專利名稱：一種篩選誘變生物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種篩選誘變生物的方法。
背景技術：
紫外線和NTG誘變育種等傳統(tǒng)菌種選育手段(classical strain improvement, csi)基本上不過多關注宿主內(nèi)的生化反應和遺傳信息，主要是基于欲改良的表型直接進行 篩選。不同于csi手段，代謝工程的重點在于針對特定的生化反應進行分析和改造，以實現(xiàn) 對宿主的表型進行定向的優(yōu)化。隨著轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組和代謝組分析等系統(tǒng)生物技術的普 及應用，代謝工程手段越來越得到人們認可和采用。CSI手段實現(xiàn)的是全基因組范圍內(nèi)的多 位點突變，往往對宿主表型產(chǎn)生深刻的影響，雖然耗時耗力，但實際應用的效果要好于代謝 工程改造。相比而言，代謝工程存在兩大突出的缺點，一，限于目前人們的認知水平，純理性 的分析往往有很大的局限性，因而改造結果事與愿違的情況時有發(fā)生；二，目前的組學分析 手段往往能一次提供多個候選的改造靶點，但是現(xiàn)有的重組DNA技術很難在同一個宿主中 高效的同時實現(xiàn)多個靶點的改造，一般只能順序引入。Manor Askenazi等報道了一種名為 報告基因誘變篩選(R印orter-guided mutant selection, RGMS)的方法將代謝工程分析手 段和CSI誘變能力有效結合起來的方法，成功的實現(xiàn)了絲狀真菌Aspergillus terreus中 洛伐他定產(chǎn)量的提高。在該研究中，研究小組采用轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析技術，找到跟洛伐他 定產(chǎn)量高度正相關的關鍵基因lovF，然后，采用腐草霉素抗性基因ble作為報告基因，構建 啟動子探針質(zhì)粒lovF-ble，對含有該質(zhì)粒的洛伐他定產(chǎn)生菌進行誘變，通過腐草霉素抗性 篩選得到一些IovF高表達的突變株，并從中篩選得到洛伐他定高產(chǎn)菌，這種方法篩選效率 遠遠高于傳統(tǒng)的誘變篩選效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種篩選誘變生物的方法。本發(fā)明所提供的篩選誘變生物的方法，包括如下步驟1)在誘變前，將表達盒導入含有與目的產(chǎn)物合成相關基因的待誘變生物內(nèi)，得到 含有所述表達盒的重組待誘變生物；所述表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、 報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動 子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基因1和報告基因2挑選目的誘變生物。上述過程中，所述表達盒中的報告基因和啟動子可以按如下方式連接從表達盒 的上游至下游依次為所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因1和報告基因2 (即 兩個報 告基因受一個啟動子調(diào)控)；所述表達盒中的報告基因和啟動子還可以以下方式進 行連接報告基因1和報告基因2分別受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子獨立調(diào) 控；上述過程中，所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子，不僅可以包括核心啟動子區(qū)，還可以包括核心啟動子周圍的順式作用元件，增強子等調(diào)控序列。上述過程中，所述與目的產(chǎn)物合成相關基因具體可為所述目的產(chǎn)物在生物內(nèi)的合 成途徑中的、能提高所述目的產(chǎn)物合成量的關鍵性基因。上述過程中，所述報告基因1和報告基因2為兩個不同的報告基因。上述過程中，連入表達盒中的所述報告基因具體可為報告基因的開放讀碼框或帶 有核糖體結合位點的開放讀碼框。正如現(xiàn)有技術中所述，報告基因(importer gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì) 或酶的基因，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。本發(fā)明方法中，正是利用了這一 點，使報告基因在所述相關基因的啟動子的調(diào)控下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標 定所述相關基因的表達，進而標定出目的產(chǎn)物的合成情況，進而挑選出目的誘變生物(如 目的產(chǎn)物產(chǎn)量高的生物)。本發(fā)明方法中，所述報告基因在遺傳選擇和篩選檢測方面與現(xiàn) 有技術中所述相同，具體有以下幾個條件(1)已被克隆和全序列已測定；(2)表達產(chǎn)物在 受體生物中不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的生物中無相似的內(nèi)源性表達產(chǎn)物；(3)其表達產(chǎn) 物能進行定量和定性測定。除上述條件外，在本發(fā)明方法中還最好使報告基因滿足如下條 件(1)至少其中一個報告基因為抗性基因；(2)保證報告基因的活性水平與上述關鍵基因 的啟動子活性水平有一定程度的正相關。上述過程中，所述篩選方法可用于一般誘變中的篩選，如紫外誘變、NTG誘變等。 也可以用于新興誘變手段中的篩選，如基因組改組(Zhang, Y. X.，Perry, K.，Vinci, V. Α.， Powell, K. , Stemmer, W. P. , del Cardayre, S. B. , 2002. Genome shufflingleads to rapid phenotypic improvement in bacteria. Nature. 415，644—646.)。上述過程中，所述待誘變生物可為原核微生物、真核微生物(如絲狀真菌)、植物 細胞或動物細胞；具體可為原核微生物；再具體可為原核微生物中的放線菌；再具體可為 原核微生物中的鏈霉菌；進一步具體可為玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomycesroseosporus)。上述過程中，當所述目的產(chǎn)物為達托霉素，用鏈霉菌作為待誘變生物，進行誘變產(chǎn) 生達托霉素時，所述與達托霉素在鏈霉菌內(nèi)的代謝合成相關的基因的啟動子具體可選dptE 基因的啟動子；所述報告基因可選自xylE基因和neo基因。所述neo基因的核苷酸序列如 序列表中序列1所示，所述xylE基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述dptE基因 的啟動子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。達托霉素是玫瑰孢鏈霉菌產(chǎn)生的非核糖體多肽(Non-ribosomal peptides,NRPS) 類抗生素。達托霉素能在多個方面破壞細菌細胞膜功能，是目前唯一能抑制G+細菌細胞膜 上特有成分脂磷壁酸合成的抗生素。在達托霉素合成基因簇中，dptE到dptj的結構基因
