專利名稱：一種高α-半乳糖苷類寡糖降解能力的中性α-半乳糖苷酶Aga-S27及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高α-半乳糖苷寡糖降解能 力的中性α -半乳糖苷酶Aga_S27及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α -半乳糖苷酶(α -galactosidase, EC3. 2. 1. 22)即蜜二糖酶，屬于外切糖苷酶 類，能夠?qū)Ｒ恍源呋擎湻沁€原末端α-半乳糖苷鍵的水解，它不僅能夠水解含α-半乳糖 苷鍵的寡糖，而且還能夠催化含該鍵的多糖。棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖是豆類植物中廣泛 存在的低聚寡糖，在α -半乳糖苷酶的作用下，這些寡糖可以被分解為D-半乳糖和其他相 應(yīng)的單糖和寡糖。豆粕是非常優(yōu)秀的植物性蛋白質(zhì)飼料原料，一般在日糧中的用量為25 30%。但 在豆粕中含有5 6%的單胃動物不能消化的α -半乳糖苷類的低聚寡糖，如棉子糖、水蘇 糖等，這些寡糖一方面會引起動物的腸胃脹氣疾病，另一方面會增加食糜的粘度，從而降低 了動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。而在豆科飼料中添加α-半乳糖苷酶能夠增加飼料中低 聚寡糖的消化，減少此類低聚寡糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，減輕或消除單胃動物的消化紊亂，從而提 高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率和代謝能(Ghazi S，et al. British Poultry Science. 44(3) 410-418)。在大豆及其制品的食品中中，含有1 %的棉子糖、4%的水蘇糖和微量的毛蕊花糖。 這些寡糖阻礙人類對豆類的消化吸收，能夠產(chǎn)生脹氣等疾病，而人胃腸道不分泌α -半乳 糖苷酶，因此在豆制品中加入α -半乳糖苷酶，可以分解這些寡糖，增加人類對豆類營養(yǎng)的 Hl^ (Prashanth S J and Mulimani V H, Process Biochemistry. 40 :1199—1205)。在制糖工業(yè)中，由于甜菜中棉子糖的存在，造成糖蜜粘度增加而阻礙蔗糖結(jié)晶析 出，以致產(chǎn)生大量的廢糖蜜，使糖產(chǎn)量降低。應(yīng)用α-半乳糖苷酶處理廢糖蜜能將阻礙蔗糖 結(jié)晶的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同時，還產(chǎn)生一分子的蔗糖，因而提高蔗糖的得 率(Ganter C, et al. Journal of Biotechnology. 8 (4) :301_310)。同時酶法制糖可使蔗 糖的粒狀結(jié)晶的均勻性、色澤和純度得到改善。另外，在醫(yī)療中α -半乳糖苷酶還可以用于法布里氏(Fabry's)病的治療(Tsuboi K, The Journal of International Medical Research. 35 (4) 574-581) RB^ O^lMW 改造(ZhuA and Goldstein J, Gene. 140(2) :227_231)等。α-半乳糖苷酶廣泛存在于微生物、植物、動物和人體內(nèi)。在微生物中，細(xì)菌、放線 菌、絲狀真菌、酵母等都能合成α-半乳糖苷酶。目前，已分離篩選出許多產(chǎn)α-半乳糖苷 酶的微生物，如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、青霉、紅曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲 霉、葡酒色被包霉、毛霉、根霉、黃曲霉、啤酒酵母等。不同來源的微生物α-半乳糖苷酶這 根據(jù)其性質(zhì)特性的不同被應(yīng)用于不同的領(lǐng)域。而在食品及飼料工業(yè)中則要求添加的α-半 乳糖苷酶對各種α-半乳糖苷類寡糖都要具有較高的水解能力，而以前報道的α-半乳糖苷酶其底物特異性不能水解多種底物，在應(yīng)用上各具有其局限性。本發(fā)明公開了一個新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶具有適宜 的作用PH值，較強的蛋白酶抗性和較好的水解各種底物的能力，可作為一種飼料或食品添 加劑應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種鏈霉菌。本發(fā)明的目的之一是提供一種高α-半乳糖苷寡糖降解能力的中性α-半乳糖苷 酶Aga-S27。