專利名稱：一種修飾的小干擾核酸及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種修飾的小干擾核酸及其制備方法。
背景技術(shù)：
RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 分子在mRNA水平關(guān)閉同源基因的表達(dá)或使該基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)又被形象 地稱為基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因 調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有 關(guān)RNA干擾的報道出現(xiàn)在1990年，由兩個不同的研究小組同時報道了轉(zhuǎn)基因植物中的RNA 干擾現(xiàn)象，以后又在線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了 RNA干擾現(xiàn) 象。1999年，Hamilton和Baulcombe在發(fā)生RNA干擾的植物中檢測到了長度為21-25個核苷 酸的RNA片段，這些RNA片斷被證明是RNA干擾所必需的，被稱為小干擾核酸(siRNA)。雙鏈 siRNA與細(xì)胞源性的相關(guān)酶和蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)。在RNA干擾過程中，雙鏈siRNA中的正義鏈被排除出復(fù)合體，反義鏈指導(dǎo) RISC結(jié)合到靶mRNA的同源位點(diǎn)，然后由復(fù)合物中的核糖核酸酶111降解靶mRNA，從而關(guān)閉 靶基因的表達(dá)。但是，由于小干擾核酸(siRNA)的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)容易被核酸酶降解，因此人 們對合成的siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，以增加siRNA的血清穩(wěn)定性，從而有效地抑制目的基因的 表達(dá)。目前，由于人們對siRNA在血清中的降解過程和機(jī)制缺乏足夠的了解，只能依靠 各自的經(jīng)驗(yàn)隨機(jī)地選擇siRNA分子中的多個核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾。這種修飾策略雖然能很 好地提高siRNA分子的血清穩(wěn)定性，但由于缺乏理論的指導(dǎo)，通常在siRNA分子中引入了過 量的修飾，增加了修飾后的siRNA的潛在細(xì)胞毒性，并在很多情況下降低了 siRNA的生物學(xué) 活性，因而制約了修飾后的siRNA在體內(nèi)的應(yīng)用。另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修飾的做法，也限制了一些具有較 好穩(wěn)定效果，但細(xì)胞毒性相對較大的修飾方法在體內(nèi)研究中的應(yīng)用。因此，設(shè)計具有針對性的修飾方案，通過最少的修飾來實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的穩(wěn)定性目的是 目前迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的siRNA的修飾方案中存在盲目地引入大量的修飾 從而導(dǎo)致得到的修飾的小干擾核酸細(xì)胞毒性大問題，提供一種血清穩(wěn)定的、具有良好生物 活性的且細(xì)胞毒性較低的修飾的小干擾核酸。本發(fā)明提供了一種修飾的小干擾核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第 一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包括至少一個連續(xù)的CA序列或UG序 列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補(bǔ)的連續(xù)的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/ UG位點(diǎn)，其中，所述CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾 核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸。本發(fā)明通過對CA/UG位點(diǎn)進(jìn)行特異性的修飾，從而在僅引入少量修飾的情況下， 即可達(dá)到增加修飾后的小干擾核酸的血清穩(wěn)定性的目的，從而降低了修飾后的小干擾核酸 分子的潛在的細(xì)胞毒性，以及修飾對小干擾核酸的生物學(xué)活性的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種修飾的小干擾核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第 一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包括至少一個連續(xù)的CA序列或UG序 列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補(bǔ)的連續(xù)的UG序列 或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/ UG位點(diǎn)，其中，所述CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾 核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸。本發(fā)明的發(fā)明人對小干擾核酸分子在體內(nèi)的降解過程進(jìn)行了細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)在 CA/UG位點(diǎn)中僅引入少量修飾的情況下，即可提高修飾的小干擾核酸分子的穩(wěn)定性，大大降 低了由于隨機(jī)地引入大量的修飾而導(dǎo)致的潛在細(xì)胞毒性較高，以及修飾對小干擾核酸的生 物學(xué)活性的影響。根據(jù)本發(fā)明，所述的“第一片段”是指具有與基因編碼鏈的序列全部或部分同源的 序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指具有與基因編碼鏈的序列互補(bǔ)的序列的核苷酸片 段。所述“互補(bǔ)”是指兩個核苷酸在雜交條件下能夠配對，例如，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T) 或尿嘧啶(U)之間能夠配對，以及胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)之間的配對。