(Miao, V. ，Coeffet-Legal, Μ. F. ，Brian, P. ，Brost, R. ，Penn, J.， Whiting, Α. , Martin, S. , Ford, R. , Parr, I. , Bouchard, Μ. , Silva, C. J. , Wrigley, S. K., Baltz, R.H.,2005. Daptomycin biosynthesis in Streptomyces roseosporus :cloning and analysis of the gene cluster and revision of peptide stereochemistry. Microbiology. 151，1507-1523.)，因此十分關鍵(圖1)。dptE與上游的基因間隔400bp，含 有獨立的啟動子。因此，選擇dptE作為關鍵基因，利用dptE基因的啟動子PdptE構建報告 質(zhì)粒，進行篩選。在鏈霉菌中，含有卡那抗性基因ne0(fr0m Tn5)的宿主菌對卡那霉素的抗性水平與啟動子活性水平有一定程度的正相關(Ward，J. Μ.，Jmssen，G. R.，Kieser，Τ.， Bibb, Μ. J.，Buttner, Μ. J.，1986. Construction and characterisation of a series ofmulti-copy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the amin oglycosidephosphotransferase gene from Tn5 as indicator. Mol Gen Genet.203， 468-478·)。
艮告基因 xylE，來自于 Psedomonas TOL plasmid (Kieser, Τ. , Bibb, Μ. J., Buttner, Μ. J.，Chater, K. F.，Hopwood，D. Α.，2000. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation, Norwich, England.) ；xylE 的蛋白產(chǎn)物是 Catechol 2， 3-dioxygenase,它會邑將無色的鄰苯二 )氧化成黃色的 2-hydroxymuconic semialdehyde， 形成XylE基因-鄰苯二酚2，3-雙加氧酶顯色標志系統(tǒng)。該報告基因檢測廉價而準確，顯色 水平和啟動子活性具有很好的線性相關性(Clayton，T. Μ.，Bibb，M. J.，1990. Streptomyces promoter-probeplasmids that utilise the xylE gene of Pseudomonas putida· Nucleic Acids Res. 18，1077.)。同時，既可以通過往平板 上的菌落噴灑底物氣霧做定性分析，也可 以通過檢測無細胞提取液中的鄰苯二酚雙加氧酶活性來定量分析液體培養(yǎng)下的啟動子活 性。所以在鏈霉菌的實驗中，采用上述兩個報告基因。在實際應用中，本發(fā)明方法可以有以下幾種具體情況，當然還有其它的應用情況， 可以根據(jù)不同的實際需要進行靈活選擇運用1、只進行一輪篩選。步驟如下只進行一次誘變。1)在誘變前，將表達盒導入含有與目的產(chǎn)物合成相關基因的待誘變生物內(nèi)，得到 含有所述表達盒的重組待誘變生物；所述表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、 報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動 子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基因1和報告基因2挑選目的誘變生物。2、進行兩輪篩選。步驟如下進行兩次誘變第一輪篩選(第一次誘變中的篩選)1)在第一次誘變前，將表達盒導入含有與目 的產(chǎn)物合成相關基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達盒的重組待誘變生物；所述表達 盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基 因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子的調(diào)控；2)在第一次誘變后，根據(jù)所述報告 基因1和報告基因2挑選目的誘變生物。第二輪篩選(第二次誘變中的篩選)1)在進行第二次誘變前，將不同于第一輪 篩選的表達盒導入第一輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第二輪篩選所用的重組待誘變 生物；所述不同于第一輪篩選的表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因 1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子的調(diào) 控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關基因與第一輪篩選中所述的基因不同，報告基因1和報 告基因2與第一輪篩選中所述的報告基因可相同也可不同；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基 因1和報告基因2挑選目的誘變生物。在進行第二輪篩選前，最好先將第一輪篩選得到的目的誘變生物中的、被導入的 表達盒丟失。丟失可用現(xiàn)有技術中的常規(guī)手段進行(如在沒有抗性的平板上培養(yǎng)等)。
3、進行多輪篩選。步驟如下進行三次以上誘變(包括三次)第一輪篩選(第一次誘變中的篩選)1)在第一次誘變前，將表達盒導入含有與目 的產(chǎn)物合成相關基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達盒的重組待誘變生物；所述表達 盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基 因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子的調(diào)控；2)在第一次誘變后，根據(jù)所述報告 基因1和報告基因2挑選目的誘變生物。第二輪篩選(第二次誘變中的篩選)1)在進行第二次誘變前，將不同于第一輪 篩選的表達盒導入第一輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第二輪篩選所用的重組待誘變 生物；所述不同于第一輪篩選的表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因 1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子的調(diào) 控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關基因與第一輪篩選中所用的基因不同，報告基因1和報 告基因2與第一輪篩選中所用的報告基因可相同也可不同；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基 因1和報告基因2挑選目的誘變生物。