專利名稱：：一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻基部節(jié)間上生長(zhǎng)的分枝一般被稱為分蘗，是水稻特定類型的分枝。分蘗在水稻生產(chǎn)中是一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀。一方面，單株有效分蘗數(shù)決定了單位面積的穗數(shù)，而穗數(shù)又決定了單位面積的產(chǎn)量；另一方面，單株分蘗數(shù)目是組成株型結(jié)構(gòu)的重要因素，理想的株型結(jié)構(gòu)有助于通風(fēng)透光、提高光合效率、合理地吸收分配礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)有效分蘗和抑制無(wú)效分蘗。在生產(chǎn)實(shí)踐中，一方面，根據(jù)分蘗生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，采取適當(dāng)?shù)脑耘啻胧┐龠M(jìn)分蘗成穗；另一方面，根據(jù)遺傳學(xué)的理論培育具有理想分蘗數(shù)目的品種。因此，水稻分蘗機(jī)理的研究對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。一般認(rèn)為水稻的分蘗數(shù)目是受到多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀，很容易受環(huán)境影響。已報(bào)道多達(dá)23個(gè)影響水稻分蘗數(shù)目的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTLs)，分布在除第9，第10號(hào)之外其余的10條染色體上。此外，過(guò)去的研究還將與水稻分蘗生長(zhǎng)相關(guān)的性狀如水稻分蘗芽的休眠及葉齡進(jìn)行了QTL分析，并把這些相關(guān)位點(diǎn)在十二條染色體上都作了定位。盡管水稻的分蘗數(shù)目受多基因控制，但一些主效基因的單位點(diǎn)突變就能夠引起分蘗數(shù)目發(fā)生顯著變化。到目前為止，已經(jīng)分離和研究了一些分蘗數(shù)目發(fā)生改變的水稻突變體。日本科學(xué)家用Y射線輻射誘變水稻種子，分離得到5個(gè)不同的少分蘗突變體，分別命名為rc/7(rea^ce^c〃J/zT2〃/z^e力、rc/7c、rc/^和rc/5。這些rc/2突變體明顯受環(huán)境條件的影響，在高溫和高氮素營(yíng)養(yǎng)條件下，其分蘗數(shù)目幾乎恢復(fù)到正常水平。據(jù)此推測(cè)，突變體分蘗芽分化形成過(guò)程可能不受影響，而在隨后的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中存在缺陷，導(dǎo)致分蘗芽不能伸長(zhǎng)，從而引起分蘗數(shù)目減少。遺傳學(xué)分析表明，突變體是由單個(gè)隱性基因控制，并且r^厶rc"5被分別定位在水稻的第6，4，6號(hào)染色體上。在水稻同屬禾本科大麥中，也發(fā)現(xiàn)了一些少分蘗突變體如"w'c"7歷和r;^。水稻的另一類分蘗突變體，表現(xiàn)為單株分蘗數(shù)目增加。至少6個(gè)非等位的矮化突變體即JJ、07么q77、^7和d"表現(xiàn)出很強(qiáng)的分蘗能力，并且這些突變體植株矮小叢生。經(jīng)過(guò)遺傳連鎖分析，3控制這些性狀的基因位點(diǎn)大多被定位在相關(guān)染色體的標(biāo)記位點(diǎn)附近。其中，"《和"77基因已經(jīng)被相繼克隆。上述基因的研究結(jié)果表明水稻分蘗生長(zhǎng)調(diào)控涉及十分復(fù)雜的植物激素調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。最近，一類新的調(diào)控植物分枝發(fā)育的激素或激素合成的前體物質(zhì)獨(dú)角金內(nèi)酯(strigolactones)被鑒定出來(lái)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于類萜內(nèi)酯類，從植物的根部分泌出來(lái)，能防止植物過(guò)度分枝。獨(dú)角金內(nèi)酯首先作為根寄生雜草的種子發(fā)芽促進(jìn)劑被研究，全世界約有3000多種寄生植物，它們廣泛分布于不同的生態(tài)環(huán)境中，其共同特性是必須從寄主中掠奪某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分等以滿足自身生育的需要。寄生植物依其植株葉綠素的有無(wú)，分為半寄生植物和全寄生植物；同時(shí)依其寄生部位不同，又可分為根寄生植物和莖葉寄生植物。其中列當(dāng)屬和獨(dú)腳金屬分別為全寄生和半寄生植物，兩者均為寄生植物中最為重要的根寄生雜草，并在其生育與寄生習(xí)性等方面有許多相似性。根寄生植物的生活史包括兩個(gè)主要的生命階段自養(yǎng)階段和寄生階段。