根據(jù)本發(fā)明，所述小干擾核酸分子的標(biāo)靶可以為各種基因，例如，可以將在細(xì)胞 內(nèi)的功能有待分析的基因作為標(biāo)靶，也可以將需要抑制其表達(dá)的基因作為標(biāo)靶，例如，可 以以與疾病或紊亂相關(guān)的基因作為標(biāo)靶，如癌基因、病毒基因、細(xì)胞膜表面受體基因、細(xì) 胞核受體基因或細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路上的基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)其標(biāo)靶基因，能 夠設(shè)計得到小干擾核酸分子(siRNA)，例如，將目的基因的靶標(biāo)序列或目的基因在NCBI Genbank中的序列號輸入各種小干擾核酸設(shè)計程序，如Insert Design Tool for the shRNA Vectors(Ambion)、shRNA Explorer (Gene Link)、siDirect(Yuki Naito et al. University of Tokyo)、 SiRNA at Whitehead(Whitehead Institute for Biomedical Research), BLOCK-iT RNAi Designer(invitrogen)、RNAi Design(IDT)，RNAi Explorer(Gene Link)、 siRNA Target Finder(Ambion)、或 siSearch(Stockholm Bioinformatics Center)等， 該設(shè)計程序?qū)鶕?jù)設(shè)計者的要求和siRNA的設(shè)計原則，針對所提供的基因或序列設(shè)計 siRNA。并且，有些程序能夠?qū)υO(shè)計好的siRNA做全基因組或mRNA轉(zhuǎn)錄組的同源性分析，從 而設(shè)計出對靶基因或靶序列特異的siRNA。上述提及的siRNA設(shè)計程序及其涉及的原則為 本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，其全部內(nèi)容在此一并引入作為參考。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾的小干擾核酸包括多個CA/UG位點(diǎn)，并且該多個CA/UG位點(diǎn) 中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的。此外，所述CA/UG位點(diǎn)中，只有反義鏈中的胞嘧啶核苷酸是經(jīng)過修飾的。在這種情況下，不但能夠提高所述修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性、維持其生物活性，還可以進(jìn)一步減少 在修飾的小干擾核酸分子中引入的修飾數(shù)量，從而進(jìn)一步地降低修飾引起的小干擾核酸的 潛在細(xì)胞毒性。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述修飾的小干擾核酸中，除了所述CA/UG位點(diǎn)中的核 苷酸以外，其它核苷酸是未經(jīng)過修飾的。在這種情況下，不但能夠提高所述修飾的小干擾核 酸的穩(wěn)定性、維持其生物活性，還可以使在修飾的小干擾核酸分子中引入的修飾數(shù)量最小 化，從而進(jìn)一步地降低修飾引起的小干擾核酸的潛在細(xì)胞毒性。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述修飾的小干擾核酸中，所述第一片段還可以包括 至少一個連續(xù)的UA序列，所述第二片段還可以包括至少一個連續(xù)的與所述第一片段的UA 序列互補(bǔ)的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點(diǎn)， 并且，所述UA/UA位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使UA/UA位點(diǎn)被修飾的小 干擾核酸的穩(wěn)定性高于UA/UA位點(diǎn)未被修飾的小干擾核酸。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)所述修飾的小干擾核酸的含有CA/UG位點(diǎn)和UA/UA位點(diǎn)時，除了對CA/UG位點(diǎn)進(jìn)行特異 性的修飾以外，對UA/UA位點(diǎn)中的至少一個核苷酸進(jìn)行特異性修飾，不但能夠降低細(xì)胞的 毒性，還能夠進(jìn)一步提高含有CA/UG位點(diǎn)和UA/UA位點(diǎn)的小干擾核苷酸的穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的修飾的小干擾核酸除了包括CG/CA位 點(diǎn)以外，還可以多個UA/UA位點(diǎn)，并且該多個UA/UA位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾 的。在優(yōu)選的情況下，所述UA/UA位點(diǎn)中，只有一個尿嘧啶核苷酸是經(jīng)過修飾的。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的修飾的小干擾核酸中，除了所述CA/UG 位點(diǎn)和UA/UA位點(diǎn)中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經(jīng)過修飾的。在這種情況下，不但能夠 提高所述修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性、維持其生物活性，還可以使在修飾的小干擾核酸分 子中引入的修飾數(shù)量最小化，從而進(jìn)一步地降低修飾引起的小干擾核酸的潛在細(xì)胞毒性。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾的小干擾核酸可以為單鏈分子也可以為雙鏈分子。當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為單鏈分子時，所述第一片段和第二片段之間的互補(bǔ)區(qū) 域形成雙鏈區(qū)域。當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為雙鏈分子時，該修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義 鏈，所述正義鏈可以為連續(xù)的核苷酸鏈，也可以為不連續(xù)的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續(xù)的 核苷酸鏈。