第三輪篩選(第三次誘變中的篩選)1)在進行第三次誘變前，將不同于第一輪和 第二輪篩選的表達盒導入第二輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第三輪篩選所用的重組 待誘變生物；所述不同于第一輪和第二輪篩選的表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟 動子、報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因 的啟動子的調(diào)控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關基因與第一輪和第二輪篩選中所述的基 因不同，報告基因1和報告基因2與第一輪和第二輪篩選中所用的報告基因可相同也可不 同；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基因1和報告基因2挑選目的誘變生物。第η輪篩選(第η次誘變中的篩選)1)在進行第η次誘變前，將不同于第1輪至 第η-1輪篩選的表達盒導入第η-1輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第η輪篩選所用的 重組待誘變生物；所述不同于第1輪至第η-1輪篩選的表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基 因的啟動子、報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相 關基因的啟動子的調(diào)控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關基因與第1輪至第η-1輪篩選中所 用的基因不同，報告基因1和報告基因2與第1輪至第η-1輪篩選中所用的報告基因可相 同也可不同；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基因1和報告基因2挑選目的誘變生物。在進行每輪篩選前，最好先將前一輪篩選得到的目的誘變生物中的、被導入的表 達盒丟失。丟失可用現(xiàn)有技術中的常規(guī)手段進行(如在沒有抗性的平板上培養(yǎng)等)。在以上多輪篩選中，每輪篩選所用的與目的產(chǎn)物合成相關基因都不同，以實現(xiàn)對多 個關鍵基因進行疊加篩選的功能。具體可以通過采用游離型報告質(zhì)粒來實現(xiàn)該功能由于大 多數(shù)游離質(zhì)粒在無抗性壓力的條件下比較容易從宿主中丟失，因此，可以在操作完一個關鍵 基因后，得到一個或多個目標表型優(yōu)化了的突變株，然后通過簡單的質(zhì)粒丟失，再轉(zhuǎn)入另一個 關鍵基因的報告質(zhì)粒進行下一輪誘變篩選。如果結合轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組和代謝組分析技術，對 每輪篩選得到的突變株進行分析，理性的選擇下一輪操作的靶基因，將更加有效。本發(fā)明方法中，在保留抗性基因作為報告基因的前提下，引入了第二個報告基因， 與第一個抗性基因串聯(lián)起來，共同監(jiān)測同一個靶基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，故將本發(fā)明方法 稱為雙報告基因誘變篩選方法(Double-r印orter-guided mutant selection, dRGMS)。
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dRGMS不僅適用于誘變微生物中篩選次生代謝產(chǎn)物(如抗生素)產(chǎn)量高的突變微生物，也適用于誘變其它生物中篩選其它小分子代謝產(chǎn)物(如初級代謝的檸檬酸，甚至大 分子蛋白質(zhì)，如抗體，糖蛋白等)產(chǎn)量提高的突變生物。事實上，只要在這些代謝物合成的途徑，能找到關鍵的過表達靶點，并且對應的 宿主能做基本的遺傳操作，dRGMS就可用。比如在生產(chǎn)一些細胞因子類蛋白的研究開發(fā) 中，人們在哺乳動物細胞中過表達蛋白折疊相關的關鍵基因，結果使宿主獲得增強的分泌 能力，提高了 蛋白因子的產(chǎn)量(Borth, N. ，Mattanovich, D. ， Kunert, R. ，Katinger, H.， 2005. Effect of increased expression of protein disulfide isomerase andheavy chain binding protein on antibody secretion in a recombinant CHO cell line. Biotechnol. Prog. 21,106-111.)。在另一個例子中，過表達細胞周期調(diào)控的負調(diào)節(jié)因 子，導致細胞周期停滯，延長了細胞生長和蛋白合成的周期，最終導致蛋白產(chǎn)量提高 (Fussenegger,Μ. ,Schlatter,S. ,Datwyler,D. ,Mazur,Χ. ,Bailey,J. Ε. ,1998. Controlled proliferation by multigene metabolic engineering enhances the productivity ofChinese hamster ovary cells. Nat. Biotechnol. 16，468-472.)。只需要對 dRGMS 做有 限的修改，比如使用哺乳動物細胞中的載體，以及換成適用于哺乳動物細胞的雙報告基因， 就可以用dRGMS作為替代手段來過表達以上提及的關鍵基因，達到更好的效果。本發(fā)明的篩選誘變生物的方法在生物誘變中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍?，F(xiàn)有技術中的報告基因誘變篩選(R印orter-guided mutant selection, RGMS) 存在假陽性較高的問題。因為宿主對某種抗生素產(chǎn)生抗性，往往同時存在多種機理 (Appelbaum, P. C. ,2002.Resistance among Streptococcus pneumoniae !Implications fordrug selection. Clin Infect Dis. 34，1613-1620)，所以當用抗生素的某個抗性基因作 為報告基因的時候，可能存在假陽性的問題，即宿主獲得高的抗性并不是因為報告基因的 高表達引起的。報告基因的假陽性會直接導致通過報告基因法挑選得到的突變株庫中產(chǎn)量 提高的陽性菌株的比例下降。本發(fā)明方法利用雙報告基因進行篩選，克服了上述假陽性高的問題，大大降低了 篩選過程中假陽性突變的比率，大大提高了篩選效率。以原核微生物中的玫瑰孢鏈霉菌 NRRL 11379 (Streptomyces roseosporus NRRL 11379)誘變篩選為例，在該實驗中，本發(fā)明 方法的篩選陽性率可達90%，而單報告基因篩選方法的篩選陽性率僅50%。本發(fā)明成功的將NTG誘變和報告基因篩選方法在鏈霉菌中得以應用，這說明該方 法應該具有普遍適用性。進一步，本發(fā)明通過采用雙報告基因方法，即dRGMS，使篩選的效率 得到了驚人的提高，并且通過跟傳統(tǒng)重組DNA技術的比較，首次比較系統(tǒng)的研究了報告基 因誘變篩選技術的特點，即在實現(xiàn)靶基因間接過表達的同時，引入未知因素，來擴展篩選的 空間。隨著人們對生物學系統(tǒng)復雜性的逐漸認識，特定生物系統(tǒng)的詳細全景將逐漸清晰和 充實，但在這漫長的過程中，如何在已有的理性認識的基礎上，充分利用更為廣闊的未知空 間，進行定向的設計和篩選，具有十分重要的實用價值，報告基因誘變篩選即是這樣一種技 術。因此，本發(fā)明方法在誘變篩選中將有廣闊的應用前景。


圖1為達托霉素結構及其合成基因簇。