列當(dāng)與獨(dú)腳金種子經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)階段后，在寄主根系分泌的獨(dú)角金內(nèi)酯的誘導(dǎo)下萌發(fā)，萌發(fā)后種子的胚根通過(guò)吸器寄生到寄主植物根上，此時(shí)寄生物就開始由自養(yǎng)生長(zhǎng)向異養(yǎng)生長(zhǎng)階段(寄生狀態(tài))轉(zhuǎn)變，即開始吸附在寄主根上并穿入寄主根，通過(guò)與寄主根的維管束聯(lián)結(jié)來(lái)吸收其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與水分等，直至寄生物植株長(zhǎng)大出土、開花、結(jié)籽成熟。另有研究發(fā)現(xiàn)，這種天然萌發(fā)刺激物能召集有助于植物吸收營(yíng)養(yǎng)的共生菌，這一發(fā)現(xiàn)突出顯示了植物和真菌之間的密切關(guān)系。雖然目前關(guān)于獨(dú)角金內(nèi)酯的合成及作用機(jī)理尚有待于進(jìn)一步明確。但獨(dú)角金內(nèi)酯這種新的植物分枝控制因子為研究農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)中有益真菌共生體和破壞性寄生雜草的控制提供一個(gè)新的研究方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與植物分蘗控制相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白名稱為D27，來(lái)源于水稻，具體為如下(a)或(b)所示的蛋白(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物分蘗相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指保持與序列4所示蛋白具有30%以上同源性的取代和/或缺失和/或添加。4(b)中所述蛋白的氨基酸序列具體可如序列表中序列5所示。為了使(a)或(b)中的蛋白便于純化，可在所述蛋白的N端或C端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列l(wèi)、2或3所示的DNA序列缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述蛋白的氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發(fā)生的變異引起的，有的是由人工誘變處理引起。本發(fā)明所提供的編碼基因具體可為如下l)或2)或3)或4)或5)或6)所示的基因1)序列表中序列1自5'末端起第2237-7205位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)序列表中序列3所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與l)或2)或3)或4)限定的DNA分子雜交且編碼所述植物分蘗相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列有70%以上同源性且編碼所述植物分蘗相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增上述任一所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)具體可為如下l)、2)或3):1)一條引物的序列如序列表中序列6所示，另一條引物的序列如序列表中序列7所示；2)—條引物的序列如序列表中序列8所示，另一條引物的序列如序列表中序列9所示；3)—條引物的序列如序列表中序列IO所示，另一條引物的序列如序列表中序列l(wèi)l所示；上述任一所述蛋白在調(diào)節(jié)植物分蘗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述編碼基因在調(diào)節(jié)植物分蘗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述蛋白在調(diào)節(jié)植物中獨(dú)角金內(nèi)酯含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述編碼基因在調(diào)節(jié)植物中獨(dú)角金內(nèi)酯含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述植物具體可為水稻。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育分蘗增多的植物的方法。本發(fā)明所提供的培育分蘗增多的植物的方法，是將植物中含有的上述任一所述編碼基因滅活，獲得分蘗增多的植物。其中，所述滅活具體可以通過(guò)RNA干擾實(shí)現(xiàn)。所述植物具體可為水稻。本發(fā)明利用圖位克隆的方法從水稻矮桿多分蘗突變體中克隆并鑒定了控制分蘗數(shù)目的基因"i7。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明該基因編碼的蛋白D27在水稻體內(nèi)參與獨(dú)角金內(nèi)酯的合成，調(diào)控植株的分蘗或側(cè)枝的發(fā)育。獨(dú)角金內(nèi)酯是一類新的分枝調(diào)控因子，可以促進(jìn)根寄生雜草種子的發(fā)芽，召集有助于植物吸收營(yíng)養(yǎng)的共生菌。