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義鏈， 且所述正義鏈和反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈，所述第一片段位于正義鏈，所述第二片段位于 反義鏈。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義 鏈，所述正義鏈?zhǔn)前▋蓚€或兩個以上的正義鏈部分的不連續(xù)的核苷酸鏈；所述反義鏈為 連續(xù)的核苷酸鏈；所述第一片段位于一個或多個正義鏈部分，所述第二片段位于反義鏈。本發(fā)明中，術(shù)語“正義鏈”是指當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為雙鏈分子時，具有與基 因編碼鏈的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指指當(dāng)所述修飾 的小干擾核酸為雙鏈分子時，具有與基因編碼鏈的序列互補(bǔ)的序列的核苷酸片段。并且，當(dāng) 所述修飾的小干擾核酸為雙鏈分子且所述正義鏈和反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈時，術(shù)語“正 義鏈”和“第一片段”可以互換使用，術(shù)語“反義鏈”和“第二片段”可以互換使用。
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本發(fā)明中，術(shù)語“正義鏈部分”是指當(dāng)所述正義鏈為不連續(xù)的核苷酸時，用于組成 正義鏈的一部分核苷酸鏈；在所述正義鏈中，該正義鏈的所有正義鏈部分的總長度與所述 正義鏈的長度相等，并且，當(dāng)所述正義鏈部分中包括UA/UA位點(diǎn)時，術(shù)語“正義鏈部分”與 “第一片段”可以互換使用。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾的小干擾核酸可以由核糖核苷酸組成，也可以為包括核糖 核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“潛在細(xì)胞毒性”是指由于對核苷酸分子進(jìn)行修飾而造成的對細(xì) 胞的毒性作用。本發(fā)明中，所述修飾的方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，本發(fā)明對所述小分子 干擾核酸進(jìn)行的化學(xué)修飾為以下的一種或幾種(1)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中核糖的的修飾；(3)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中堿基的修飾。所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯鍵中的氧進(jìn)行修飾，包括硫代磷酸修飾 (Phosphorthioate)和硼烷化磷酸鹽修飾(Boranophosphate)。如圖所示分別用硫和硼烷 置換磷酸二酯鍵中的氧。兩種修飾都能穩(wěn)定小分子干擾核酸的結(jié)構(gòu)，保持堿基配對的高特 異性和高親和力。而硼烷化磷酸鹽修飾的小干擾核酸的疏水性強(qiáng)，易于在血漿中形成水合 蛋白，對人體的毒副作用低于硫代磷酸酯。
硫代磷酸修飾
硼烷化磷酸鹽修飾所述核糖修飾是指對核苷酸戊糖中羥基(2' -0H)的修飾。在核糖的羥基位置引 入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清核糖核酸酶不易識別小干擾核酸，增加了小干擾核 酸的穩(wěn)定性。使小干擾核酸具有更強(qiáng)的抵抗核酸酶水解的性能。對核苷酸戊糖中羥基的修 飾包括 2'-氟修飾(2' -fluro modification) ；2'-氧甲基修飾(2' -0ME) ；2'-甲氧 乙基修飾(2' -M0E) ；2,4' -二硝基苯酚修飾(2' -DNP modification)；鎖核酸(LNA)； 2'-氨基修飾(Amina modification) ；2'-脫氧修飾(2' -Deoxy modification)等等。
2'-脫氧修飾所述堿基修飾是指對核苷酸的堿基進(jìn)行修飾，如在尿嘧啶的5位點(diǎn)引入溴或碘的 5'-溴尿嘧啶(5 ‘ -bromo-uracil)和5'-碘尿嘧啶(5 ‘ -iodo-uracil)修飾是常使 用的堿基修飾方法，其他還有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修飾，2，6-二氨基嘌呤 (2，6-diaminopurine)修飾等。
-氟修飾
K
Bse
Lz0 0"CH2"CH2"0"CH32'-甲氧乙基修飾
、_ Base
？一 -0—^=0鎖核酸
、r
0"CH3
2'-氧甲基修飾
G^e
^O DHP
2,4' -二硝基苯酚修飾
H
V
O NH-
2'-氨基修飾
H
B
O H
8 溴尿嘧啶
碘尿嘧啶 N3-甲基脲嘧啶
2，6-二氨基嘌呤優(yōu)選情況下，所述修飾為對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -0H的 修飾。進(jìn)一步優(yōu)選為，所述修飾為所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -0H被甲 氧基或氟取代。上述修飾均可以增加所述小干擾核酸的血清穩(wěn)定性，增強(qiáng)其對血清核酸酶 水解的抵抗能力。本發(fā)明還提供了一種修飾的小干擾核酸的制備方法，其中，該方法包括根據(jù)未修 飾的小干擾核酸的核苷酸序列，并使用經(jīng)過修飾核苷酸替代所述未修飾的小干擾核酸的核 苷酸序列中相應(yīng)位置的核苷酸，來合成修飾的小干擾核酸，使得到的修飾的小干擾核酸包 括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段 包括至少一個連續(xù)的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA 序列或UG序列互補(bǔ)的連續(xù)的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述 第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位點(diǎn)，其中，所述CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸 是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸。優(yōu)選情況 下，使得到的修飾的小干擾核酸的CA/UG位點(diǎn)中，只有反義鏈中的胞嘧啶核苷酸是經(jīng)過修 飾的。