專利名稱：降解木質纖維素的方法及其專用纖維素分解菌系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及降解木質纖維素的方法及其專用纖維素分解菌系。
背景技術：
木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素三種成分組成，它們相互結 合形成復雜的超分子復合物。木質纖維素是我國最豐富的生物質資源，包括大 量的農作物秸稈、工業(yè)與林業(yè)廢棄物以及城市固體廢棄物等。目前木質纖維素 資源大部分未能被充分利用。尤其是農作物秸稈，它具有產量大、分布廣和品 種多的特點，應用潛力巨大。木質纖維素被分解為小分子有機物后，可用作肥 料以改善和保持土壤肥力，可用作畜禽詞料以促進畜牧業(yè)發(fā)展，可用作沼氣發(fā) 酵以及乙醇生產的原料而獲得清潔能源。因此，分離培養(yǎng)具有纖維素分解能力 的微生物，將廉價的可再生植物纖維素資源轉化為對環(huán)境友好的產品，變廢為 寶，是解決我國能源與環(huán)境問題、實現(xiàn)我國農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。
研究人員在分離篩選具有分解纖維素能力的細菌時發(fā)現(xiàn)，實驗中分離到的 具有纖維素分解能力的細菌都是兩種或兩種以上的細菌組成的復合菌系，單獨 的細菌很難或只能微弱分解纖維素。也就是說，細菌對纖維素的高效分解是由 兩種或多種細菌混合發(fā)酵完成的。為了更好地研究細菌分解纖維素的機理，分 析復合菌系中細菌的種群組成是必要且重要的。
過去對微生物多樣性以及微生物種群組成的研究大多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方 法，但是有些種類的微生物難以實現(xiàn)純培養(yǎng)，因而難以利用傳統(tǒng)的微生物分離培 養(yǎng)技術獲得樣品中完整的微生物種群信息。分子生物學技術的發(fā)展為不依賴于傳 統(tǒng)培養(yǎng)的微生物種群組成的研究提供了強有力的支持。應用于微生物種群結構研
究的分子生物學技術主要包括變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ， DGGE)技術、單鏈構象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP)技術、熒光原位雜交(Fluorescent In Situ Hybridization, FISH)技術以及16S rDNA克隆文庫技術等。其中，16S rDNA 克隆文庫技術已廣泛應用于環(huán)境微生物多樣性的研究中，它既可以分析樣品微 生物的種類，又可以相對定量地反映樣品中各種微生物的相對比例，最重要的是通過這種技術可檢測到不能在實驗室條件下獲得純培養(yǎng)的微生物。16S rDNA 克隆文庫的構建與分析包括以下幾步首先提取樣品總DNA，通過PCR技術擴增 16SrRNA基因；將擴增后的16S rDNA片段與載體相連，然后將之轉入大腸桿菌； 通過挑選陽性克隆建立克隆文庫；將陽性克隆的插入片段測序，利用Blast軟 件將經測序得到的16S rDNA序列與NCBI中已知的16S rDNA序列進行比較，并利 用其它軟件進行分析，就可知道文庫中的菌種種群組成及相對數(shù)量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供降解木質纖維素的方法及其專用纖維素分解菌系。 本發(fā)明所提供的纖維素分解菌系"/ ox7力a"7^s取)，名稱為L-C，已于2008
年10月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為武漢大學)，
保藏號為CCTCC NO: M208165。
該纖維素分解菌系L-C對木質纖維素具有高效的分解能力。 本發(fā)明還提供了一種用于培養(yǎng)纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培養(yǎng)
基，該培養(yǎng)基可按如下方法配制酵母提取物，1-3g;胰蛋白胨，l-3g; NaCl， 10-25g;
KC1， 0. 3—1.5g; MgS04' 7H20， 3—9g; MgCl2 *6H20, 2-6g; CaCl2 H20， 0. 5—2. 5g;
NaHC03， 0.2-lg;用水定容至1升。
所述培養(yǎng)基的pH可為6.8-8.0，具體可為7.2。
本發(fā)明還保護纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165在降解木質纖維素中的 應用。
木質纖維素是我國最豐富的生物質資源，包括大量的農作物秸稈、工業(yè)與 林業(yè)廢棄物以及城市固體廢棄物等。本發(fā)明的纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165可應用于木質纖維素的降解，如農作物秸稈、稻草、甘蔗、木薯等，為了 促進降解充分，可將木質纖維素先進行破碎處理，使其成為絲或渣。