因此，可以利用基因工程技術(shù)調(diào)控水稻的分蘗性狀，調(diào)節(jié)植株養(yǎng)分利用效率及有效控制破壞性寄生雜草；Z^^基因在研究農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)中有益真菌共生體和破壞性寄生雜草的控制方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。圖1為水稻多分蘗突變體a^7的表型。圖2為pD27C載體圖譜及功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因水稻表型。圖3為RNA干擾的轉(zhuǎn)基因水稻表型。6圖4為質(zhì)譜分析水稻多分蘗突變體^y中獨(dú)角金內(nèi)酯的含量。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。水稻品種^WoAari和oVar/^7(簡(jiǎn)稱g^乃(IshikawaS,MaekawaM,AriteT，etal.Suppressionoftillerbudactivityintilleringdwarfmutantsofrice.PlantCellPhysiol.2005'46,79-86.)。帶有Ubiquitin啟動(dòng)子的載體pTCK303(WangZ,ChenC，XuY，"ai.Apracticalvectorforefficientknockdownofgeneexpressioninrice(OjyzaL).PlantMoLBiol.R印.2004,22，409-417.)。下述實(shí)施例中水稻是按照如下方法栽培得到的(1)水稻材料的田間栽培水稻種子在水中浸種2天后，移入37t:培養(yǎng)間催芽3天，然后將露白的種子播在苗床上進(jìn)行育秧，到4葉期時(shí)將水稻秧苗移栽入水田。(2)水稻材料的水培培養(yǎng)參照Kamachi等的方法(KamachiK，YamayaT，MaeT,"s丄Aroleforglutaminesynthetaseintheremobilizationofleafnitrogenduringnaturalsenescenceinriceleaves.PlantPhysiol.1991,96'411-417.)。7jC稻種子去殼后用70%的乙醇消毒1分鐘，再用30%的市售漂白液消毒2小時(shí)，用滅菌水漂洗6次后，點(diǎn)播在漂浮于水培溶液的尼龍網(wǎng)上。水培溶液每?jī)商旄鼡Q一次。實(shí)施例l、蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)將水稻(fty^幼&'raL.)矮桿多分蘗突變體^附r/27(^S7)的種子、野生型5^'Wah的種子分別按照上述田間栽培方法進(jìn)行栽培，苗的形態(tài)如圖l所示(A表示野生型幼iohn'，B表示矮桿多分蘗突變體^S7)。然后取葉片進(jìn)行DNA的提取。水稻基因組DNA的提取采用改進(jìn)的CTAB方法(MouZ，HeY,DaiY,"a丄Deficiencyinfattyacidsynthaseleadstoprematurecelldeathanddramaticalterationsinplantmorphology.ThePlantCell.2000，12，405-418.)從水稻葉片中提取基因組DNA。取100mg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于100WMQ仏0中。按照如下步驟進(jìn)行圖位克隆1、"i7基因的初步定位(通過(guò)SSR和CAPS標(biāo)記定位"27基因)由于D27基因被初步定位在第11染色體長(zhǎng)臂上，首先在第11染色體上選取一些SSR引物進(jìn)行目的基因的連鎖分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因和微衛(wèi)星RM206標(biāo)記緊密連鎖。根據(jù)該標(biāo)記附近區(qū)域已經(jīng)公布的EST序列數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增突變體和野生型基因組，發(fā)現(xiàn)STS標(biāo)記C189與該基因連鎖，目標(biāo)基因被定位在這兩個(gè)標(biāo)記間區(qū)域，遺傳距離為3.1cM。2、Zi7基因的精細(xì)定位為了進(jìn)一步縮小目的基因的界定區(qū)域，擴(kuò)大定位群體并發(fā)展了更多的CAPS標(biāo)記。首先，選配和構(gòu)建了必r^F朋2/iF朋么必7-/尸《似/^"^:孕和必7-Z尸《似/鈔^三個(gè)雜交組合。從這三個(gè)組合的F2分離群體篩選6000多個(gè)突變體表型單株用于基因連鎖分析。其次，通過(guò)比對(duì)已經(jīng)公布的"-7/和y^t鏢在定位區(qū)間內(nèi)秈粳稻亞種間基因組序列，尋找差異位點(diǎn)，發(fā)展CAPS標(biāo)記。在F2突變體群體中進(jìn)行標(biāo)記和目的性狀的連鎖分析時(shí)，首先用標(biāo)記RM206和C189篩選與目的基因之間發(fā)生交換的單株，然后用新的CAPS標(biāo)記對(duì)這些交換單株進(jìn)行連鎖分析，最后發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記P3和P6和目的基因緊密連鎖，與目的基因之間分別有3個(gè)和1個(gè)交換單株。最終將目的基因定位在BAC3上的兩個(gè)CAPS標(biāo)記界定的18kb區(qū)間內(nèi)。