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法可以包 括根據(jù)未修飾的小干擾核酸的核苷酸序列，并使用經(jīng)過修飾核苷酸替代所述未修飾的小 干擾核酸的核苷酸序列中相應(yīng)位置的核苷酸，來合成修飾的小干擾核酸，使得到的修飾的 小干擾核酸包括一個CA/UG位點(diǎn)，并且該一個CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾 的。優(yōu)選情況下，使得到的修飾的小干擾核酸的CA/UG位點(diǎn)中，只有反義鏈中的胞嘧啶核苷 酸是經(jīng)過修飾的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法可以 包括根據(jù)未修飾的小干擾核酸的核苷酸序列，并使用經(jīng)過修飾核苷酸替代所述未修飾的 小干擾核酸的核苷酸序列中相應(yīng)位置的核苷酸，來合成修飾的小干擾核酸，使得到的修飾 的小干擾核酸包括多個CA/UG位點(diǎn)，并且該多個CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的。優(yōu)選情況下，使得到的修飾的小干擾核酸的CA/UG位點(diǎn)中，只有反義鏈中的胞嘧啶核 苷酸是經(jīng)過修飾的。在一種優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得到的 修飾的小干擾核酸中，除了所述CA/UG位點(diǎn)中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經(jīng)過修飾的。在另一種優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得到 的修飾的小干擾核酸的第一片段還包括至少一個連續(xù)的UA序列，修飾的小干擾核酸的第 二片段還包括至少一個連續(xù)的與所述第一片段的UA序列互補(bǔ)的UA序列，所述第一片段的 UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點(diǎn)，并且，所述UA/UA位點(diǎn)中的至少一個核 苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使UA/UA位點(diǎn)被修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于UA/UA位點(diǎn)未 被修飾的小干擾核酸。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得到 的修飾的小干擾核酸除了包括CA/UG位點(diǎn)以外，還包括一個UA/UA位點(diǎn)，并且，所述UA/UA 位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使UA/UA位點(diǎn)被修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定 性高于UA/UA位點(diǎn)未被修飾的小干擾核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得 到的修飾的小干擾核酸除了包括CA/UG位點(diǎn)以外，還包括多個UA/UA位點(diǎn)，并且，所述UA/UA 位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使UA/UA位點(diǎn)被修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定 性高于UA/UA位點(diǎn)未被修飾的小干擾核酸。本發(fā)明中，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得到的修飾的小干 擾核酸的結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可以為各種小干擾核酸的存在結(jié)構(gòu)。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法 使得到的修飾的小干擾核酸可以為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈分子，所述第一片段和第二片段之間的 互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得 到的修飾的小干擾核酸可以包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈和反義鏈為連續(xù)的核苷酸 鏈，所述第一片段位于正義鏈，所述第二片段位于反義鏈。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得 到的修飾的小干擾核酸可以包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈?zhǔn)前▋蓚€或兩個以上的正 義鏈部分的不連續(xù)的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈；所述第一片段位于一個或 多個正義鏈部分，所述第二片段位于反義鏈。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的所述修飾的小干擾核酸的制備方法使得 到的修飾的小干擾核酸可以為為包括核糖核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。本發(fā)明中，合成小干擾核酸的方法可以為各種常規(guī)的小干擾核酸的合成方法， 或者委托專門從事核酸合成的生物技術(shù)公司合成，如委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司 (GenePharma)、廣州銳博生物科技有限公司、或英俊生物技術(shù)有限公司(invitrogen)進(jìn)行 合成。一般來說，用于合成小干擾核酸的方法包括以下四個過程(1)寡聚核糖核苷酸 的合成；⑵脫保護(hù)；⑶純化分離；⑷脫鹽。例如，具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的小干擾核酸化學(xué)合成的具體步驟如下(1)寡聚核糖核苷酸的合成在自動DNA/RNA合成儀(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上設(shè)定合成1毫摩爾的RNA，同時設(shè)定每個循環(huán)的偶聯(lián)時間為10-15分鐘， 起始物為固相連接的5’ -0-對二甲氧基-胸苷支持物，第一個循環(huán)在固相支持物上連接一 個堿基，然后在第n次(19 > n > 2)循環(huán)中，在第n_l次循環(huán)所連接的堿基上連接一個堿 基，重復(fù)此循環(huán)直至完成全部核酸序列的合成。