g/L瓊脂)。6小時后，通過顯微鏡觀察花粉的萌發(fā)情況和花粉管的生長情況，測量花粉管的長度。轉(zhuǎn)基因花粉的萌發(fā)率和花粉管生長速度的測定結(jié)果如圖4和圖5所示。圖4中，WT表示轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PBI121-1的擬南芥，Lat52:PwTUAl表示轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-l-PwTUAl的轉(zhuǎn)基因擬南芥。圖5中，2表示轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PBI121-1的擬南芥，l表示轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-l-PwTUAl的轉(zhuǎn)基因擬南芥。實驗設(shè)三次重復。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-l-PwTUAl的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉的萌發(fā)率可達88±6%，花粉管的生長速度可達63.3士8.7tim/h。當培養(yǎng)基中硼酸的濃度為0.1g/L時，即為硼離子脅迫；當培養(yǎng)基中含有l(wèi)OmM氯化鈣和lOmM硝酸鈣時，即為鈣離子脅迫。硼離子脅迫時，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PBI121-1的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為20.0土2.9um/h，而轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-l-PwTUAl的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為42.7士3.7ym/h;鈣離子脅迫時，轉(zhuǎn)入質(zhì)f立PBI121-l的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為16.7土2.3um/h，而轉(zhuǎn)入重組表達載體PBI121-l-PwTUAl的轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉管生長速度為35.6士3.1wm/h。序列表〈110〉北京林業(yè)大學山東農(nóng)業(yè)大學〈120〉一種與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應用<130〉CGGNARZ92147<160>2〈210〉1〈211〉1356〈212〉DNA<213〉青桿(尸/ceavW&on7Mxyr-T5-wasfe7Ma>r.)<400>1atgagagagtgcatctcgatccacattggtcaggccggtatccaggtcggaaacgcttgc60tgggagctctactgcctcgagcacggcattcagcctgatggccagatgcctagcgataag120accgtcggtggcggagacgatgccttcaacactttcttcagcgaaactggagccggaaag180catgttccccgcgctgtatttgtagatctggagccgacggtcattgacgaggtgcggact240ggtacttaccgtcagcttttccatcctgagcagcttatcagcggcaaggaagatgcggcc300aacaactttgctcgtggtcattacaccattggcaaagaaattgtggacctctgcctcgac360cgtatccggaagctggccgacaactgcacgggtcttcagggattcctcgtcttcaacgca42011gtcggtggaggaactggttc"tggtxtcggttxcctcttactggaacgtctttcagtggat480tacggcaaaaaatccaaacttggattcactgtgtatccatcaccacaggtctcaacttcg540gtcgttgagccgtataacagcgttctttctacgcattctcttctggaacacaccgatgtg600gccgttctcctcgataatgaagcgatttacgacatttgccgtcgttctttggacattgaa660cgtcccacatacacaaatctgaaccgacttgtctcacaggtcatttcttcattgaccgcg了20tccctccgatttgacggtgccttgaatgtcgatgtaacggagttxcaaacaaacttggt:c780ccgtatccccgaatccactttatgctttcgtcttatgcccctgtgatctctgcagaaaag840gcctaccatgagcagctttctgtggcagaaattacaaacagcgcattcgagccgtcctcc900atgatggccaagtgcgatcct:cgccacggcaaatacatggcctgctgtctgatgtaccgc960ggagatgtcgtgcccaaggatgtcaatgccgccgtagcaaccattaagacgaagagaacc1020attcagtttgttgattggtgccccacaggattcaagtgcggaatxaattatcagcctccc1080accgttgttcccggSLggcgatctcgccaaggttcagagagccgtgtgcatgatctxcaat1140tcgaccagtgttgcagaggtgttctcgagaatcgatcataagttcgatctcatgtatgcc1200aaacgagcattcgttcattggtatgtgggcgagggtatggaagagggtgagttttctgag1260gcgcgtgaggatctggctgcccttg卿aggattatgaggaggttggcgccgagtctgca1320gaaggagaggaaggtgatgagggaggcgagtactga1356<210〉2<211〉451<212>PRT〈213〉青桿(尸/ceaw〃son',M"W'-尸'wa他ri7'/Ma,.)