所述應用中，降解木質纖維素的溫度可為30-55°C，優(yōu)選為40-50°C。 本發(fā)明還保護一種降解木質纖維素的方法，是在含有木質纖維素的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)所述纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165。
所述含有木質纖維素的培養(yǎng)基是在所述用于培養(yǎng)纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培養(yǎng)基中加入木質纖維素得到的。
所述木質纖維素可為農作物秸稈、稻草、甘蔗、木薯等。 所述降解木質纖維素的方法中，培養(yǎng)所述纖維素分解菌系L-C的培養(yǎng)溫度為
430-55°C，優(yōu)選為40-50°C。
培養(yǎng)所述纖維素分解菌系L-C或應用所述纖維素分解菌系L-C時，可采用 150-200rpm的轉速。
本發(fā)明有助于解決木質纖維素資源不能被充分利用的現(xiàn)狀。采用本發(fā)明的 纖維素分解菌系L-C將木質纖維素進行初步降解后，可將其用作肥料以改善和保 持土壤肥力，可用作畜禽詞料以促進畜牧業(yè)發(fā)展，可用作沼氣發(fā)酵以及乙醇生 產的原料而獲得清潔能源。本發(fā)明將廉價的可再生植物纖維素資源轉化為對環(huán) 境友好的產品，變廢為寶，具有重大的經濟價值和社會意義。


圖1為纖維素分解菌系L-C中細菌種群組成的分析流程圖。 圖2為纖維素分解菌系L-C對稻草的分解。 圖3為纖維素分解菌系L-C對甘蔗渣的分解。 圖4為纖維素分解菌系L-C對木薯渣的分解。
具體實施例方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實 驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊 說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
實施例l、纖維素分解菌系L-C的獲得
每升培養(yǎng)基含有如下組分酵母提取物，2g;胰蛋白胨，2g; NaCl， 18g; KC1， lg; MgS04' 7H20， 6g; MgCL 6 H20， 4g; CaCl2 H20， 1. 5g; NaHCO" 0. 7g; pH7.2。
按比例稱取剩余相應藥品倒入事先裝有部分自來水的燒杯中，藥品充分溶解后 用自來水定容至990ml，調pH至7.2，最后定容到1000ml。
將每10ml培養(yǎng)基分裝到18X 180mm的普通試管(預先放置12X IOO咖的濾紙 條)中。
一、纖維素分解菌系L-C的獲得
將O. 2-0. 6采自廣西木薯酒精廢液UASB-TLP處理系統(tǒng)的厭氧活性污泥樣品接 種到裝有培養(yǎng)基的試管中。將試管在40-5(TC的溫度條件下以150-200rpm的轉速振 蕩培養(yǎng)進行富集篩選。72小時后，將試管中的培養(yǎng)液以5% (體積百分比)的接種量 接種到新的裝有培養(yǎng)基的試管中。接種后在40-5(TC溫度下進行振蕩培養(yǎng)直至濾紙完全崩解。按相同方法重復轉接多次，得到可以在18-24小時內完全崩解濾紙的性 能穩(wěn)定的纖維素分解菌系。
二、纖維素分解菌系L-C中細菌種群組成的分析
分析流程圖見圖1。
1、 總DNA的提取
將步驟一得到的纖維素分解菌系接種至培養(yǎng)基中，接種量為5%(體積百分比)， 40-50。C培養(yǎng)20小時。
將lml培養(yǎng)液放入1. 5ml E卯endorf管中，12000rpm， 4。C離心5分鐘收集菌 體，用1XTES洗滌菌體2-3次。將菌體重新懸浮于435W TES中打散菌體，加入 溶菌酶(20mg/ml) 12514，蛋白酶K (10mg/ml) 2. 5W， 37。C水浴輕振保溫4小時， 加入50W20XSDS，于37。C水浴輕振保溫30分鐘，加入5M NaC104 1 25W，用等體 積(560W)酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)抽提3-4次至界面無蛋白膜出現(xiàn)。吸取上 層水相置于冰浴中加入1/10體積的3M NaAc-EDTA-Na2，加入2倍體積冷無水乙醇， 翻轉混勻，冰浴5分鐘。12000rpm離心20分鐘沉淀DNA。加入70%乙醇脫鹽，4°C 過夜放置，7000rpm離心IO分鐘，吸出乙醇。風干，加二次蒸餾水溶解。電泳檢測 后調DNA濃度為25Pg/ml。
2、 PCR擴增16S rDNA部分序列
通用引物530F (5' -GTG CCA GCA/G GCC GCG G-3') 1490R (5' -GTG CCA GCA/G GCC GCG G-3')
PCR反應體系(50W):
5X緩沖液10. OW
Mg2+ (25mM)3. OW
d證(lOraM)l潛l
530F (50I4O0.