(2)脫保護(hù)將連接有小干擾核酸的固相支持物加入到試管中，并在此試管中加入1毫升的乙 醇/乙胺(體積比為1 3)，然后密封，置于55-70°C溫箱中，孵育2-30小時，取出連接有 小干擾核酸的固相支持物并用雙蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脫液，并在室溫下干 燥30分鐘。然后，加入1毫升四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(1M)，室溫放置4-12小時，再 加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到小干擾核酸的粗產(chǎn)物。(3)純化分離將得到的小干擾核酸的粗產(chǎn)物溶解于2毫升濃度為1摩爾/毫升的乙酸銨水溶液 中，然后通過C18高壓液相色譜進(jìn)行分離，得到純化的小干擾核酸產(chǎn)物。⑷脫鹽用濃度為75重量％的乙醇水溶液洗滌純化的小干擾核酸產(chǎn)物2-4次(每次2毫 升)，除去鹽份，并室溫下干燥。然后將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫 升的緩沖液中(10mM Tris, pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，將此溶液加熱至95°C，然后緩緩將 此溶液冷卻至室溫，并維持室溫16-22小時，得到含有小干擾核酸的溶液。上文中給出多種實(shí)施方式的目的僅為示例性地對本發(fā)明進(jìn)行說明，而不是為了限 制本發(fā)明的范圍。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，除非特別說明，本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基 均為市售商品。實(shí)施例1選取下表1-55中的基因?yàn)榘谢颍⑽猩虾＜斨扑幖夹g(shù)有限公司 (GenePharma)合成表 1-55 中的 siRNA。實(shí)施例2通過以下方法分別對表1-55中所示的siRNA進(jìn)行血清穩(wěn)定性檢測、基因沉默效率 檢測和細(xì)胞毒性檢測1.血清穩(wěn)定性檢測將4 ii L濃度為20 ii M的未修飾的和不同化學(xué)修飾小干擾核酸加入到含有4 y L胎 牛血清和32iiL 1XPBS溶液中，血清的終濃度為10%;在37°C條件下將反應(yīng)體系孵育一定 的時間后取樣，一般為0，3和6小時；每次取10 y L樣本并進(jìn)行液氮速凍，以立即中止血清 核酸酶對siRNA的作用，然后將樣本保存于-80°C條件下備用。配置20%的聚丙烯酰胺凝膠，將3iiL的上樣緩沖液(30mM EDTA，36%甘油， 0.06%溴酚藍(lán))與siRNA的降解樣本進(jìn)行混合，然后上樣，在80mA的恒流條件下電泳。電 泳結(jié)束后，用lXSybr Gold染料(Invitrogen，Cat. 11494)進(jìn)行10分鐘的染色后照相，結(jié) 果如表1-55所示。
2.基因沉默效率檢測將在DMEM培養(yǎng)基(10% FBS，2mM L_谷氨酰胺，100個單位/毫升的青霉素和 100 u g/ml的鏈霉素)中培養(yǎng)的人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)接種到24孔板中(1X105細(xì)胞 /0. 5ml培養(yǎng)基/孔)。待細(xì)胞生長24小時后，細(xì)胞的融合度為50%左右時，將培養(yǎng)基換為 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。然后將帶有siRNA分離靶位點(diǎn)的重組螢火蟲熒光素酶報 告質(zhì)粒和pRL-TK (編碼海腎螢光素酶)的對照質(zhì)粒(Promega公司，Madison WI，USA)與化 學(xué)合成的siRNA通過Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美國)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每孔含 0. 17g重組質(zhì)粒和0. 017g pRL-TK對照質(zhì)粒，siRNA的終濃度為13nM。每種siRNA平行轉(zhuǎn) 染三個復(fù)孔，以只轉(zhuǎn)染同樣量的兩種報告基因質(zhì)粒，不轉(zhuǎn)染siRNA的三個復(fù)孔作為對照。4 小時后再將轉(zhuǎn)染介質(zhì)換成1ml DMEM培養(yǎng)基(10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，100個單位/毫升 的青霉素和100 u g/ml的鏈霉素)。24小時后收獲細(xì)胞，以10 ill細(xì)胞裂解液細(xì)胞，利用雙 熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)(Dual-Luciferase Assay System, Promega公司)和酶標(biāo)儀 (Novostar，BMG Labtechnologies GmbH,Germany)測定兩種熒光酶的活性，以未轉(zhuǎn)染siRNA 的孔中的報告基因的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)對照，通過以下公式計算得到siRNA對靶位點(diǎn)的沉默 效率，結(jié)果如表2所示。每種siRNA每次實(shí)驗(yàn)平行做3個復(fù)孔，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，結(jié)果如 表1-55所示。