專利名稱：一種人胰高血糖素樣肽-1的復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胰高血糖素-1的復(fù)合物及其制備方法，確切的說(shuō)，涉及一種聚乙 二醇-人胰高血糖素樣肽-1，即PEG-GLP-I的復(fù)合物及其制備方法，屬肽或蛋白質(zhì)的修飾復(fù) 合物及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是現(xiàn)代疾病中的第二殺手，其對(duì)人體的危害僅次于癌癥，而且現(xiàn)在的糖尿 病有擴(kuò)大化和年輕化的傾向。2006年國(guó)家疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)已成為糖 尿病發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家。全國(guó)至少有3500萬(wàn)人患有這種慢性疾病。因此糖尿病的藥物 具有非常廣闊的市場(chǎng)。2型糖尿病的主要病理生理基礎(chǔ)是胰島素分泌減少和胰島素抵抗，如何促進(jìn)胰島 β細(xì)胞分泌胰島素一直是降糖藥研究的重點(diǎn)，因?yàn)楸M管2型糖尿病患者空腹胰島素水平較 高，但是缺乏餐后第一相胰島素反應(yīng)，從而導(dǎo)致餐后高血糖。目前市場(chǎng)上也有許多藥物通過(guò) 非葡萄糖依賴途徑刺激胰島素分泌，由于這種藥物不能根據(jù)體內(nèi)葡萄糖水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，因 此會(huì)出現(xiàn)體內(nèi)葡萄糖過(guò)低的危險(xiǎn)。而GLP-I正可以促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌，不會(huì)出 現(xiàn)上述危險(xiǎn)。胰島β細(xì)胞功能衰竭是2型糖尿病致病機(jī)制的核心。而GLP-I正可以促進(jìn) 胰島β細(xì)胞分泌胰島素，保護(hù)和增強(qiáng)胰島素受體的敏感性，不會(huì)象單純注射胰島素或磺胺 類藥物那樣產(chǎn)生低血糖，是一種新型的多肽藥物，可以從根本上對(duì)2型糖尿病進(jìn)行治療。PEG修飾是一個(gè)使多肽或蛋白質(zhì)在治療或生物技術(shù)方面的效力得以提高的重要過(guò) 程。當(dāng)PEG以適當(dāng)?shù)姆绞竭B接在蛋白質(zhì)或多肽上時(shí)，它能改變?cè)S多的特征.而主要的生物 活性功能，如酶活性或特異結(jié)合位點(diǎn)，可以保留下來(lái)。PEG修飾通過(guò)如下幾種途徑改善藥物 的性能。首先，PEG連接在蛋白質(zhì)或多肽的表面上，提高了它的分子大小，并且它還能攜帶 大量的水分子，一種PEG-蛋白質(zhì)因而增大了 5 10倍。其次，PEG修飾使得以前不溶的蛋 白質(zhì)不僅容易溶解，而且具有高度移動(dòng)性。此外，PEG修飾可以減少腎臟對(duì)藥物的濾過(guò)作用， 降低它的致熱原性，還可以減少蛋白酶對(duì)其的消解，通過(guò)保護(hù)分子免受人體免疫系統(tǒng)的攻 擊來(lái)改善了它的輸送。同時(shí)，因?yàn)樗颖芰巳梭w防御機(jī)構(gòu)，因而在作用部位停留的時(shí)間就長(zhǎng) 得多，并使局部藥物濃度增高。PEG修飾GLP-I的意義GLP-1是一種30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽 類激素。通常情況下，這種長(zhǎng)度的肽類激素口服無(wú)效，需要注射或其他適合肽類藥物的給藥 方式(如，肺部或頰內(nèi)給藥)與胰高血糖素相似，GLP-I易形成原纖維，因此十分難溶于水。 最近有許多文獻(xiàn)報(bào)道GLP-I難于形成混合物，難于形成藥物。GLP-I的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)更加大了 這一難題。二肽酶IV迅速降解GLP-1，其產(chǎn)物不僅沒(méi)有活性，還可以充當(dāng)GLP-I受體的拮 抗劑，產(chǎn)生相反的作用。同時(shí)，腎小球?qū)LP-I的濾過(guò)十分迅速。由于以上原因，GLP-I在 人體中的半衰期十分短，靜脈注射只有1. 5分鐘，皮下注射有1. 5小時(shí)，都不適合用作藥物。 針對(duì)以上不足，對(duì)GLP-I的修飾成為了研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是GLP-I的PEG化修飾。本發(fā)明要解 決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是采用一步切割的辦法獲得GLP-I單體蛋白。


圖1是GLP-I融合蛋白及DTT切割后的SDS-PAGE圖現(xiàn)在詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。其特征在于，具體操作步驟如下具體實(shí)施方法下面通過(guò)具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳述本發(fā)明。一下實(shí)施例中所用mPEG、化學(xué)試劑等， 以及未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按常規(guī)或商品供應(yīng)商所建議的條件進(jìn)行。第一步PCR獲得GLP-I基因，將GLP-I基因克隆入PTYBll載體中，將載體 PTYBl 1-GLP-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566感受態(tài)，誘導(dǎo)并實(shí)現(xiàn)可溶性融合表達(dá)，目的蛋白占菌體 總蛋白的80%，獲得GLP-I與幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域-內(nèi)含肽-GLP-I融合蛋白。