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述α-半乳糖苷酶Aga-S27的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述α-半乳糖苷酶Aga_S27的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述α-半乳糖苷酶Aga_S27的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種鏈霉菌鏈霉菌Sti^ptomyces sp. S27，其保藏號為CGMCC No.3146。本發(fā)明提供了一種來源于上述菌株的α-半乳糖苷酶Aga_S27，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示VPVWPGRRHTVASRSAPLPLDVTHLRAAGVSLVLDLTGGTLPRVLHWGADLGTLGPEELG 60SLRLAGAPQPIGFSVDGPVEVSVLPEQSAGWLGTPGLVGNRGGRDFSTAFAVREAALTGP 120VEGSRSPGGGGGAIVTVLARDEAAALDLELVIELTASGLVRQRATVANRGSSPFTVDAVN 180
LTLPVPAEAVELLDFTGHHLRERSPQRTAFTQGLRMRENRTGRTGYDSAYLLAAGTAGFG 240NRSGEVWAVHTAWSGNHRTFAERTFHSVSLLGSGELLLSGEVVLEPGESYASPWQYGSYG 300RHGLDEVSARFHRWLRSRPHHPSTPRPVTLNTWEAVYFDHDLDRLRALADAAAAVGAERF 360VLDDGWFGSRRDDRRAL⑶WYVSDEVWPDGLGPLTGHVTGLGMQFGLWVEPEMVNEDSDL 420ARAHPDWVMAAGDRLPGAARHQQVLDLARPEAFAYILGRLDELLEAYPIAYLKWDHNRDL 480VDAGHRPTGRAGVHGQTRAVYRLMDELRRRHPGVEIESCSSGGGRVDLEILQRTDRVWVS 540DCIDALERQTIQRWTNALIPLELMGTHVGSDVAHTTGRRHPVDFRAGTALFGHFGIEWDL 600TAAAPEELARLAQWVDLYKELRGLLHTGVRVHADHPDPAHRLHGVVAEDGSDAVYALVAT 660ASSAMYPAGAIRLPGLDADAVYRVRPQAP⑶LPDGNAHHWGVRLPWWTPEGVRLPGRVLA 720AAGLQAPVLHPERLVLLRATRV 742根據(jù)本發(fā)明的α-半乳糖苷酶Aga_S27其分子量為80kDa，比活為11. 26U/mg，最 適PH為7.4，最適作用溫度為351，具有較好的α-糜蛋白酶、枯草芽孢桿菌蛋白酶A、膠原 蛋白酶抗性。本發(fā)明提供了編碼上述α-半乳糖苷酶Aga_S27的基因，其全基因序列如SEQ IDN0. 2 所示。GTGCCGGTTTGGCCAGGACGGAGACACACCGTGGCATCACGTTCCGCTCCCCTTCCCCTC 60GATGTGACGCACCTGCGGGCGGCCGGCGTCAGCCTCGTACTGGACCTGACCGGCGGCACC 120
CTCCCCCGGGTCCTGCACTGGGGTGCCGACCTCGGCACGCTCGGCCCCGAGGAGCTGGGC180TCCCTGCGGCTGGCCGGGGCGCCGCAGCCCATCGGCTTCTCCGTGGACGGCCCGGTCGAG240GTCTCGGTGCTGCCCGAGCAGTCGGCCGGCTGGCTGGGCACCCCCGGCCTGGTGGGCAAC300CGCGGCGGCCGGGACTTCTCCACCGCCTTCGCCGTCCGCGAGGCCGCCCTCACCGGGCCC360GTGGAGGGGTCCCGCTCCCCCGGCGGCGGAGGCGGCGCCATCGTCACCGTCCTCGCCCGC420GACGAGGCCGCGGCCCTGGATCTGGAGCTGGTGATCGAGCTGACCGCGTCCGGACTGGTG480
CGCCAGCGCGCCACGGTCGCCAACCGCGGCTCCTCCCCCTTCACCGTCGACGCCGTGAAC540CTCACGCTGCCGGTGCCCGCCGAAGCCGTCGAGCTGCTGGACTTCACCGGGCACCACCTG600CGCGAACGCAGCCCGCAGCGCACCGCCTTCACCCAGGGGCTGCGGATGCGGGAGAACCGC660ACCGGCCGCACCGGCTACGACAGCGCCTACCTGCTGGCCGCGGGCACCGCGGGCTTCGGC720AACCGCTCGGGCGAGGTGTGGGCCGTGCACACCGCGTGGTCCGGCAACCACCGCACCTTC780GCCGAGCGCACCTTCCACTCGGTGTCGCTGCTGGGCTCGGGCGAGCTGCTGCTCTCCGGC840GAGGTGGTGCTGGAGCCCGGGGAGTCCTACGCCTCCCCCTGGCAGTACGGCTCCTACGGG900CGGCACGGCCTGGACGAGGTCTCCGCCCGCTTCCACCGCTGGCTGCGCTCCCGCCCGCAC960CACCCCTCCACGCCCCGGCCGGTCACCCTCAACACCTGGGAGGCGGTCTACTTCGACCAC1020GATCTGGACCGGCTGCGCGCCCTGGCCGACGCGGCCGCCGCGGTGGGCGCGGAGCGCTTC1080