沉默效率=(實(shí)驗(yàn)組Firefly熒光素酶的表達(dá)量/實(shí)驗(yàn)組Renilla熒光素酶表達(dá) 量)/(對照組Firefly熒光素酶的表達(dá)量/對照組Renilla熒光素酶表達(dá)量)3、修飾siRNA的細(xì)胞毒性檢測將在DMEM培養(yǎng)基(10% FBS，2mM L_谷氨酰胺，100個單位/毫升的青霉素和 100 u g/ml的鏈霉素)中培養(yǎng)的人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)接種到24孔板中(1父105細(xì)胞/ 孔)；待細(xì)胞生長24小時后，細(xì)胞的融合度為50%左右時，將培養(yǎng)基換為Opti-MEM培養(yǎng)基 (Gibco公司)；然后將化學(xué)合成的siRNA通過Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美 國)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，siRNA的終濃度為13nM，每種siRNA平行轉(zhuǎn)染三個復(fù)孔，無siRNA的三 個轉(zhuǎn)染復(fù)孔作為對照；4小時后再將轉(zhuǎn)染介質(zhì)換成1ml DMEM培養(yǎng)基(10% FBS，2mML_谷氨 酰胺，100個單位/毫升的青霉素和100 u g/ml的鏈霉素)；24小時后吸去培養(yǎng)液，用PBS洗 滌一次，每孔加1ml PBS和10 ill MTT (噻唑藍(lán))染液，在37°C 5% C02的二氧化碳培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)4-6小時；每孔加0. lml酸化異丙醇，在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解；酶 聯(lián)免疫檢測儀測定570nm處各孔A值，并按照以下公式計算細(xì)胞生長抑制率，結(jié)果如表1-55 所示。細(xì)胞生長抑制率(％ )=(對照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值)/對照組平均A 值 X100%。表 1
12 表 2

%
表3
表 4 表 6 表 9
5
表 10
基因人 KAZRIN (NM—201628) (SEQIDNO:2)位點(diǎn)2151-2170BPSIRNA穩(wěn)定性表達(dá)抑制率生長抑制率10-1未修飾+32%0%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUAGCUGGACUUCCUCAUGC-510-2隨機(jī)修飾(2’-氧甲基修飾)++19%24%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUAGCUGGACUUCCUCAUGC-510-3A特異性修飾(2’-氧甲基修飾)++29%6%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUAGCUGGACUUCCUCAUGC-510-3B特異性修飾(2’-氧甲基修飾)+十30%}%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUA GCUGGACUUCCUCAUGC-5表11 表14 表16 表 19 表21 表 29 表31 表32
表 33
表 39 表 40 表 41 表 44 表 46 表 49 表 54 在上表1-55中黑體字母表示的“A”、“U”、“G”或” C”字母表示經(jīng)過修飾的核苷酸；“ + ”表示經(jīng)血清孵育后，siRNA主帶完全消失，可見明顯的降解條帶；“++”表示經(jīng)血清孵育后，siRNA主帶雖有降解但仍清晰可見，可見明顯的降解條 帶；“+++”表示經(jīng)血清孵育后，siRNA主帶清晰未見降解，未見明顯的降解條帶。另外，從上表1-55中可以看出，與經(jīng)過隨機(jī)修飾的小干擾核酸相比，本發(fā)明提供 的小干擾核酸在提高了穩(wěn)定性的同時，還顯著地降低了小干擾核酸的細(xì)胞毒性，并且對小 干擾核酸的表達(dá)抑制效率基本沒有影響，由此可見，本發(fā)明在僅引入少量修飾的情況下，即 可達(dá)到增加修飾后的小干擾核酸的血清穩(wěn)定性的目的，從而降低了修飾后的小干擾核酸分 子的潛在的細(xì)胞毒性，以及修飾對小干擾核酸的生物學(xué)活性的影響。SEQUENCE LISTING
cagcctggatgacctgggaccccagaaactgccgtttgggaggcagcaacagcaacgtgc4680
ccaggcaggcagttattcccacagagtgagccagaattgtagcagggcacttgaatgcag4740
agctgatgatttgaaaccaacgttcacccaacttgtcagaaatggcacttacatggttcg4800
atcttgctggagacaagtggacaattgggggtcactggcagagacagtattgcccaaaat4860
gttcacagcaggaggccagcaggcctgaggcaacacgggcaaccgcgaatgcctcttttg4920
gtttaaattatgccatcacaaccctctttcacccatgaggctccccatccctgacagcca4980
ggtgagcatttggagctggtttctcaacatgaggatgggttggttgttaaattaacaacc5040
tccacagtatcagattgagtgagctttgtctgctggaaaaacctgaaacgtcaactctgc5100
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cgagtgtggtcttggtccctgcagggcaatgtgggcatctggacctggggacgatgtgga5280
tgcacttcttggaaagctgttgtagcttgtgcctgtgggtggagaaggcacctgcctggt5340
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cggacctttcttttggaaatctgtctgtctgttggcatcgctgttttcagaccccaggct5460
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ctccaggggcatccaggcccctctgacctggggagaagaaggcccatgctcaggcccacc5700
tccctcttcccatcagagcccatgcgtcctgggcaccaccacttccactctgcttttcga 5760
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aacctctgagtctggcattcttgccaatggctggccagcg aggagaatctcccgagccct 5880
gacacacaaaggcattttgtggctgcagaggaaatgggttggctctgaacaaagatgcag 5940
tttctagggccgtggccccaaatcgcttccccgagagtga attttaacactgtaacaata 6000
aatactactgcacagcactt13.3.3.3.3.3.3.3.3.6047
<210>3
<211>2413
<212>DNA
<213>人類(Homo sapiens CDKN1B)
<400>3
cttcttcgtcagcctccctt,ccaccgccat attgggccac taaaaaaagg gggctcgtct60
tttcggggtgtttttctccccctcccctgt ccccgcttgc tcacggctct gcgactccga120