3、候選基因的鑒定和比較分析為了確定候選基因，測(cè)定了定位區(qū)域內(nèi)的突變體和野生型基因序列，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在定位區(qū)域內(nèi)的突變體的基因組序列發(fā)生了AAGG4個(gè)堿基缺失。為了明確該4堿基缺失導(dǎo)致突變體表型，對(duì)8個(gè)野生型品種和6個(gè)突變表型單株對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果表明所有野生型材料在這個(gè)位點(diǎn)都正常，而與標(biāo)記P3和P6共分離的交換單株在這個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了4個(gè)堿基缺失。這說(shuō)明該位點(diǎn)突變導(dǎo)致突變體產(chǎn)生多分蘗表型?；蝾A(yù)測(cè)軟件GENESCAN分析表明在定位區(qū)域18-kb區(qū)間內(nèi)有兩個(gè)開放閱讀框，突變位點(diǎn)發(fā)生在其中一個(gè)開放閱讀框內(nèi)，因此將該基因確定為候選基因。4、基因序列的獲得候選基因在KOME數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)沒(méi)有對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA序列，為了確定該基因表達(dá)而且堿基突變發(fā)生在基因的外顯子上，以野生型品種幼&hW幼苗的cDNA的第一條鏈為模板，采用ClonetechRACE技術(shù)對(duì)候選基因cDNA5，上游和3，下游非翻譯區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因的5，上游非翻譯區(qū)序列長(zhǎng)217bp，83'下游非翻譯區(qū)序列長(zhǎng)200bp，整個(gè)cDNA全長(zhǎng)為1,254bp。比對(duì)全長(zhǎng)cDNA和基因組序列發(fā)現(xiàn)該基因有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。缺失突變發(fā)生在該基因的第4個(gè)外顯子上，最終導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。Reeiction引物序列麼5'-CTTCAGATTCCATMCCTCACACGGCCC-3，5，-RACENested"i7-1:5'-CGAACCAGCTGTCCCGGTACACCG-3'NestedZi7-2:5'-AGCAGCACMGCGTGGTGGTCTCC-3'ZIS7:5'-GAAGCGMGCTACGTGATGAGGAGGTG-3'3，-RACENestedZi7:5'-GATGCCACCTTCAAGATTTTCCAGGG-3'實(shí)施例2、基因的功能與應(yīng)用一、基因的制備提取野生型品種幼iohW幼苗的mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用引物對(duì)"i7F/Z^7R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物測(cè)序，得到野生型品種中"^7基因的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。提取di7突變體幼苗的mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用引物對(duì)"i7F/Zi7R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物測(cè)序，得到突變體fl^7中/^7基因的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。"^F:5，-ATGGAGACCACCACGCTTGTGC-3，(序列6)，ZiTR:5，-TCAGATGGAGCAATTCACACC-3，(序列7)。與野生型水稻中/^7基因的cDNA序列相比，突變體必7中Zi7基因的cDNA序列缺失了4個(gè)核苷酸(其堿基為AAGG)，缺失突變發(fā)生在序列4的自5'末端起第557-560位。缺失突變發(fā)生在基因的第4個(gè)外顯子上，最終導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。二、基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)雙元載體pCAMBIA1300購(gòu)自Takara公司；農(nóng)桿菌(^gro6acferiw/HZ^yz/e/acie/^)株系EHA105購(gòu)自Takara公司。對(duì)含有全長(zhǎng)基因的BAC克隆0SJNBa0029K08(中國(guó)科學(xué)院國(guó)家基因研究中心)。進(jìn)行酶切圖譜分析，發(fā)現(xiàn)這個(gè)BAC克隆經(jīng)限制性內(nèi)切酶"a/dH和^wl消化可以得到一個(gè)含有全長(zhǎng)基因的片段。該片段包括基因起始密碼子ATG上游2，236bp和終9止密碼子TGA下游2，044bp,共9，249bp(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)。