GTCCTGGACGACGGCTGGTTCGGCTCGCGCCGCGACGACCGGCGCGCCCTGGGCGACTGG1140TACGTCTCGGACGAGGTGTGGCCGGACGGACTGGGCCCGCTGACCGGTCATGTCACCGGC1200CTGGGCATGCAGTTCGGCCTCTGGGTCGAGCCGGAGATGGTCAACGAGGACTCCGACCTG1260GCCCGCGCCCACCCCGACTGGGTCATGGCCGCCGGGGACCGGCTGCCCGGCGCGGCCCGC1320CACCAGCAGGTCCTCGACCTGGCCCGCCCGGAGGCGTTCGCGTACATCCTCGGGCGCCTG1380GACGAGCTGCTGGAGGCGTACCCCATCGCGTATCTGAAGTGGGACCACAACCGGGACCTG1440GTGGACGCCGGGCACCGGCCCACCGGCCGCGCCGGCGTGCACGGCCAGACCCGGGCGGTC1500TACCGGCTGATGGACGAGCTGCGCCGCCGCCACCCCGGGGTGGAGATCGAGTCCTGCTCC1560TCCGGCGGCGGACGGGTGGACCTGGAGATCCTCCAGCGCACCGACCGGGTGTGGGTCTCG1620GACTGCATCGACGCCCTGGAGCGCCAGACCATCCAGCGCTGGACGAACGCCCTGATCCCC1680
CTCGAACTCATGGGCACCCACGTGGGGTCGGACGTCGCGCACACCACCGGGCGCCGCCAC1740CCGGTCGACTTCCGGGCGGGCACGGCGCTGTTCGGGCACTTCGGCATCGAGTGGGACCTG1800ACCGCCGCCGCGCCGGAGGAGCTGGCGCGGCTGGCGCAGTGGGTGGACCTCTACAAGGAG1860CTGCGCGGCCTGCTCCACACCGGCGTCCGTGTCCACGCCGACCACCCGGACCCGGCCCAC1920CGGCTGCACGGGGTGGTCGCCGAGGACGGCTCGGACGCGGTGTACGCCCTCGTCGCCACC1980GCCTCCTCCGCGATGTACCCGGCCGGTGCGATCCGGCTGCCGGGGCTGGACGCGGACGCC2040GTCTACCGGGTGCGGCCGCAGGCCCCCGGCGACCTGCCGGACGGCAACGCCCACCACTGG2100GGCGTCCGCCTGCCCTGGTGGACGCCGGAGGGTGTGCGGCTGCCGGGCCGGGTGCTGGCG2160GCCGCGGGGCTCCAGGCCCCGGTGCTCCACCCCGAGCGGCTGGTGCTGCTGCGCGCGACC2220CGGGTGTGA 2229
本發(fā)明還提供了包含上述α -半乳糖苷酶基因aga-S27的重組載體。本發(fā)明還提供了包含上述α -半乳糖苷酶基因aga-S27的重組菌株，優(yōu)選所述菌 株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。
本發(fā)明還提供了一種制備具有高α -半乳糖苷寡糖降解能力的中性α -半乳糖苷 酶Aga_S27的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α -半乳糖苷酶表達；以及3)回收并純化所表達的α -半乳糖苷酶Aga_S27。
本發(fā)明還提供了 α -半乳糖苷酶Aga_S27的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一個新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶具有適宜 的作用PH值，較強的蛋白酶抗性和較好的水解各種底物的能力，可作為一種飼料或食品添 加劑應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)。


鏈霉菌Str印tomyces sp. S27保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為 CGMCCNo. 3146，保藏日期為2009年6月29日。圖1重組α -半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，M 低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1 未誘 導(dǎo)對照，對照空載體pET-28a (+)轉(zhuǎn)化Ε. C01 i BL21誘導(dǎo)后的CTP ； 2 載體pET-28a (+) / aga-S27轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21誘導(dǎo)后的CTP ；3 純化的α -半乳糖苷酶Aga_S27。圖2 α _半乳糖苷酶的最適ρΗ。圖3 α -半乳糖苷酶ρΗ穩(wěn)定性。圖4 α _半乳糖苷酶作用的最適溫度。圖5 α _半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。圖6 α -半乳糖苷酶Aga_S27的蛋白酶抗性分析。