cgccggcaaggtttggagagcggctgggtt cgcgggaccc gcgggcttgc acccgcccag180
actcggacgggctttgccaccctctccgct tgcctggtcc cctctcctct ccgccctccc240
gctcgccagtccatttgatcagcggagact cggcggccgg gccggggctt ccccgcagcc300
cctgcgcgctcctagagctcgggccgtggc tcgtcggggt ctgtgtcttt tggctccgag360
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ttttgtttttttgagagtgcgagagaggcg gtcgtgcagacccgggagaa agatgtcaaa480
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ccccaagccctcggcctgca ggaacctcttcggcccggtggaccacgaag agttaacccg600
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gcttatagtctaaccatggtgctattattaggcttgcttgttaaacacaggtctaagcct 2640
agtatatcaa taaaacaaatacttatttcatttgaaaaaaaaaa 2694
<210>7
<211>3863
<212>DNA
<213> 大鼠(Rattus norvegicus kazrin)
<400>7
ctgcgccggaggagccggcg cttgccggtg cctgggggtc ggggcgcggg gaaacccggg60
ccgctggggtgacccaacag；gtagagccgg ggccacggcc ggccacgcgc cccccgcgtg120
catcatgcagctctttgtca‘ cctctctcgc ccccaggcca aaatcctgag catgatggaa180
gacaataagcagctcgcgctccgcatcgat ggggcggtcc agtcggccag ccaggaggtg240
accaacctgcgagccgaactcacggccacc aaccggagac tggcggaatt gagcggcgga300
ggcggcggccccggctcgggcccgggagctgcgaccagcgcctcggcagcagcggtgacg360
gtggctgactcggcggtggcgaccatggagaaccatcagcacggagctcaagtgctcctg420
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gaactccgggtgcagctggtacagaaggagcaggagctggccagagccagggaagccttg600
caagccatgaaagctgaccggaagcgcttaaagggcgagaagaccgacctggtgagccag660
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aactatgaacaacaccgcaaggagagtgaggatgctgtcaaagcgctggccaaggagaaa780
gacctgctggagcgagagaagtgggagctccgacggcaggccaaggaggccacggaccat840
gctgcggccctgcgctcccagctggacctcaaggacaaccgcatgaaggagctggaggcc900
gagctagccatggccaagcagtccttagccacactgaccaaggatgttcccaagaggcat960
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gacctcccactgactgccgccatccggcagagccaacagactctctaccactcccaccct1080
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gtcatctctgatgcttccgctgctgaaggtgaccggtcatctacaccgagcgacatcaac1200
tccccaagacaccggacacactccctctgcaacggcgacagtcccggcccagttcagaag1260
agcctacacaaccctattgtacagtcactagaggatcttgaagaccaaaaacggaaaaag1320
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aagtccctcgacccgggcctctttgatggtaccgcccctgattattacatagaggaagac1440
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tgagccttggagagtgtgcgagagtgtgcgtgcgcgtggggatgcggagcctgtgtgtgg1560
ggtgtgtgtgcacggaggcactcgccctcgtgggtgcgtgtagccaagcgcctggaacag1620
acagaaacacaaatgtgacccccaacccccctccgcgtcgtcacctctgtaatcgctgta1680
CcltclCCclCclclaccgtgtgtgactctgtcaaccccgttgtctctgagcgatacacttgtgt1740
ttgtttctctcgtttgttttgtttttcgatgttttttgggggggggggttgtttgtttgt1800
ttctgtttaaatccgtcgtgtttttgtttttaatttgcccctttctcctccctcctccct1860
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agaccataacccaccacagctagaacttatcaaacccttctgtgaagatcttgaccaatg1200
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gaggcgctatgtatattattatagctacctgctaaaaaatcacctggattacagacccgt1440
ggcactgctgtttcacaagatgatgtttgaaactattccaatgttcagtggcggaacttg1500
caatcctcagtttgtggtctgccagctaaaggtgaagatatattcctccaattcaggacc1560
cacgcggcgggaggacaagttcatgtactttgagttccctcagccattgcctgtgtgtgg1620