將該片段亞克隆到具有相同酶切位點(diǎn)的雙元載體pCAMBIA1300上，得到重組質(zhì)粒pD27C(圖2A);將質(zhì)粒pD27C通過(guò)電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌"^ro力acteW咖^//He/acye/is)株系EHA105中，篩選得到含有重組質(zhì)粒pD27C的重組農(nóng)桿菌菌株。為了便于水稻材料轉(zhuǎn)化，我們通過(guò)回交的方式獲得的日本晴背景的fl^7突變體，把該突變體的成熟種子脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3周后，從盾片處生長(zhǎng)出愈傷組織，挑選生長(zhǎng)旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有重組質(zhì)粒pD27C的重組農(nóng)桿菌菌株侵染水稻愈傷組織，在黑暗處25'C培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷和轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，后移栽到水田中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株為T。代，收獲T。代苗的種子，按照上述田間栽培的方法進(jìn)行栽培，并通過(guò)常規(guī)分子檢測(cè)，獲得L代轉(zhuǎn)基因苗。觀察轉(zhuǎn)基因植株的分蘗情況，獲得的6個(gè)T。代轉(zhuǎn)基因株系及其后代轉(zhuǎn)基因植株的分蘗數(shù)和株高都恢復(fù)到野生型水平。多蘗矮稈突變體轉(zhuǎn)Z^7基因植株分蘗和株高的功能互補(bǔ)證實(shí)"i7基因控制水稻的株高和分蘗生長(zhǎng)(圖2B，l表示野生型日本晴，2表示轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1300的di7突變體，3表示轉(zhuǎn)入重組載體pD27C的L代植株)。三、RNA干擾實(shí)驗(yàn)1、干擾片段的獲得以幼苗的cDNA為模板，分別用弓|物對(duì)Z^WNAi1F/"27RNAi1R和引物對(duì)"i7RNAi2F/Zi7RNAi2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。兩對(duì)引物分別擴(kuò)增得到的產(chǎn)物中基因片段的核苷酸序列如序列表中序列2自5'末端起第164位-820位核苷酸所示，長(zhǎng)657bp。表2、引物序列引物名稱引物序列Z^RNAilF5'-AAGAGCTCCCAAGAAGACGGAGACGGC-3，"NAilR5'-嵐CTAGTCACCATGATTCTGCTTTGCG-3'"，NAi2F5'-MGGATCCCCAAGAAGACGGAGACGGC-3'"，NAi2R5'-MGGTACCCACCATGATTCTGCTTTGCG-3'"^RNAil的前后引物5'端分別加&cl和&el接頭，/ZS7RNAi2的前后引物5'端分別加^/dH和^Ml接頭。該Z^7基因657bp片段經(jīng)全基因組比對(duì)分析確認(rèn)在水稻基因組中無(wú)其它同源序列。2、干擾載體D27-RNAi的構(gòu)建將引物對(duì)"^RNAilF/Z^RNAilR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用5"acl和進(jìn)行酶切，插入帶有Ubiquitin啟動(dòng)子的載體pTCK303的&cI和&el位點(diǎn)，得到載體1;將引物對(duì)"^RNAi2F/Zi7RNAi2R擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用勘/dH和勤"I進(jìn)行酶切，插入得到載體1的^s/dH和I位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體D27-RNAi(即干擾載體D27-RNAi)，插入片段表達(dá)后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。將干擾載體D27-RNAi通過(guò)電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌"^roibacz^ri咖z^z/e/aci'e/s)株系EHA105中，篩選得到含有干擾載體D27-RNAi的重組農(nóng)桿菌菌株°將野生型水稻日本晴的成熟種子脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3周后，從盾片處生長(zhǎng)出愈傷組織，挑選生長(zhǎng)旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有干擾載體D27-RNAi的重組農(nóng)桿菌菌株侵染野生型水稻愈傷組織。在黑暗處25。C培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷和轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，后移栽到水田中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株為T。