具體實施例方式實驗條件1、菌株及載體鏈霉菌(Str印tomyces sp. S27)由發(fā)明人篩選，宿主大腸桿菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3)，載體 pET_28a (+)均購自于 Invitrogen 公司。2、酶類及其他生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公 司。胰蛋白酶(Trypsin)、α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)、蛋白酶!((Proteinase K)、枯 草桿菌蛋白酶A(Subtilisin Α)、膠原蛋白酶(Collagenase)為Sigma(USA)產(chǎn)品；蛋白酶 proleather 為 Amano Enzyme Inc. (Japan)產(chǎn)品；IPTG 為 Promega 公司產(chǎn)品；蜜二糖、棉子 糖、水蘇糖和牛血清白蛋白為Sigma(USA)產(chǎn)品；其它都為國產(chǎn)試劑。3、高氏 1 號培養(yǎng)基0· 1 % KNO3,0. 05 % K2HPO4, 2 % 可溶性淀粉，0. 05 % MgSO4 · 7Η20，0· 05% NaCl,0. 001% FeSO4 · 7Η20, ρΗ7· 2-7. 4。察氏誘導(dǎo)培養(yǎng)基0·1 % K2HPO4,0. 3 % NaNO3,0. 05 % KCl, 0. 05 % MgSO4 · 7Η20, 0. 05% FeSO4 · 7Η20，3%的豆粕為碳源，ρΗ天然。大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl, ρΗ7. 0)。說明本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實施 例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分來進行，包括Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)；禾口Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編，1994)。實施例1分離鏈霉菌Sti^ptomyces sp. S27及其產(chǎn)酶特性菌株Sti^ptomyces sp. S27分離自新疆火焰山土壤，在高氏1號培養(yǎng)基上生 長2天后，菌體聚集為白色小球。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA的保守序列設(shè)計的引物(27F: 5 ‘ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ‘和 1492R 5 ‘ -TACGGHTACCTTACGACTT-3 ‘)對菌株的 16S rDNA進行PCR擴增，測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)S27的16S rDNA核苷酸序列與 Streptomyces radiopugnans strain HBUMl74051 (Genbank accession No. FJ486333)據(jù)有最高的相似性為100%。結(jié)合形態(tài)觀察，可證明該菌株為鏈霉菌，命名 為Sti^ptomyces sp. S27。將豆粕作為誘導(dǎo)物和碳源加入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(0. 1 % K2HPO4, 0. 3% NaNO3,0. 05% KCl, 0. 05% MgSO4 ·7Η20，0· 05% FeSO4 ·7Η20，3% 的豆粕為碳源)，30°C、 250rpm搖振培養(yǎng)2_5天后，將菌液離心，取上清測酶活。結(jié)果48h (約2d)后出現(xiàn)出較高的 α-半乳糖苷酶活性，約0. 17U/mL (以pNPG為底物)。實施例2鏈霉菌α -半乳糖苷酶編碼基因aga-S27的克隆提取鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. S27)基因組DNA 將在高氏1號培養(yǎng)基中30°C培 養(yǎng)了 2d的菌液IOOOOrpm離心lOmin，稱取50mg菌泥加500 μ L無菌水清洗，離心取沉淀的 菌體。沉淀的菌體重懸于500 μ L溶菌酶混合液，37°C溫育lh，再補加酶液100 μ L于45°C 繼續(xù)保溫30min，至菌液透明后，加10% SDS至終濃度2%，攪拌約5min至菌液粘度顯著下 降，15000rpm離心IOmin去碎片。