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權(quán)利要求
一種修飾的小干擾核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包括至少一個連續(xù)的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補(bǔ)的連續(xù)的UG或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位點(diǎn)，其特征在于，所述CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸包括多個CA/ UG位點(diǎn)，并且該多個CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述CA/UG位點(diǎn)中，只有胞嘧啶核 苷酸是經(jīng)過修飾的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾 核酸中，除了所述CA/UG位點(diǎn)中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經(jīng)過修飾的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述第一片段還 包括至少一個連續(xù)的UA序列，所述第二片段還包括至少一個與所述第一片段的UA序列互 補(bǔ)的連續(xù)的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點(diǎn)， 并且，所述UA/UA位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使UA/UA位點(diǎn)被修飾的小 干擾核酸的穩(wěn)定性高于UA/UA位點(diǎn)未被修飾的小干擾核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸包括多個UA/ UA位點(diǎn)，并且該多個UA/UA位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述UA/UA位點(diǎn)中，只有一個尿嘧 啶核苷酸是經(jīng)過修飾的。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸中，除了所述 CA/UG位點(diǎn)和UA/UA位點(diǎn)中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經(jīng)過修飾的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3、6-8中的任意一項(xiàng)所述的修飾的小干擾核酸，該修飾的小干擾核 酸為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈分子，所述第一片段和第二片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈區(qū)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3、6-8中的任意一項(xiàng)所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小 干擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈和反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈，所述第一片段位 于正義鏈，所述第二片段位于反義鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-3、6-8中的任意一項(xiàng)所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小 干擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈?zhǔn)前▋蓚€或兩個以上的正義鏈部分的不連續(xù) 的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈；所述第一片段位于一個或多個正義鏈部分， 所述第二片段位于反義鏈。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-3、6-8中的任意一項(xiàng)所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小 干擾核酸為包括核糖核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-3、6-8中的中的任意一項(xiàng)所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述修 飾為如下的修飾中的至少一種(1)對小干擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對小干擾核酸的核苷酸序列中核糖的修飾；(3)對小干擾核酸的核苷酸序列中堿基的修飾。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述修飾為對小干擾核酸的核 苷酸序列中核糖的2’ -OH的修飾。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述修飾為小干擾核酸的核苷 酸序列中核糖的2’ -OH被甲氧基或氟取代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種修飾的小干擾核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包括至少一個連續(xù)的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補(bǔ)的連續(xù)的UG或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位點(diǎn)，其特征在于，所述CA/UG位點(diǎn)中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸。本發(fā)明增加了修飾后的小干擾核酸的血清穩(wěn)定性的目的，并且降低了修飾后的小干擾核酸分子的潛在的細(xì)胞毒性，以及修飾對小干擾核酸的生物學(xué)活性的影響。
文檔編號C12N15/11GK101851619SQ20091008114
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者杜權(quán), 梁子才 申請人:北京大學(xué)