代，觀察T。代苗的分蘗情況。結(jié)果表明，將日本晴中"i7基因RNAi后，轉(zhuǎn)基因植株明顯出現(xiàn)矮生多分蘗的表型(圖3，A表示野生型日本晴，B表示轉(zhuǎn)入D27-RNAi的T。代轉(zhuǎn)基因植株)。四、系統(tǒng)分析鑒定水稻多分蘗突變體o^7中獨(dú)角金內(nèi)酯(strigolactones)的含量參照文獻(xiàn)(UmeharaM,HanadaA,YoshidaS,eta丄Inhibitionofshootbranchingbynewterpenoidplanthormones.Nature.2008，455，195-200.)所述方法進(jìn)行獨(dú)角金內(nèi)酯的提取及LC/MS/MS測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)用的實(shí)驗(yàn)材料是水稻矮桿多分蘗突變體^7的種子、野生型品種幼ioAari的種子。11主要參照Kamachi等的方法(KamachiK,YamayaT，MaeT,eta7.Aroleforglutaminesynthetaseintheremobilizationofleafnitrogenduringnaturalsenescenceinriceleaves.PlantPhysiol.1991,96，411—417.)方法將水稻種子進(jìn)行水培。選取水培生長(zhǎng)3至4周的水稻材料，用自來(lái)水徹底清洗水稻根系，置于新鮮配制的水培溶液中培養(yǎng)，24小時(shí)后收集水培溶液；用等體積的乙酸乙酯萃取三次(即用1/3體積的乙酸乙酯對(duì)水培溶液進(jìn)行萃取，收集乙酸乙酯相I，用1/3體積的乙酸乙酯對(duì)水培溶液再次進(jìn)行萃取，收集乙酸乙酯相II，用l/3體積的乙酸乙酯對(duì)水培溶液進(jìn)行第三次萃取，收集乙酸乙酯相in)，將三次收集的乙酸乙酯相合并，再用1/5體積的0.2M的K2HP04洗滌，收集乙酸乙酯相，加入無(wú)水Na2S04以除去乙酸乙酯內(nèi)水分，通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙酸乙酯旋干，樣品溶于50%乙腈，LC-MS/MS測(cè)定。LC-MS/MS測(cè)定的條件為Waters高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)(QuattroPremierXE，WatersMStechnologies,Manchester,UK，AcquityUPIXTM，Waters,Milford，MA，USA)。色譜分離條件色譜柱WatersBEH-C18柱，2.1X50mm，粒徑1.7um;柱溫25°C;樣品溫度25°C;流動(dòng)相梯度洗脫條件流動(dòng)相由30%乙腈的水溶液在6和15min分別線性增長(zhǎng)到40%和70%。流速0.4ml/min。質(zhì)譜條件脫溶劑氣流量(DesolvationGasFLow):800L/hr;毛細(xì)管電壓(CapiLLary):3.80kV;錐孔電壓(SampleCone):30V;脫溶劑氣溫度(DesolvationTemperature):350°C;離子源溫度(SourceTemperature):120°C;碰撞電壓(collisionenergy):15V，印i-5DSMRM檢測(cè)離子反應(yīng)通道331.16〉216.10。在如上實(shí)驗(yàn)條件下，印i-5DS標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是9.14min。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。本發(fā)明利用乙酸乙酯通過(guò)液液萃取方式從水稻根系分泌物中分離提取strigolactones,并通過(guò)LC/MS/MS測(cè)定已明確鑒定的2，-印i-5-deoxystrigol(epi-5DS)來(lái)分析strigolactones的含量，結(jié)果表明在水稻矮桿多分蘗突變體^27的根系分泌物中檢測(cè)不到印j'-5DS(圖4，其中1表示印i-5DS標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，2表示野生型品種幼j'oAar厶3表示水稻多分蘗突變體^7)。12上述結(jié)果表明水稻矮桿多分蘗突變體^^中獨(dú)角金內(nèi)酯的含量降低，證明水稻"i7基因參與獨(dú)角金內(nèi)酯的合成。序列表aio〉中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所〈120〉一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用〈130〉CGGNARC92262<160>11〈210〉1〈211>9249〈212〉DNA<213>水稻(6!r7zaL.)