上清液分別用等體積酚，酚氯仿，氯仿依次抽提。取上 層溶液加0. 6-1倍體積的異丙醇常溫沉淀lOmin。16000rpm離心15min。沉淀用70%乙醇 清洗，稍離心，將沉淀抽干后用30 μ L無菌水溶解，_20°C保存?zhèn)溆?。根?jù)發(fā)表的α _半乳糖苷酶的保守序列設(shè)計合成了簡并引物P4， 5' -GAYGAYGGNTGGTTYGGN-3‘和Pr8，5' -GACCATYTCNGGYTCNAMCC-3‘ (Y代表C/T，N代表 A/T/C/C，M代表A/G)，鏈霉菌S27總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為95°C 5min ； 94°C 30sec, 58-48°C 30sec (其中每個循環(huán)后復(fù)性溫度下降1°C )，72°C lmin, 10個循環(huán)，然 后進入第二個循環(huán)程序94°C 30sec,48°C 30sec,72°C lmin，25 個循環(huán)后；72°C IOminJlC 脂糖電泳檢測。得到的片段測序。采用半補齊法構(gòu)建鏈霉菌S27基因文庫，根據(jù)測序得到的核甘酸序 列設(shè)計篩庫引物 S27spl，5 ‘ -CCATCTCCGGCTCGACCCAGAGGCCG-3 ‘和 S27rspl， 5 ‘ -GACGACGGCTGGTTCGGCTCGCGC-3 ‘，通過PCR在基因文庫中篩選到含有aga_S27基因 全長的陽性克隆。PCR 反應(yīng)參數(shù)為95°C 5min ；94°C 30sec，65°C 30sec，72°C 30sec，30 個 循環(huán)；72°C 5min，瓊脂糖電泳檢測。對插入片段進行測序獲得aga-S27全長基因。結(jié)果 表明，該基因為一個長2229bp的基因片段，編碼742個氨基酸和一個終止密碼子。酶蛋 白與 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus 的假使 α -半乳糖苷酶(Genbank accession No. YP_001709642)有最高的氨基酸序列相似性為 55%，與 Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 驗證活性 α -半乳糖苷酶(Genbank accession No. ABD96085)相 似性為 46%，與 Escherichia coli K12 驗證活性 α -半乳糖苷酶(Genbank accession No. AAA24497)相似性為40%。該編碼基因為一個新基因。
實施例3 α -半乳糖苷酶的活性分析酶活性測定方法采用pNPG法。將pNPG溶于0. lmol/L McIlvaine緩沖液中，使其 終濃度為 2mmol/L。將 20 μ L 酶液，230 μ L 的 McIlvaine 緩沖液和 250 μ L 2mmol/L 的 pNPG 混合，搖勻。37°C溫育5min后，反應(yīng)液中加入1.5mL lmol/L的Na2CO3溶液來終止反應(yīng)。在 405nm處測其OD值，以對硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。對照管加酶液和緩沖液后，先 加Na2CO3溶液再加pNPG溶液。酶活(U/mL)單位定義在37°C下每分鐘分解pNPG釋放1 μ mol pNP需的酶量被 定義為一個 酶活單位。實施例4制備α -半乳糖苷酶編碼基因aga-S27表達的重組酶根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物S27-AG-HS (5，-CTGGAATTCATGCCGGTTTGGCCAGGACGGAGACACAC-3，，下劃線為 EcoRI 位點)和 S27AG-2 (5，-CTTAAGCTTTCACACCCGGGTCGCGCGC-3’,下劃線為 Hind III 位點)，進 行PCR擴增。質(zhì)粒pET28a(+)和基因片斷進行雙酶切后連接形成載體pET28a (+)/aga-S27， 制備BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pET28a(+)/aga-S27電擊轉(zhuǎn)化宿主菌。鑒定陽性重 組子，并誘導(dǎo)檢測酶活。取含有重組體質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株和含有pET-28a(+)空質(zhì)粒的 BL2KDE3)菌株(作對照)，分別接種于3mL LB (加有50 μ g/mL的卡那霉素)培養(yǎng)液中，37°C 快速振蕩培養(yǎng)過夜。分別取100 μ L過夜培養(yǎng)液加入含50 μ g/mL卡那霉素的IOmL LB培養(yǎng) 液(1%接種量)中，37°0振蕩培養(yǎng)約2-31!(00_達到0.6-0.8)后加入終濃度lmmol/L的誘 導(dǎo)劑IPTG，180C 180rpm震蕩培養(yǎng)12h。