1490R (50MM)0.
模板DNAl.OW
GoTaq DNA聚合酶0.
ddH2033.
PCR反應條件
預變性95°C 5 min;循環(huán) 95°C 1 min， 55°C 2 min， 72°C 1 min; 30個循環(huán)； 延伸 72°C 5 min。
經電泳檢測，證明得到大約lOOObp的PCR產物。
3、 PCR產物純化
采用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-叩System (產品目錄號 A9281)純化。具體操作為經凝膠電泳后將所需條帶切下放入1.5ml離心管。稱 量膠條的重量，并以lW/mg的量加入膜結合溶液，在50-65'C保溫溶解。將溶解后 的混合物倒入柱子室溫放置1分鐘后以16000轉速離心1分鐘。加入700W洗膜溶 液以同樣轉速離心1分鐘后再加入500W洗膜溶液離心5分鐘。將柱子輕輕轉移到 干凈的離心管中加入50W無核酸酶水，離心1分鐘后置4°。保存。
4、 PCR產物與載體連接
連接載體選用Promega公司的pGEM T-easy載體(產品目錄號A1360)，連 接體系如下表
名稱反應陽性對照陰性對照
2X緩沖液2.5142.2. 514
pGEM-T Easy載體(50ngM)0.0. 5140.
PCR產物1.——
Control DNA "ng/W)—l"l一
T4 DNA連接酶(3U/W)0. 5140.0.
補去離子水至5W5W
混勻后4'C過夜放置。
Control DNA為Promega公司的pGEM T-easy載體中提供的。 5、轉化
將步驟4的連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 a (北京博大泰恒生物技術 有限責任公司)。分別取5(mi， 100W， 200)4涂平板，于37。C溫箱培養(yǎng)12-16小時。 依據(jù)藍白斑篩選的原理挑取白色菌落點種在平板上，每個平板點種50個菌落，每 個菌落的位置標記數(shù)碼(1-50)， 37'C培養(yǎng)12小時。
6、陽性克隆的篩選
采用菌落PCR技術。用牙簽挑取少許不同菌落的菌體分別加入事先裝有50W 無菌水的PCR管中，做好標記(與平板上的標記號碼相同)。將PCR管于95。C加熱
75分鐘，冷至室溫后，15000rpm離心5分鐘。取IOS王清為模板進獰PCR，引物為 SP6 (5' -CAT ACGATTTAGGTGACACTATAG-3')和T7 (5' -TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG-3')。菌落PCR體系組成以及反應條件與上述16S rDNA擴增條件相同。取 10W PCR產物經凝膠檢測確定陽性克隆。
7、 用限制性內切酶I對30個陽性克隆的菌落PCR擴增產物進行酶切分析 酶切體系(20W)如下
Nuclease-Free Water 7. 5Ml
菌落PCR產物 10W 10 XBuffer Tango with BSA I (10U/W) 0. 混合后置37r水浴保溫2-5小時。
酶切完成后在60-7(TC放置30分鐘終止酶切。取酶切產物進行電泳檢測 證明有4種不同的酶切帶型，即有4個0TU (Operational Taxonomic Unit)。
8、 陽性克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育分析
挑取代表4個不同帶型的陽性克隆菌落接種于LB平板上，37t過夜培養(yǎng)后送 測序公司進行測序。將所得序列輸入NCBI網站用Blast程序與Genbank中已有的 序列進行比較。
結果表明纖維素分解菌系的細菌種群由四種細菌(細菌A、細菌B、細菌C 和細菌D)組成。細菌A屬于厭氧芽孢桿菌屬""o^力3cj77ws)，與^2o;ry力acj77^ /7aw'Wei7z^同源性極高，相似性達到98-99%，占細菌總數(shù)的60%。細菌B、細菌 C和細菌D屬于芽孢桿菌屬(Saci77us)。細菌B與萬acj'Uws AsycArocfera"s的同 源性達99%，細菌C與5aciJ7〃s i^fl^/s的同源性達96%，細菌D與"ac/7勿s 7ic/ e"i/br肌's的同源性達95%。細菌C占細菌總數(shù)的20%，細菌D占細菌總數(shù)的 15%，細菌B占細菌總數(shù)的5呢。
將步驟一得到的纖維素分解菌系命名為L-C，于2008年10月17日將其保存于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址武漢大學內)，保藏登記號為CCTCCN0: M208165。
實施例2、纖維素分解菌系L-C的培養(yǎng)溫度優(yōu)化