圖2為sRGMS中使用的單報告質(zhì)粒pSRdptE和dRGMS中使用的雙報告質(zhì)粒 pDRdptE。圖3為單/雙報告基因篩選所得的突變株的相對產(chǎn)達托霉素的能力。圖4為在卡那霉素抗性平板上長出的突變株，鄰苯二酚顯色結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、以玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379為出發(fā)菌株 進行誘變篩選玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379購自美國農(nóng)業(yè)研究菌種 保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)。質(zhì)粒 pT3 (Kashiwagi, Α. , Sakurai, Τ. , Tsuru, S. , Ying, B. W. , Mori, K. and Yomo, Τ. ,2009.Construction of Escherichia coli gene expression level perturbation collection. Metab. Eng. 11，56-63) (Yomo，T 惠贈)；MΙ pSET152(Kieser, Τ. ， Bibb, Μ. J. ， Buttner, Μ. J. ， Chater, K. F. ， Hopwood, D. Α. ,2000.Practical Streptomyces genetics.John Innes Foundation, Norwich, England.)，Chater, K. F.惠贈；質(zhì) pIJ4083 (Clayton, Τ. Μ. , Bibb, Μ. J. ,1990. Streptomyces promoter-probeplasmids that utilise the xylE gene of Pseudomonas putida. Nucleic Acids Res. 18，1077.)，Bibb, M. J.惠贈；質(zhì) 粒 pSE34(Schmitt-John, Τ. , Engels, J. W. ,1992. Promoter constructions forefficient secretion expression in Streptomyces lividans. Appl Microbiol Biotechnol. 36，493-498.)，Engels, J. W.惠贈；M Ε. coli ET1257/pUZ8002(Kieser, Τ. ， Bibb, Μ. J. ， Buttner, Μ. J. ， Chater, K. F. , Hopwood, D. Α. ,2000. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation, Norwich, England.), Bibb, M. J 惠贈。質(zhì)粒提取、酶切、連接等常規(guī)操作見《分子克隆》第三版(Sambrook et al.，1989)。 玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)的遺傳操作見《鏈霉菌遺傳操作手冊》(Kieser et al.，2000)。KOD-plus DNA polymerase (TOYOBO)用于做 PCR 反應。PCR 擴增的片段亞 克隆到pGMET-easy (Promega,在連接之前添加3 ‘ -A),或特定的載體中。一、含雙報告基因重組菌的構建(一)相關質(zhì)粒的構建pSR質(zhì)粒的構建用引物Sens-neo和Anti-neo從質(zhì)粒pT3中擴增出883bp的無啟 動子的neo片段，測序驗證，擴增得到的neo片段序列正確，序列(5’ 一3’ )如下所示(序 列表中序列1)TT(MlTCTAAGTAGCTGACAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCatgattgaacaagatggattgca cgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatg ccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcac tgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccg agaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaa gcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagca tcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgaccc atggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggt gtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccg cttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttct gaGAATTCACTGG。其中小寫字母為基因neo編碼框，neo片段的兩端連接有酶EcoRI的識別序列，另 外，5’端還含有三重終止密碼子序列“TAAGTAGCTGA”和核糖體結合位點“AGGATGA”)；將擴 增得到的neo片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI進行酶切，然后插入pSET152的EcoRI酶切位點， 得到基本報告載體PSR，酶切和測序驗證，得到的質(zhì)粒結構及插入的序列正確，pSR中卡那 霉素抗性基因neo和安普霉素抗性基因aac (3) IV在同一個轉(zhuǎn)錄方向。pSRdptE 質(zhì)粒構建(圖 2)以玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) NRRLl 1379的基因組DNA為模板，用引物Sens-PdptE和Anti-PdptE進行PCR擴增，得到兩 端連接有酶NotI的識別序列的含dptE啟動子的片段(用PdptE表示)，測序驗證，序列正 確，PdptE的序列(5’ 一 3’)如序列表中序列2所示。用限制性內(nèi)切酶NotI分別酶切擴增得到的片段及pSR質(zhì)粒，連接，得到報告質(zhì)粒 pSRdptE，酶切和測序驗證，得到的質(zhì)粒結構及插入的序列正確，pSRdptE中含dptE啟動子 的片段位于neo的前面。