培養(yǎng)液12，OOOrpm離心5min，分別收集培養(yǎng)基上清 和沉淀，細(xì)胞沉淀用PH7. 4的0. lmol/L的Mcllvaine緩沖液重懸，超聲破碎后12，OOOrpm離 心lOmin，收集上清為細(xì)胞總蛋白(CTP)。按上述酶活測定方法分別檢測培養(yǎng)基上清和CTP 酶活。結(jié)果重組酶主要在大腸桿菌胞內(nèi)表達，CTP中酶活性為22. 97U/ml。經(jīng)SDS-PAGE電 泳檢測，可以看見一條明顯的特異性條帶(圖1，LANE2)。大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的α -半乳糖苷酶Aga_S27經(jīng)一步Ni-NTA柱純化(NEB)，比活 提高至11. 26U/mg。純化Aga-S27經(jīng)SDS-PAGE得到電泳純的單一條帶，分子量約為80kDa 與預(yù)測分子量相近(圖1，LANE 3)。實施例5 α -半乳糖苷酶Aga_S27的酶學(xué)性質(zhì)經(jīng)純化的α _半乳糖苷酶Aga_S27在不同的pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。 所用緩沖液為pH 2.0 8.0的0. lmol/L的McIlvaine緩沖液和pH 9.0 11.0的0. Imol/ L的甘氨酸-NaOH緩沖液。純化的α-半乳糖苷酶Aga_S27在不同pH的緩沖體系，37°C下 測定的PH適性結(jié)果(圖2)表明Aga-S27的最適作用pH為7. 4，在pH7. 0-7. 4保持80% 以上的相對酶活性，PH低于5或高于10. 0幾乎喪失所有酶活。將酶液在不同pH值的緩沖液中于37°C下處理0. 5h，再測定酶活性以研究酶的pH 穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖3)，Aga-S27在pH范圍為7. 0-10.0間都很穩(wěn)定，保持80%以上的酶活。最適溫度的測定在pH7. 4的0. lmol/L的Mcllvaine緩沖液體系及不同的溫度 (0 70°C )下進行酶促反應(yīng)。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明，Aga-S27的最適作 用溫度35°C，溫度高于60°C時剩余不到2%的酶活。測定α-半乳糖苷酶在不同的溫度(50°c )下分別保溫2、5、10、15、20、30時的相對酶活力，繪制酶的熱穩(wěn)定性曲線。在50°C下處理30min后酶活剩余約50%，熱穩(wěn)定性較好。(圖5)。實施例6 α -半乳糖苷酶Aga_S27蛋白酶的抗性將蛋白酶分別用下列溶液配制成lmg/mL的溶液用pH 7. 00. lmol/L Tris-HCl配 制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶溶液；用ΡΗ7. 50. lmol/L Tris-HCl配制蛋白酶K、枯草桿菌蛋白 酶A、膠原蛋白酶溶液；用ρΗΙΟ. 00. lmol/L甘氨酸-NaOH配制proleather、堿性蛋白酶溶 液。將純化的α-半乳糖苷酶與蛋白酶按10 1 (w/w)比例在該蛋白酶緩沖液中處理30min 后，按標(biāo)準(zhǔn)方法檢測處理酶的剩余酶活。結(jié)果表明，用不同蛋白酶處理后Aga-S27-H的剩余 酶活分別為49. 41% (胰蛋白酶)，100. 87% (^-糜蛋白酶)，14. 52% (蛋白酶K)，95. 31% (枯草芽孢桿菌蛋白酶A)，101. 84% (膠原蛋白酶)和28. 58% (proleather)，由此可以看 出Aga-S27-H對各種蛋白酶的抗性比較不一致。對于α -糜蛋白酶、枯草芽孢桿菌蛋白酶 Α、膠原蛋白酶，Aga-S27-H有較好的抗性；而對于胰蛋白酶、蛋白酶K和proleather抗性一 般；對于堿性蛋白酶則沒有抗性(圖6)。實施例7 α-半乳糖苷酶Aga_S27的底物特異性將蜜二糖、棉子糖、水蘇糖溶解于0. lmol/L, pH 7. 4的Mcllvaine緩沖液中，濃度 各lmg/mL，用lU/mL和3U/mL的α -半乳糖苷酶分別與這些底物在37°C下作用24h。半乳 糖的釋放用離子交換色譜儀CARB0PAC PAlO (Dionex Corporation, USA)進行測定。結(jié)果表 明(表1)，Aga-S27分解蜜二糖的水解率最高為37. 91 %，且其對天然底物的水解能力為蜜 二糖>棉子糖>水蘇糖。并且3個單位的酶要比1個單位的酶分解能力更強一些。說明該 酶具有較好的底物特異性和較高的水解能力。表lAga_S27對不同底物的降解能力 序列表<110>江蘇奕農(nóng)生物工程有限公司<120>—種高α-半乳糖苷類寡糖降解能力的中性a -半乳糖苷酶Aga_S27及其 基因和應(yīng)用<160>2
<210>1<211>742<212>PRT<213> 鏈霉菌(Str印tomyces sp. S27)