<400>1MetArgGluCyslieSerlieHislieGlyGinAlaGlylieGinVal151015GlyAsnAlaCysTrpGluLeuTyrCysLeuGluHisGlylieGinPro202530AspGlyGinMetProSerAspLysThrValGlyGlyGlyAspAspAla354045PheAsnThrPhePheSerGluThrGlyAlaGlyLysHisValProArg505560AlaValPheValAspLeuGluProThrVallieAspGluValArgThr6570758013GlyThrTyrArgGinLeuPheHisProGluGinLeulieSerGlyLys859095GluAspAlaAlaAsnAsnPheAlaArgGlyHisTyrThrlieGlyLys100105110GlulieValAspLeuCysLeuAspArglieArgLysLeuAlaAspAsn115120125CysThrGlyLeuGinGlyPheLeuValPheAsnAlaValGlyGlyGly130135140ThrGlySerGlyLeuGlySerLeuLeuLeuGluArgLeuSerValAsp145150155160TyrGlyLysLysSerLysLeuGlyPheThrValTyrProSerProGin165170175ValSerThrSerValValGluProTyrAsnSerValLeuSerThrHis180185190SerLeuLeuGluHisThrAspValAlaValLeuLeuAspAsnGluAla19520020514lieTyrAsplieCysArgArgSerLeuAsplieGluArgProThrTyr210215220ThrAsnLeuAsnArgLeuValSerGinVallieSerSerLeuThrAla225230235240SerLeuArgPheAspGlyAlaLeuAsnValAspValThrGluPheGin245250255ThrAsnLeuValProTyrProArglieHisPheMetLeuSerSerTyr260265270AlaProVallieSerAlaGluLysAlaTyrHisGluGinLeuSerVal275280285AlaGlulieThrAsnSerAlaPheGluProSerSerMetMetAlaLys290295300CysAspProArgHisGlyLysTyrMetAlaCysCysLeuMetTyrArg305310315320GlyAspValValProLysAspValAsnAlaAlaValAlaThrlieLys325330335ThrLysArgThrlieGinPheValAspTrpCysProThrGlyPheLys340345350CysGlylieAsnTyrGinProProThrValValProGlyGlyAspLeu355360365AlaLysValGinArgAlaValCysMetlieSerAsnSerThrSerVal370375380AlaGluValPheSerArglieAspHisLysPheAspLeuMetTyrAla385390395400LysArgAlaPheValHisTrpTyrValGlyGluGlyMetGluGluGly405410415GluPheSerGluAlaArgGluAspLeuAlaAlaLeuGluLysAspTyr420425430GluGluValGlyAlaGluSerAlaGluGlyGluGluGlyAspGluGly435440445GlyGluTyr450權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因為如下l)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列i的自5'末端第4-1356位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子；4)與l)的基因具有90X以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體。5、含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達盒。6、含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。7、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組菌。8、擴增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或任一片段的引物對。9、一種培育花粉萌發(fā)和/或花粉管生長速度提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，得到花粉萌發(fā)和/或花粉管生長速度提高的轉(zhuǎn)基因植物。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述植物為擬南芥或青桿。全文摘要本發(fā)明公開了一種與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的與花粉萌發(fā)和/或花粉管生長相關(guān)的蛋白及其編碼基因可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究，提高植物的花粉萌發(fā)率和/或花粉管生長速度、提高植物的生殖效率、縮短育種進程，對于生長發(fā)育緩慢的木本類植物進行生殖發(fā)育調(diào)控、基因工程育種、加速木本類植物的遺傳改良具有重要的理論及實際意義。文檔編號C12N1/00GK101503468SQ20091007989公開日2009年8月12日申請日期2009年3月13日優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日發(fā)明者于彥麗,張凌云,李彥澤,鄭成超申請人:北京林業(yè)大學;山東農(nóng)業(yè)大學