pDR質(zhì)粒的構建以pIJ4083為模板，用引物Sens-xylE和Anti-xylE進行PCR擴 增，得到963bp無啟動子的xylE，測序驗證，擴增得到的片段序列正確，序列(5，— 3’)如 下所示(序列表中序列3)TATTGCGGCCGCTGAGTTGAAGAGGTGACGTCatgaacaaaggtgtaatgcgaccgggccatgtgcagc tgcgtgtactggacatgagcaaggccctggaacactacgtcgagttgctgggcctgatcgagatggaccgtgacgac cagggccgtgtctatctgaaggcttggaccgaagtggataagttttccctggtgctacgcgaggctgacgagccggg catggattttatgggtttcaaggttgtggatgaggatgctctccggcaactggagcgggatctgatggcatatggct gtgccgttgagcagctacccgcaggtgaactgaacagttgtggccggcgcgtgcgcttccaggccccctccgggcat cacttcgagttgtatgcagacaaggaatatactggaaagtggggtttgaatgacgtcaatcccgaggcatggccgcg cgatctgaaaggtatggcggctgtgcgtttcgaccacgccctcatgtatggcgacgaattgccggcgacctatgacc tgttcaccaaggtgctcggtttctatctggccgaacaggtgctggacgaaaatggcacgcgcgtcgcccagtttctc agtctgtcgaccaaggcccacgacgtggccttcattcaccatccggaaaaaggccgcctccatcatgtgtccttcca cctcgaaacctgggaagacttgcttcgcgccgccgacctgatctccatgaccgacacatctatcgatatcggcccaa cccgccacggcctcactcacggcaagaccatctacttcttcgacccgtccggtaaccgcaacgaagtgttctgcggg ggagattacaactacccggaccacaaaccggtgacctggaccaccgaccagctgggcaaggcgatcttttaccacga ccgcattctcaacgaacgattcatgaccgtgctgacctga其中小寫字母為xylE編碼框，其5’端連接有酶NotI的識別序列，另外，5’端還含 有三重終止密碼子序列“TGAGTTGAAGAGGTGA”和核糖體結合位點“GAGGTGA”)；將擴增得到的xylE片段用限制性內(nèi)切酶NotI進行酶切，然后插入pSR(用NotI和EcoRV酶切)，得到基本的雙報告質(zhì)粒PDR，酶切和測序驗證，得到的質(zhì)粒結構及插入的序列正確；pDR中，xylE 位于neo的前面，構成xylE-neo雙報告結構。pDRdptE質(zhì)粒的構建(圖2)用限制性內(nèi)切酶NotI分別酶切上述擴增得到的 PdptE片段及pDR質(zhì)粒，連接，得到報告質(zhì)粒pDRdptE，酶切和測序驗證，得到的質(zhì)粒結構及 插入的序列正確；pDRdptE質(zhì)粒中xylE和neo在PdptE的控制下共轉(zhuǎn)錄。pEdptE質(zhì)粒的構建以質(zhì)粒pSE34為模板，用引物Sens_ermE和Anti_ermE進行 PCR擴增，得到啟動子PermE*的123pb片段，測序驗證，擴增得到的片段序列正確，序列為TCGACTCTAGAgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtgg caccgcgatgctgttgtgggcacaatcgtgccggttggtaGCGGCCGCAAGCTT其兩端連接有酶XbaI和NotI的識別序列。用限制性內(nèi)切酶XbaI和NotI酶切PCR 擴增的啟動子PermE*片段和pSR，連接，得到質(zhì)粒pSRE ；酶切和測序驗證，得到的質(zhì)粒結構 及插入的序列正確。以玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL11379的基因組 DNA為模板，用引物Sens-dptE-BamHI和Anti-dptE_EcoRV進行PCR擴增，得到含完整dptE 編碼框的片段(1844bp)，測序驗證，擴增得到的片段序列正確，序列如下所示(序列表中序 列4)TATAGGATCCCGACCGGAGTCAGGAGGGGGAGTGCCTGCCgtgagtgagagccgctgtgccgggcaggg cctggtgggggcactgcggacctgggcacggacacgtgcccgggagactgccgtggttctcgtacgggacaccggaa ccaccgacgacacggcgtcggtggactacggacagctggacgagtgggccagaagcatcgcggtgaccctccgacag caactcgcgccggggggacgggcacttctgctgctgccgtccggcccggagttcacggccgcgtacctcggctgcct gtacgcgggtctggccgccgtaccggcgccgctgcccggggggcgccacttcgaacgccgccgtgtcgcggccatcg ccgccgacagcggagccggcgtggtgctgaccgtcgcgggtgagaccgcctccgtccacgactggctgaccgagacc acggccccggctactcgcgtcgtggccgtggacgaccgggcggcgctcggcgacccggcgcagtgggacgacccggg cgtcgcgcccgacgacgtggctctcatccagtacacctcgggctcgaccggcaaccccaagggcgtggtcgtgaccc acgccaacctgctggcgaacgcgcggaatctcgccgaggcctgcgagctgaccgccgccactcccatgggcggctgg ctgcccatgtaccacgacatggggctcctgggcacgctgacaccggccctgtacctcggcaccacgtgcgtgctgat gagetccacggcattcatcaaacggccgcacctgtggctacggaccatcgaccggttcggcctggtctggtcgtegg ctcccgacttcgcgtacgacatgtgtctgaagcgcgtcaccgacgagcagatcgccgggctggacctgtcccgctgg cggtgggccggcaacggcgcggagcccatccgggcagccaccgtacgggccttcggcgaacggttcgcccggtacgg cctgcgccccgaggcgctcaccgccggctacgggctggccgaggccaccctgttcgtgtcgaggtcgcaggggctgc acacggcacgagtcgccaccgccgccctcgaacgccacgaattccgcctcgccgtacccggcgaggcagcccgggag atcgtcagctgcggtcccgtcggccacttccgcgcccgcatcgtcgaacccggcgggcaccgtgttctgccgcccgg ccaggtcggcgagctggtcctccagggagccgccgtctgcgccggctactggcaggccaaggaggagaccgagcaga ccttcggcctcaccctcgacggcgaggacggtcactggctgcgcaccggcgatctcgccgccctgcacgaagggaat ctccacatcaccggccgctgcaaagaggccctggtgatacgaggacgcaatctgtacccgcaggacatcgagcacga actccgcctgcaacacccggaacttgagagcgtcggcgccgcgttcaccgtcccggcggcacctggcacgccgggct tgatggtggtccacgaagtccgcaccccggtccccgccgacgaccacccggccctggtcagcgccctgcgggggacg atcaaccgcgaattcggactcgacgcccagggcatcgccctggtgagccgcggcaccgtactgcgtaccaccagcgg caaggtccgccggggcgccatgcgtgacctctgcctccgcggggagctgaacatcgtccacgcggacaagggctggcacgccatcgccggcacggccggagaggacatcgcccccactgaccacgctccacatccgcaccccgcgtaaGATATC TATA。