每升培養(yǎng)基含有如下組分酵母提取物，2g;胰蛋白胨，2g; NaCl， 18g; KC1， lg; MgS04' 7H20， 6g; MgCl2 '61120， 4g; CaCl2 H20， 1. 5g; NaHCO" 0. 7g; pH7. 2。培養(yǎng)基的配制方法為按比例稱取剩余相應藥品倒入事先裝有部分自染水的燒 杯中，藥品充分溶解后用自來水定容至990ml，調pH至7.2，最后定容到lOOOml。
將每10ml培養(yǎng)基分裝到18X 180誦的普通試管(預先放置12X 100mm的濾紙 條)中。
將實施例1的步驟一得到的纖維素分解菌系L-C接種至含有培養(yǎng)基的試管中， 接種量為5% (體積百分比)，接種40個試管。40個樣本分成四組，每組10個樣 本。將四組樣本分別在30-40°C、40-50°C、50-55°C、60-7(TC的溫度條件下以180rpm 的轉速振蕩培養(yǎng)。
在40-5(TC條件下培養(yǎng)的試管中的濾紙條上首先長出黃色菌落并逐漸消解，除 60-7(TC外，其它溫度條件下，濾紙條上也先后長出黃色菌落并逐漸消解。表明纖 維素分解菌系L-C在30-55'C均可生長，最適宜的生長溫度為40-5(TC。
實施例3、纖維素分解菌系L-C降解木質纖維素
每升培養(yǎng)基含有如下組分酵母提取物，lg;胰蛋白胨，lg; NaCl， 10g; KC1， 0. 3g; MgS047H20， 3g; MgCl2 6 H20， 2g; CaCl2 H20， 0. 5g; NaHCO" 0. 2g。
培養(yǎng)基的配制方法為按比例稱取剩余相應藥品倒入事先裝有部分自來水的燒
杯中，藥品充分溶解后用自來水定容至990ml ，調pH至6.8，最后定容到lOOOml。 將每10ml培養(yǎng)基分裝到18X 180mm的普通試管中。
取60個裝有培養(yǎng)基的試管，分成六組，每組10支。在第一組和第二組試管中 加入烘干稻草(每個試管中加入0.1g烘干稻草)，在第三組和第四組試管中加入 烘干甘蔗渣(每個試管中加入0.3g烘干甘蔗渣)，在第五組和第六組試管中放置 0. 3g的木薯渣。
將實施例1的步驟一得到的纖維素分解菌系L-C接種至第一組、第三組和第五組 的每個試管中，接種量為5% (體積百分含量)；第二組、第四組和第六組試管中分 別加入5% (體積百分含量)的無菌水，作為對照；40°C、 150rpm振蕩培養(yǎng)。結果表 明第一組的試管中的稻草在三周內大部分分解，第二組的試管中的稻草沒有崩解; 第三組試管中的甘蔗渣在三周后大部分分解，第四組試管中的甘蔗渣沒有變化；第 五組試管中的木薯渣在三周后大部分分解，第六組試管中的木薯渣沒有變化。
圖2為纖維素分解菌系L-C對稻草的分解；A:沒有接種纖維素分解菌系L-C培養(yǎng) 三周的稻草(第二組)；B:接種纖維素分解菌系L-C后培養(yǎng)17天的稻草(第一組)。圖3為纖維素分解菌系L-C對甘蔗渣的分解；A:沒有接種纖維素分解菌系L-C培 養(yǎng)三周的甘蔗渣(第四組)；B:接種纖維素分解菌系L-C培養(yǎng)24天的甘蔗渣(第三 組)。
圖4為纖維素分解菌系L-C對木薯渣的分解；A:沒有接種纖維素分解菌系L-C培 養(yǎng)三周的木薯渣(第六組)；B:接種纖維素分解菌系L-C培養(yǎng)24天的木薯渣(第五 組)。
結果表明纖維素分解菌系L-C對木薯渣、稻草和甘蔗渣分解明顯。 將加入的稻草重量減去分解后經過濾得到的渣滓的干重，即為稻草重量的減少 量(木薯渣、甘蔗渣同)。
接種纖維素分解菌系L-C，培養(yǎng)17天后，稻草的重量減少82%。接種纖維素分 解菌系L-C，培養(yǎng)24天后，甘蔗渣的重量減少64%。接種纖維素分解菌系L-C，培 養(yǎng)24天后，木薯渣的重量減少71%。以上數(shù)據(jù)均為每組十個試管的平均值。
實施例4、纖維素分解菌系L-C降解木質纖維素
每升培養(yǎng)基含有如下組分酵母提取物，3g;胰蛋白胨，3g; NaCl， 25g; KC1， 1. 5g; MgS047H20， 9g; MgCl2 6 H20， 6g; CaCl2 H20， 2. 5g; NaHC0" lg。
培養(yǎng)基的配制方法為按比例稱取剩余相應藥品倒入事先裝有部分自來水的燒 杯中，藥品充分溶解后用自來水定容至990ml，調pH至8.0，最后定容到lOOOml。
將每10ml培養(yǎng)基分裝到18X180mm的普通試管中。
取60個裝有培養(yǎng)基的試管，分成六組，每組10支。在第一組和第二組試管中 加入烘干稻草(每個試管中加入0.1g烘干稻草)，在第三組和第四組試管中加入 烘干甘蔗渣(每個試管中加入0.3g烘干甘蔗渣)，在第五組和第六組試管中放置 0. 3g的木薯渣。