〈400>1ggatccttacttatttctctccaactcttatttactttcctctgactttaagttacttac60atgtgggcttgttggat卿ggattagagaactcatatttactttcctctaactttgagt120tactgacatgtgggctcgttggat卿ggattagagggtccatattttagtgactcgcgt謂ca犯gggggagtatttcaatccgttgctgcacgcattgttttcgtttgcagtacaaacga240aMgcagctgccgacggttgcctctgataagatgccactatcagaattgatgatggcaat300agcatatttgtgtaatgctcccagattgtcccaactttttcgcaaactattctattgttt360tttcttttcctattacccgaaagacgcgcatacaacacttgcttgaaaagatggaggtta420atggtaaatctcttatttggctaaatatctaataaaaactcatatt城gcgtaagattg480taggcactaaaatttaaaccagagtggaaccatacattgcttttccaaactttttUttg540的gac3ttgaacttttccaaactgttttgttttcggctaattgtgttgagattttcttct600tUggattggaagacacgtctaagagaattttagagtctagcggcgacggcttacaagaa660agctcctcgaagcatccacat犯tct犯tctgtcggttactgcagatcgg7203cggtc犯aBacggcctaacgagacactgtgcactgcagatgatctgtttccctcttacc780aggtgctatacagaaattactgtttgatgatagcttcgtttgcacctatgtccaaatgat840agtatttcacattatttaaaacaattg犯gtgtttatattgaaatactccatccatcggt900tcacaattgtagtaag3C犯ttgacaagaatgactctattacattggtaa960tgtgaagtcgataccatattg犯gaaaaaaaatgccgatgccatgccatggcatgsg3gc1020utmtttttttttcacagacattttcatagaaaatgtggtggcaaaattcaaataacg1080cgggg柳gtgtgg犯c犯agttt幼tt3gggtt犯cttttC3g鄉(xiāng)gg31140a犯犯tgtaeictcatt犯t3attttgccactataattttactgttcgctcatttcagtcg1200ctaaaaattagtgctagtccaaattaaatcgatagtgcaatttgatttat1260tataataaaatggcattatatccagatggttcagacc犯gttggtactgt1320tcaacttaatgaaactaggaataaactatgttcgagatagttC3g3caga1380cttggagcgaatt皿ctaagaatatacttgagacttgag3gtgaacaaagctttgtctta1440ctagtgagattatagttagttacgcgattatcttggacgacactgattaatacttcattc1500c肌gttgax;acaagattggatcactccatgtsgagaatgttaattaa犯t15603tctaaccaagctgcctggatcttttcgccagctgaccaatt犯aBgaaggaagcatcaa1620agcccattag卿tggacagctccttgtccatatatatactccctctgta1680ctcgtaaaaggaagtcgttttgaacagtgacacggtctccaaaatstaactttgacttct1740tgtttttataaaaatatttatt犯EL肌gtgatststgtatacttttatgaaagtattttt180014caagaaaaatctattcatataattttcacattttcaaactcaacaacttgagagttattt18608tt3ttt3t3ttcctaaggtttgacttaaacattgttctaaacgatttcttttacgagta1920cggagtactgagggggtatattcc犯ttagctatcaacat8ctaattaactatcaacctt1980aataaaaacat犯ttattagac3Ctttg2ittccttattccC8CC3C犯CCaagatgccct2040ctccatgccatttggtctcttctctctccctccttgcaaattgcatgaccctctctctct2100ctctccacttctctctataaaccttcctctctcccataacttctttccattttc犯ccta2160caaatatactaatctctctctagctagtcttcacctacaaatctctctctctctctctct2220ctctctctctctcttcatggagaccaccscgcttgtgctgcttcttcctcatggcggcgc2280cggcggcgtacggccggcggcagcggc犯cggcgaagcgaagctacgtgatgaggaggtg2340ttgctcgacggtgagggcggtcatggcgaggccgc犯gaggcgccggcgtcggcgccggc2400caagaagacggagacggcggcgatgatgtcgacggtgcagacggagacggcggcggcgcc2460gccggcgacggtgt3CCgggacagctggttcgacaagctcgccattggttacctgtccag2520gaaccttcaagaagcttctggttcgtgcctataatctactgaatatatctgatgtattgt2580gtgcatgtacatgcaatctttcggatgaatt犯tgaatgatcaaatcaaccatgcatgca2640tatatgtgtgtatttatgeitgtttttgccatggctgatttgattttttgagtgg8柳犯2700taacatatatatggtgaataaaccaatgttcttcagttatttttgtgaca2760atgtgtattctacgatcatccttttcttcttatcgtttggttattaatacccttctcgtc2820catgtggaacataaattctttgattttttttattacatgttgctttggccagcgtgggtg2880tacttgcaattgcatgctttctgtcatattataattgaattagctcttgatttttacatg2940c犯aagaMaatttatttattgagttgctgatgatcacgtaagcctatgcatgtg卿tg3000tgatgtgttctccggcctaattaagtatcgacgtactatatatatgcacgtacatcaBgt3060acggccgtatttcataatttgattattgttactgtaccagaca犯cctagtgcttaatta3120ttgacatatacccaacatcgatta^agtcagtgtgacacaattggcagaag犯gata3ca3180aa犯tcatagaagacatatacagtgcaaaaagggatacca3240gaagcttcttatggtcacatttagtagtagtaatacacagtaataacaca3300ttatttgacgaataaattaagcggaagtgcgcatataagc3360ccgttgatccgtgaaaatgtgaggttcacat"tctaggaatcttttagtgc3420ttg肌tctaatcctttcgtttgttttcccgtggactttttactttgatcg3480tctgaat犯tgcgaaggtcaaacatcacatgtacgtgcccggttcttcttctagaaattc3540agccgcttactataatcgatgctggtmtgaatttttttaaagacatttattttggaac3600aac11aa&aa犯gtgcaceiaaccagggtttaccaaaccgtttgaagtgaggttactgcca3660ctccatggtttggcaattEitcacgaggtgcgtcgtggUctaaggttatc3720gtatgtgataaccgcgataactgacggttttgtELEiaCCC"tgcacagacaacataattata3780tttacaggactgtttggacttcattaacactgtagcatccactacstccgtcacctcctt3840ggctctcttacatgtttagcaaagtcaatcatacagacaaaccag犯aeigttcccaacag3900acacagaatgctacttttctagtatggg"Uattaagcatat^g3ga犯cttgaaagcat3960acaggaaaccgatgttcactagtcctgagtttUttttggtgttgttcaggtgcaaatta4020actgc犯aggttgattccctga肌ggaacttgtagcacttgctgactgacacgaacatgc4080atgcaatgtaatgcagggctaaagaatgaa犯ggatggctacgagagcctgatagatgcc4140gccctagccatctcaagaatcttcagtctggat犯acaaagcg柳ttgtgacccaagct4200cttga幼gagcacttccaagctacatcctcacaaXggt犯gtaccataatccatgacaat4260tggcaatcatgtatg犯ttattga犯tttaaaaaacctaaaactttttttt3tttg幼ca4320ggaagtaaaattcagcatttattctctcttttttUttgagaacttctgt4380aa3gggaggaaactttaaaagttctcttct"tttatttcttacctcaactttgattgagaa4440ttctgtcggcagatcaaggtgatgatgccaccttcaagattttccagggagtactttgct4500gcattcaccacgatattttttccttggttggttgggccgtgtgaggtata4560acagttcctccttttgttacttca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fā)育。因此，可以利用基因工程技術(shù)調(diào)控水稻的分蘗性狀，調(diào)節(jié)植株養(yǎng)分利用效率及有效控制破壞性寄生雜草；D27基因在研究農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)中有益真菌共生體和破壞性寄生雜草的控制方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/11GK101585869SQ20091008393公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者孟祥兵,李家洋,浩林,王仁曉,王永紅,前錢申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所