其中小寫字母為dptE編碼框，序列兩端連接有酶BamHI和EcoRV的識別序列，序 列的5’端，編碼框之前約18bp處為核糖體結合位點“ggagg”。用限制性內(nèi)切酶BamHI和 EcoRV酶切dptE編碼框片段和pSRE，連接，得到pEdptE ；酶切和測序驗證，得到的質(zhì)粒結構 及插入的序列正確；PEdptE中dptE受強啟動子PermE*轉(zhuǎn)錄控制。(采用鏈霉菌中常用的 強啟動子PermE*來過表達dptE)。( 二)重組菌的構建采用標準結合轉(zhuǎn)移方法將步驟(一)中得到的各質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入玫瑰孢鏈 霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379 中。轉(zhuǎn)入方法具體如文獻(Kieser， Τ. ， Bibb, Μ. J. ， Buttner, Μ. J. ， Chater, K. F. ， Hopwood, D. Α. ，2000. Practical Streptomycesgenetics. John Innes Foundation, Norwich, England.)中所述。重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pSR 將質(zhì)粒pSR轉(zhuǎn)入玫瑰孢 鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379 得至Ij ；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDR 將質(zhì)粒pDR轉(zhuǎn)入玫瑰孢 鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379 得至Ij ；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pSRdptE(含單報告基因) 將質(zhì)粒 PSRdptE 轉(zhuǎn)入玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) NRRL 11379 得到；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE (含雙報告基因) 將質(zhì)粒 PDRdptE 轉(zhuǎn)入玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) NRRL 11379 得到；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pEdptE 將質(zhì)粒 pEdptE 轉(zhuǎn)入 玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379 得到。二、誘變、篩選達托霉素產(chǎn)量高的菌株麥芽粉購自Oxoid，產(chǎn)品目錄號為LP0029 ；糊精購自北京化學試劑公司，產(chǎn)品目錄 號為69009992 ；MOPS購自Amresco，產(chǎn)品目錄號為0670。豆粉為自制，制備方法為先將豆 子壓榨出油，再對豆餅進行炒制，最后進行磨粉，其加工細度為40目。YD培養(yǎng)基，其組成為每升培養(yǎng)基中含有酵母粉4g，麥芽粉10g，葡萄糖4g，NaCl 2g，CaCl2L 5g，瓊脂糖20g，其余為蒸餾水，pH 7. 5。培養(yǎng)重組菌的培養(yǎng)基向YD培養(yǎng)基中添加安普霉素(其在培養(yǎng)基中的濃度為 25mg/l)和/或卡那霉素(目的不同，濃度有所變化)。豆粉培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有豆粉20g，糊精10g，甘油5. Og，KH2PO4O. 6g JPMOPS 8. Og，其余為水；pH 7. 1。發(fā)酵方法為將菌株接種在YD平板上，28°C培養(yǎng)7天，然后接種5cm2的菌苔到裝 有IOOml豆粉培養(yǎng)基的500ml搖瓶中；搖床上28°C，250rpm培養(yǎng)72h。(一)重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pSRdptE(含單報告基 因)的誘變、篩選1、啟動子PdptE轉(zhuǎn)錄水平與卡那霉素抗性水平的相關性重組菌卡那霉素抗性水平檢測方法制備含有不同濃度卡那霉素的豆粉培養(yǎng)基平 板；每個平板涂布大約IO5玫瑰孢鏈霉菌孢子，28°c培養(yǎng)3天，觀察菌落生長情況。觀察得到剛好不長菌落的平板，以及卡那霉素濃度稍低于前者的菌落生長很差的平板。這兩個平板對應的卡那霉素濃度的平均值，定義為重組菌的卡那霉素抗性上限。在不同濃度的卡那霉素篩選平板上分別培養(yǎng)重組菌玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomycesroseosporus) /pSRdptEλ 攻瑰抱鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) / pSR(對照)，方法同“重組菌卡那霉素抗性水平檢測方法”。實驗設3次重復。結果顯示，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) / pSR卡那霉素抗性上限為10 μ g/ml，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomycesroseosporus)/ PSRdptE的卡那霉素抗性上限為70 μ g/ml。這說明重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pSRdptE 的抗性水平明顯高于玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)/ pSR，說明含有啟動子PdptE的報告質(zhì)粒的抗性水平明顯高于不含啟動子PdptE的空報告載 體，說明卡那霉素抗性水平與啟動子轉(zhuǎn)錄水平具有較好的正相關，因此，卡那霉素抗性水平 可以反映啟動子的轉(zhuǎn)錄強度。而且，該實驗也表明，達托霉素合成次級代謝途徑的關鍵基因 dptE轉(zhuǎn)錄水平較低，具有較大的提升空間。2、重組菌的誘變和篩選(1)誘變篩選取2 XIO8CFU的重組菌玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomycesroseosporus)/pSRdptE 孢子，用 NTG(lmg/ml)誘變處理 30min。然后將處 理后的孢子涂布在一個190-mm的含有豆粉培養(yǎng)基(2%瓊脂)的平板上，平板培養(yǎng)基含有 50mg/l的安普霉素和150mg/l的卡那霉素，涂布好的平板在28°C培養(yǎng)5天，長出抗性突變 株。隨機從平板上挑選單菌落，即得到單報告基因抗性菌落。(2)發(fā)酵檢測每株菌產(chǎn)目的產(chǎn)物的能力將上述得到的單報告基因抗性菌落接種 在含有200mg/l卡那霉素的YD平板上；培養(yǎng)好的突變株分別進行發(fā)酵，檢測其產(chǎn)達托霉素 能力，篩選高產(chǎn)菌株。(3)計算單報告基因篩選的陽性率采用t檢驗(P = 0. 05, η = 3，雙邊檢驗)比較 突變株和出發(fā)菌株(重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pSRdptE)的產(chǎn)達 托霉素能力差異。