將實施例1的步驟一得到的纖維素分解菌系L-C接種至第一組、第三組和第五組 的每個試管中，接種量為5% (體積百分含量)；第二組、第四組和第六組試管中分 別加入5% (體積百分含量)的無菌水，作為對照；40°C、 150rpm振蕩培養(yǎng)。結果表 明第一組的試管中的稻草在三周內大部分分解，第二組的試管中的稻草沒有崩解; 第三組試管中的甘蔗渣在三周后大部分分解，第四組試管中的甘蔗渣沒有變化；第 五組試管中的木薯渣在三周后大部分分解，第六組試管中的木薯渣沒有變化。
結果表明纖維素分解菌系L-C對木薯渣、稻草和甘蔗渣分解明顯。
10將加入的稻草重量減去分解后經過濾得到的渣滓的干重，即為稻草重l:的減少 量(木薯渣、甘蔗渣同)。
接種纖維素分解菌系L-C，培養(yǎng)17天后，稻草的重量減少76%。接種纖維素分 解菌系L-C，培養(yǎng)24天后，甘蔗渣的重量減少61%。接種纖維素分解菌系L-C，培 養(yǎng)24天后，木薯渣的重量減少73%。以上數(shù)據(jù)均為每組十個試管的平均值。
權利要求
1、纖維素分解菌系L-C CCTCC NOM208165。
2、 一種用于培養(yǎng)纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基 的配制方法如下酵母提取物，卜3g;胰蛋白胨，1-3g; NaCl， 10-25g; KCl， 0.3-1.5g; MgS04 7H20， 3—9g; MgCl2 6 H20， 2-6g; CaCl2 H20， 0. 5—2. 5g; NaHC03， 0. 2-lg; 用水定容至1升。
3、 如權利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的pH為6. 8-8. 0，優(yōu) 選為7.2。
4、 纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165在降解木質纖維素中的應用。
5、 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述木質纖維素為稻草、甘蔗或木薯。
6、 如權利要求4或5所述的應用，其特征在于所述應用中，降解木質纖維素 的溫度為30-55。C。
7、 如權利要求6所述的應用，其特征在于所述應用中，降解木質纖維素的溫 度為40-5(TC。
8、 一種降解木質纖維素的方法，是在含有木質纖維素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求1 所述纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165。
9、 如權利要求8所述的方法，其特征在于所述含有木質纖維素的培養(yǎng)基是在 權利要求2或3所述的用于培養(yǎng)纖維素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培養(yǎng)基中 加入木質纖維素得到的。
10、 如權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述木質纖維素為稻草、甘蔗 或木薯；所述方法中，培養(yǎng)所述纖維素分解菌系L-C的培養(yǎng)溫度為30-55'C，優(yōu)選為 40—50°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了降解木質纖維素的方法及其專用纖維素分解菌系。本發(fā)明提供了纖維素分解菌系L-C CCTCC NOM208165。本發(fā)明還提供了一種用于培養(yǎng)纖維素分解菌系L-C CCTCC NOM208165的培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了纖維素分解菌系L-C CCTCC NOM208165在降解木質纖維素中的應用。本發(fā)明有助于解決木質纖維素資源不能被充分利用的現(xiàn)狀。采用本發(fā)明的纖維素分解菌系將木質纖維素進行初步降解后，可將其用作肥料以改善和保持土壤肥力，可用作畜禽飼料以促進畜牧業(yè)發(fā)展，可用作沼氣發(fā)酵以及乙醇生產的原料而獲得清潔能源。本發(fā)明將廉價的可再生植物纖維素資源轉化為對環(huán)境友好的產品，變廢為寶，具有重大的經濟價值和社會意義。
文檔編號C12R1/07GK101597580SQ20091008578
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權日2009年6月1日
發(fā)明者劉文彥, 朱萬斌, 楊蘇聲, 梁近光, 序 程 申請人:中國農業(yè)大學