<400>1VPVWPGRRHTVASRSAPLPLDVTHLRAAGVSLVLDLTGGTLPRVLHWGADLGTLGPEELG 60SLRLAGAPQPIGFSVDGPVEVSVLPEQSAGWLGTPGLVGNRGGRDFSTAFAVREAALTGP 120VEGSRSPGGGGGAIVTVLARDEAAALDLELVIELTASGLVRQRATVANRGSSPFTVDAVN 180LTLPVPAEAVELLDFTGHHLRERSPQRTAFTQGLRMRENRTGRTGYDSAYLLAAGTAGFG 240NRSGEVWAVHTAWSGNHRTFAERTFHSVSLLGSGELLLSGEVVLEPGESYASPWQYGSYG 300RHGLDEVSARFHRWLRSRPHHPSTPRPVTLNTWEAVYFDHDLDRLRALADAAAAVGAERF 360VLDDGWFGSRRDDRRAL⑶WYVSDEVWPDGLGPLTGHVTGLGMQFGLWVEPEMVNEDSDL 420ARAHPDWVMAAGDRLPGAARHQQVLDLARPEAFAYILGRLDELLEAYPIAYLKWDHNRDL 480VDAGHRPTGRAGVHGQTRAVYRLMDELRRRHPGVEIESCSSGGGRVDLEILQRTDRVWVS 540DCIDALERQTIQRWTNALIPLELMGTHVGSDVAHTTGRRHPVDFRAGTALFGHFGIEWDL 600TAAAPEELARLAQWVDLYKELRGLLHTGVRVHADHPDPAHRLHGVVAEDGSDAVYALVAT 660ASSAMYPAGAIRLPGLDADAVYRVRPQAP⑶LPDGNAHHWGVRLPWWTPEGVRLPGRVLA 720AAGLQAPVLHPERLVLLRATRV 742<210>2<211>2229<212>DNA<213> 鏈霉菌(Str印tomyces sp. S27)<400>2GTGCCGGTTTGGCCAGGACGGAGACACACCGTGGCATCACGTTCCGCTCCCCTTCCCCTC 60GATGTGACGCACCTGCGGGCGGCCGGCGTCAGCCTCGTACTGGACCTGACCGGCGGCACC 120CTCCCCCGGGTCCTGCACTGGGGTGCCGACCTCGGCACGCTCGGCCCCGAGGAGCTGGGC 180TCCCTGCGGCTGGCCGGGGCGCCGCAGCCCATCGGCTTCTCCGTGGACGGCCCGGTCGAG 240GTCTCGGTGCTGCCCGAGCAGTCGGCCGGCTGGCTGGGCACCCCCGGCCTGGTGGGCAAC 300CGCGGCGGCCGGGACTTCTCCACCGCCTTCGCCGTCCGCGAGGCCGCCCTCACCGGGCCC 360GTGGAGGGGTCCCGCTCCCCCGGCGGCGGAGGCGGCGCCATCGTCACCGTCCTCGCCCGC 420GACGAGGCCGCGGCCCTGGATCTGGAGCTGGTGATCGAGCTGACCGCGTCCGGACTGGTG 480CGCCAGCGCGCCACGGTCGCCAACCGCGGCTCCTCCCCCTTCACCGTCGACGCCGTGAAC 540CTCACGCTGCCGGTGCCCGCCGAAGCCGTCGAGCTGCTGGACTTCACCGGGCACCACCTG 600CGCGAACGCAGCCCGCAGCGCACCGCCTTCACCCAGGGGCTGCGGATGCGGGAGAACCGC 660ACCGGCCGCACCGGCTACGACAGCGCCTACCTGCTGGCCGCGGGCACCGCGGGCTTCGGC 720AACCGCTCGGGCGAGGTGTGGGCCGTGCACACCGCGTGGTCCGGCAACCACCGCACCTTC 780GCCGAGCGCACCTTCCACTCGGTGTCGCTGCTGGGCTCGGGCGAGCTGCTGCTCTCCGGC 840GAGGTGGTGCTGGAGCCCGGGGAGTCCTACGCCTCCCCCTGGCAGTACGGCTCCTACGGG 900CGGCACGGCCTGGACGAGGTCTCCGCCCGCTTCCACCGCTGGCTGCGCTCCCGCCCGCAC 960CACCCCTCCACGCCCCGGCCGGTCACCCTCAACACCTGGGAGGCGGTCTACTTCGACCAC 1020GATCTGGACCGGCTGCGCGCCCTGGCCGACGCGGCCGCCGCGGTGGGCGCGGAGCGCTTC 1080GTCCTGGACGACGGCTGGTTCGGCTCGCGCCGCGACGACCGGCGCGCCCTGGGCGACTGG 1140
TACGTCTCGGACGAGGTGTGGCCGGACGGACTGGGCCCGCTGACCGGTCATGTCACCGGC 1200