每個菌株做3個平行發(fā)酵，取平均值。統(tǒng)計單報告基因抗性篩選出的菌株 中陽性突變株的比例。以不經(jīng)誘變的重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/ pSRdptE為對照菌株。陽性突變株的比例=(達托霉素產(chǎn)量顯著高于對照菌株的突變株的數(shù)目，P = 0. 05)/單報告基因抗性篩選得到的所有突變菌株數(shù)目。計算各突變株相對產(chǎn)達托霉素的能力。相對產(chǎn)達托霉素的能力=各突變株菌產(chǎn)達 托霉素的能力的平均值/對照菌株產(chǎn)達托霉素的能力的平均值。結果，通過單報告基因抗性篩選共挑選得到41株能在平板上生長的菌株。41株 菌的相對產(chǎn)達托霉素的能力如圖3A所示(圖3A中，SS表示出發(fā)菌株，其余表示41株突 變株)。結果抗性篩選得到的41株菌中陽性突變株的比例為51%。ManorAskenazi ^ (Askenazi et al. ,2003)報道的單報告基因篩選結果，陽性率大致也在40% 50%之間， 這與本實驗得到的篩選陽性率比較相近。實驗設3次重復，陽性突變株的比例均為50%左右，與Manor Askenazi等 (Askenazi et al. ,2003)報道的單報告基因篩選結果均相近。(二)重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE(含雙報告基因)的誘變、篩選
盡管實驗(一)中篩選陽性率較高，但是仍有一個問題前人的研究結果顯示， dptE過表達會導致達托霉素產(chǎn)量提高，但是以抗性基因作為報告基因篩選得到的突變株 中，仍然有約一半的突變株產(chǎn)量沒有提高。哪些原因?qū)е逻_托霉素產(chǎn)量沒有提高呢？導致 這種現(xiàn)象的主要原因可能是，一些突變株的卡那霉素抗性提高并不是報告基因neo的過表 達引起，而是其他原因?qū)е拢瑥亩a(chǎn)生了抗性提高和報告基因過表達關聯(lián)的解離。有兩個機 制可能導致這種現(xiàn)象的發(fā)生第一，如果全基因組存在卡那霉素外排泵，突變導致了這類外 排泵的過表達；第二，由于卡那霉素抑制細菌生長的靶點是核糖體蛋白，因此相關核糖體蛋 白，或其修飾酶的突變，同樣可以導致對卡那霉素的耐受。將卡那霉素抗性提高、但是dptE 基因并沒有明顯過表達的現(xiàn)象定義為抗性假陽性。為了驗證以上抗性假陽性分析，同時也為了提高報告基因篩選陽性率，本實驗進 行了雙報告基因的改進方法。在靶基因啟動子和neo (帶rbs序列)之間插入xylE基因， 這樣，串聯(lián)的兩個報告基因均受同一個啟動子驅(qū)動。對含有靶基因雙報告質(zhì)粒的出發(fā)菌株 進行誘變后，先用卡那霉素抗性平板讓高抗性突變株長出，然后通過對平板上菌落噴灑無 色的鄰苯二酚(xylE基因的底物)進行顯色，挑選黃色明顯加深的突變株進行培養(yǎng)，發(fā)酵和 達托霉素產(chǎn)量檢測。具體實驗步驟如下1、重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE (含雙報告基因) 的卡那霉素抗性水平和xylE顯色水平評價卡那霉素抗性水平檢測方法同實驗(一)中所述一致。xylE顯色水平評價方法每個豆粉培養(yǎng)基平板涂布大約IO5玫瑰孢鏈霉菌孢子， 28°C培養(yǎng)3天，然后噴灑0. 5M鄰苯二酚(水溶液)氣霧，每個平板噴5次(約0. 5ml)，37°C 溫育20min，裸眼觀察菌落顯黃色的結果。實驗設3次重復。結果顯示，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/ PDRdptE的卡那霉素抗性上限為90μ g/ml。同單報告基因重組菌抗性實驗結果略有不同， 重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE顯示的啟動子PdptE轉(zhuǎn)錄水 平略有提高，這是插在neo之前的xylE基因?qū)幼愚D(zhuǎn)錄的RNA起到了一定的穩(wěn)定作用。 對照菌株玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDR的XylE顯色結果肉眼不可見， 重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE的XylE顯色結果用肉眼也看 不見。結果同樣說明dptE在該培養(yǎng)條件下表達水平較低，具有較大的提升空間。2、重組菌誘變和篩選(1)誘變和篩選取2 X IO8CFU 的重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) /pDRdptE (含 雙報告基因)孢子，用NTG(lmg/ml)誘變處理30min。然后將處理后的孢子涂布在一個 190-mm的含有豆粉培養(yǎng)基(2%瓊脂)的平板上，平板培養(yǎng)基含有50mg/l的安普霉素和 200mg/l的卡那霉素，涂布好的平板在28°C培養(yǎng)5天，長出抗性突變株。先噴灑XylE的顯 色底物鄰苯二酚，30°C保溫20min，然后挑選肉眼可見的明顯黃色的突變株，即得到雙報告 基因表達提高的菌株。(2)發(fā)酵檢測每株菌產(chǎn)目的產(chǎn)物的能力將上述得到的雙報告基因抗性菌株接種在含有200mg/l卡那霉素的YD平板上；培養(yǎng)好的突變株分別進行發(fā)酵，檢測其產(chǎn)達托霉素 能力，篩選高產(chǎn)菌株 (3)計算雙報告基因篩選的陽性率采用t檢驗(P = 0. 05, η = 3，雙邊檢驗)比較 突變株和出發(fā)菌株(重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE)的產(chǎn)達 托霉素能力差異。每個菌株做3個平行發(fā)酵，取平均值。統(tǒng)計雙報告基因抗性篩選出的菌株 中陽性突變株的比例。以不經(jīng)誘變的重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/ PDRdptE為對照菌株。陽性突變株的比例=(達托霉素產(chǎn)量顯著高于對照菌株的突變株的數(shù)目，P = 0. 05) /雙報告基因抗性篩選得到的所有突變菌株數(shù)目。計算各突變株相對產(chǎn)達托霉素的能力。相對產(chǎn)達托霉素的能力=各突變株菌產(chǎn)達 托霉素的能力的平均值/對照菌株產(chǎn)達托霉素的能力的平均值。鄰苯二酚顯色的結果見圖4(圖中A指示的突變株顯示較深的黃色，B指示的突變 株用肉眼觀察不到黃色)。從圖中可以看出，并不是所有在高卡那霉素抗性平板上長出的突 變株都顯示了明顯的黃色，相反，只有大約一半的突變株顯示了肉眼明顯可見的黃色，這些 突變株是dptE基因?qū)崿F(xiàn)了過表達的突變株，圖中突變株A即是典型的dptE過表達株，而突 變株B是典型的假陽性突變株(高卡那霉素抗性低XylE活性)。共挑選得到50株能在平板上生長的菌株。50株菌的相對產(chǎn)達托霉素的能力如圖 3B所示(圖3B中，SS表示對照菌株玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pDRdptE, A表示重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pEdptE其余表示50株突變株)。 結果抗性篩選得到的50株突變株中僅5株產(chǎn)量與出發(fā)菌株持平，其他產(chǎn)量均不同程度的提 高，篩選陽性率高達90% .