CTGGGCATGCAGTTCGGCCTCTGGGTCGAGCCGGAGATGGTCAACGAGGACTCCGACCTG 1260GCCCGCGCCCACCCCGACTGGGTCATGGCCGCCGGGGACCGGCTGCCCGGCGCGGCCCGC 1320CACCAGCAGGTCCTCGACCTGGCCCGCCCGGAGGCGTTCGCGTACATCCTCGGGCGCCTG 1380GACGAGCTGCTGGAGGCGTACCCCATCGCGTATCTGAAGTGGGACCACAACCGGGACCTG 1440GTGGACGCCGGGCACCGGCCCACCGGCCGCGCCGGCGTGCACGGCCAGACCCGGGCGGTC 1500TACCGGCTGATGGACGAGCTGCGCCGCCGCCACCCCGGGGTGGAGATCGAGTCCTGCTCC 1560TCCGGCGGCGGACGGGTGGACCTGGAGATCCTCCAGCGCACCGACCGGGTGTGGGTCTCG 1620GACTGCATCGACGCCCTGGAGCGCCAGACCATCCAGCGCTGGACGAACGCCCTGATCCCC 1680CTCGAACTCATGGGCACCCACGTGGGGTCGGACGTCGCGCACACCACCGGGCGCCGCCAC 1740CCGGTCGACTTCCGGGCGGGCACGGCGCTGTTCGGGCACTTCGGCATCGAGTGGGACCTG 1800ACCGCCGCCGCGCCGGAGGAGCTGGCGCGGCTGGCGCAGTGGGTGGACCTCTACAAGGAG 1860CTGCGCGGCCTGCTCCACACCGGCGTCCGTGTCCACGCCGACCACCCGGACCCGGCCCAC 1920CGGCTGCACGGGGTGGTCGCCGAGGACGGCTCGGACGCGGTGTACGCCCTCGTCGCCACC 1980GCCTCCTCCGCGATGTACCCGGCCGGTGCGATCCGGCTGCCGGGGCTGGACGCGGACGCC 2040GTCTACCGGGTGCGGCCGCAGGCCCCCGGCGACCTGCCGGACGGCAACGCCCACCACTGG 2100GGCGTCCGCCTGCCCTGGTGGACGCCGGAGGGTGTGCGGCTGCCGGGCCGGGTGCTGGCG 2160GCCGCGGGGCTCCAGGCCCCGGTGCTCCACCCCGAGCGGCTGGTGCTGCTGCGCGCGACC 2220CGGGTGTGA 2229
權(quán)利要求
一種鏈霉菌Streptomyces sp.S27，其保藏號為CGMCC No.3146。
2.一種高α-半乳糖苷類寡糖降解能力的中性α-半乳糖苷酶Aga_S27，其特征在于， 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.一種高α-半乳糖苷類寡糖降解能力的中性α-半乳糖苷酶基因aga-S27，其特征 在于，編碼權(quán)利要求2所述的α -半乳糖苷酶Aga_S27。
4.如權(quán)利要求3所述的α-半乳糖苷酶編碼基因aga-S27，其特征在于，其堿基序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
5.包含權(quán)利要求3或4所述α-半乳糖苷酶基因aga-S27的重組載體。
6.包含權(quán)利要求3或4所述α-半乳糖苷酶基因aga-S27的重組菌株。
7.如權(quán)利要求6的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或 乳酸桿菌。
8.一種制備高α-半乳糖苷類寡糖降解能力的中性α-半乳糖苷酶Aga_S27的方法， 其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求6的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α-半乳糖苷酶表達；以及3)回收并純化所表達的α-半乳糖苷酶Aga_S27。
9.權(quán)利要求2所述高α-半乳糖苷寡糖降解能力的中性α-半乳糖苷酶Aga_S27的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種高α-半乳糖苷類寡糖降解能力的中性α-半乳糖苷酶Aga-S27及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明篩選得到新的鏈霉菌Streptomyces sp.S27，其保藏號為CGMCC No.3146，并從該菌株中得到一種對α-半乳糖苷類寡糖具有高降解能力的中性α-半乳糖苷酶Aga-S27，進而得到其基因、包含該基因的重組載體。所述α-半乳糖苷酶Aga-S27的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，該酶具有適宜的作用溫度及pH值，較強的蛋白酶抗性和較好的水解各種底物的能力，可作為一種飼料或食品添加劑應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)。
文檔編號A23L1/305GK101838618SQ200910087938
公開日2010年9月22日 申請日期2009年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者張慧君, 曹雅男, 王娟娟, 項有煒 申請人:江蘇奕農(nóng)生物工程有限公司