這說明，通過第二個報告基因篩選的引入，有效的排除了單一抗 性報告基因篩選的假陽性，從而極其高效的挑選到dptE過表達、達托霉素產(chǎn)量提高的突變 株。這種篩選效率是傳統(tǒng)的誘變方法根本無法達到的。實驗設3次重復，均得到相同的陽性突變株的比例。(三)高效液相色譜(HPLC)檢測達托霉素檢測儀器為Waters Alliance 2690 HPLC system,色譜柱為 Waters Symmetrycolumn (4. 6*50mm，顆粒大小3. 5 μ m)。流動相為乙腈和水(均加入0. 01%三氟乙 酸)。流速1.5ml/min，檢測波長285nm。發(fā)酵液上清用0. 22 μ m濾膜過濾后直接上樣，上樣 量為20μ 1。梯度洗脫步驟如下在0 2. 5min內(nèi)，乙腈10% (體積百分含量)；2. 5 8. 5min 內(nèi)，乙腈濃度從10%線性增加到100% ；8. 5-10min,乙腈濃度從100%線性回復到10%。在上述條件下，達托霉素相關三個組分的保留時間分別為A21978Q5. 57min、 A21978C25. 71min、A21978C35. 85min。每個菌株發(fā)酵液三個組分的總含量作為達托霉素的 產(chǎn)量。由于出發(fā)菌株和所有突變株的菌體生長速度沒有明顯差異，菌體密度趨于統(tǒng)一，所以 菌株產(chǎn)達托霉素的能力統(tǒng)一用“g/Ι發(fā)酵液”表示，不再考慮菌體量變化。為了便于比較， 用每個突變株產(chǎn)達托霉素的能力值除以出發(fā)菌株的產(chǎn)達托霉素的能力值，得到產(chǎn)達托霉素 的能力的相對值。在sRGMS實驗中，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/ pSRdptE是出發(fā)菌株；在dRGMS實驗中的出發(fā)菌株是重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)/pDRdptE。菌種發(fā)酵產(chǎn)生的達托霉素類化合物主要三個組分是A21978(V3，生產(chǎn)中，通過水解這三種化合物的側(cè)鏈然后連上達托霉素特異的側(cè)鏈來合成達托霉素 (Miao et al. ,2005. Daptomycin biosynthesis in Streptomyces roseosporus :cloning and analysis of the genecluster and revision of peptide stereochemistry. Microbiology. 151，1507-1523.)。(四)玫瑰孢鏈霉菌(St r印tomyces roseosporus) NRRL 11379與重組菌玫瑰孢鏈 霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE的產(chǎn)達托霉素能力比較按照上述方法將玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379與重組 菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pDRdptE分別發(fā)酵，然后檢測其產(chǎn)達托霉素 能力。實驗設3 次重復，玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379 的 產(chǎn)達托霉素能力為103mg/l發(fā)酵液；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomycesroseosporus)/ PDRdptE的產(chǎn)達托霉素能力為98mg/l發(fā)酵液；二者沒有明顯差別，表明向野生菌株中導入 雙報告質(zhì)粒pDRdptE對達托霉素產(chǎn)量沒有明顯的影響。上述實施例中所使用的質(zhì)粒及菌種如表1所示。上述實施例中所使用的PCR引物 序列及測序引物序列如表2所示。表1.所用的菌種和質(zhì)粒
權利要求
一種篩選誘變生物的方法，包括如下步驟1)在誘變前，將表達盒導入含有與目的產(chǎn)物合成相關基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達盒的重組待誘變生物；所述表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基因1和報告基因2挑選目的誘變生物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述表達盒從上游至下游依次為所述與 目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因1和報告基因2。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物為微生物、植物細胞或動物 細胞。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述微生物為原核微生物。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述原核微生物為鏈霉菌。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述鏈霉菌為玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomyces roseosporus)0
7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述報告基因1的核苷酸序列 如序列表中序列1所示，所述報告基因2的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述與目的 產(chǎn)物合成相關基因的啟動子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
8.權利要求1-7中任一所述方法在生物誘變中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選誘變生物的方法。該篩選方法包括如下步驟1)在誘變前，將表達盒導入含有與目的產(chǎn)物合成相關基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達盒的重組待誘變生物；所述表達盒包括與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子、報告基因1和報告基因2，報告基因1和報告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關基因的啟動子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報告基因挑選目的誘變生物。本發(fā)明方法利用雙報告基因進行篩選，克服了假陽性高的問題，大大降低了篩選過程中假陽性突變的比率，大大提高了篩選效率。以原核微生物中的玫瑰孢鏈霉菌NRRL11379(Streptomyces roseosporus NRRL 11379)誘變篩選為例，在該實驗中，本發(fā)明方法的篩選陽性率可達90％，而單報告基因篩選方法的篩選陽性率僅50％。
文檔編號C12N15/64GK101942476SQ200910088678
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權日2009年7月7日
發(fā)明者周博 申請人:周博