第二步在純化柱中裝入幾丁質(zhì)珠，利用GE公司的AKTA系統(tǒng)將誘導(dǎo)表達(dá)后的上清 以lml/min的速度過(guò)柱，利用幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑷诤系鞍讙煸谥由?。第三部加入DTT，并在4°C條件下作用24小時(shí)，這時(shí)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域-內(nèi)含肽 會(huì)與GLP-I分離，以lml/min的速度流加洗脫液將GLP-I洗脫下來(lái)。獲得沒(méi)有任何多余氨 基酸殘基的基因重組GLP-I純品。第四步將1份重量的人胰高血糖素樣肽-1(7-37) NH2溶解于500份重量的 IOOmM, PH7. 4磷酸鹽緩沖液中，再與500份重量的200mM，PH6. 0-9. 0磷酸鹽緩沖液或硼 酸-硼砂緩沖液混合；第五步向第一步的溶液中加入1. 5-119. 0份重量的含經(jīng)琥珀酰亞胺活化的活性 基團(tuán)的單甲氧基聚乙二醇，混合均勻，所述的單甲氧基聚乙二醇是分子量為5-40KD的單甲 氧基聚乙二醇_丙酸琥珀酰亞胺。第六部將第二步的溶液置于4_40°C進(jìn)行PEG修飾反應(yīng)0. 5-24小時(shí)；第七步將經(jīng)第三步處理的溶液置于-20°C終止反應(yīng)，至此，制得人胰高血糖素樣 肽-1的復(fù)合物粗品溶液；第八步取經(jīng)第四步制得的粗品溶液用20mM，pH4. 2的醋酸-醋酸鹽緩沖液稀釋 10倍，上S印harose FF CM層析柱，用含0-1M NaCL的20mM，pH4. 2醋酸-醋酸鹽緩沖液進(jìn) 行梯度洗脫，流速為0. 1-lml/min，在波長(zhǎng)為280nm處收集3個(gè)洗脫峰中的中間一個(gè)吸收峰 的洗脫溶液；第九步將第五步收集到的洗脫溶液用截留分子量為1-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超濾管濃縮，冷凍干燥，得到0. 2-3. 9份重量的產(chǎn)物，即人胰高血糖素樣肽_1的復(fù) 合物純品。
權(quán)利要求
一種胰高血糖素樣肽(7 37)的制備方法，利用PTYB11載體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)一步剪切及純化，得到?jīng)]有任何多余氨基酸殘基的胰高血糖素樣肽(7 37)。其特點(diǎn)在于，方法簡(jiǎn)便，既利用融合蛋白實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)又能夠利用一種獨(dú)特的純化及洗脫方式實(shí)現(xiàn)一步剪切及純化。
2.一種人胰高血糖素樣肽-1的復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物由人胰高血糖素樣 肽-1與單甲氧基聚乙二醇組成，該復(fù)合物中的人胰高血糖素樣肽-1指人胰高血糖素樣 肽-1(7-37)NH2，該復(fù)合物中的聚乙二醇為經(jīng)琥珀酰亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇。所述的 經(jīng)活化的單甲氧基聚乙二醇分子量為5-40KD，該復(fù)合物是通過(guò)人胰高血糖素樣肽-1中的N 端氨基和單甲氨基聚乙二醇的琥珀酰亞胺酯鍵形成的酰胺鍵連接在一起的單點(diǎn)修飾產(chǎn)物。
3.權(quán)利要求1所述的人胰高血糖素樣肽-1的制備方法，其特征在于，具體操作步驟如下第一步將GLP-I基因克隆入PTYBll載體中，將載體PTYB11-GLP-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ER2566感受態(tài)，誘導(dǎo)并實(shí)現(xiàn)可溶性融合表達(dá)，目的蛋白占菌體總蛋白的80%，獲得GLP-I與 幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域-內(nèi)含肽-GLP-I融合蛋白。第二步在純化柱中裝入幾丁質(zhì)珠，利用GE公司的AKTA系統(tǒng)將誘導(dǎo)表達(dá)后的上清以 lml/min的速度過(guò)柱，利用幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑷诤系鞍讙煸谥由?。第三部加入DTT，并在4°C條件下作用24小時(shí)，這時(shí)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域-內(nèi)含肽會(huì)與 GLP-I分離，以lml/min的速度流加洗脫液將GLP-I洗脫下來(lái)。獲得沒(méi)有任何多余氨基酸殘 基的基因重組GLP-I純品。
4.權(quán)利要求2所述的人胰高血糖素樣肽-1的制備方法，其特征在于，具體操作步驟如下第一步將1份重量的人胰高血糖素樣肽-1 (7-37)NH2溶解于500份重量的IOOmM, PH7. 4磷酸鹽緩沖液中，再與500份重量的200mM，PH6. 0-9. 0磷酸鹽緩沖液或硼酸-硼砂 緩沖液混合；第二步向第一步的溶液中加入1. 5-119. 0份重量的含經(jīng)琥珀酰亞胺活化的活性基團(tuán) 的單甲氧基聚乙二醇，混合均勻，所述的單甲氧基聚乙二醇是分子量為5-40KD的單甲氧基 聚乙二醇-丙酸琥珀酰亞胺。第三部將第二步的溶液置于4-40°C進(jìn)行PEG修飾反應(yīng)0. 5-24小時(shí)；第四步將經(jīng)第三步處理的溶液置于_20°C終止反應(yīng)，至此，制得人胰高血糖素樣肽-1 的復(fù)合物粗品溶液；第五步取經(jīng)第四步制得的粗品溶液用20mM，pH4. 2的醋酸-醋酸鹽緩沖液稀釋10倍， 上S印harose FF CM層析柱，用含0-1M NaCL的20mM，pH4. 2醋酸-醋酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度 洗脫，流速為0. 1-lml/min，在波長(zhǎng)為280nm處收集3個(gè)洗脫峰中的中間一個(gè)吸收峰的洗脫 溶液；第六步將第五步收集到的洗脫溶液用截留分子量為1-5KD的Millipore AmiconUltra-15超濾管濃縮，冷凍干燥，得到0. 2-3. 9份重量的產(chǎn)物，即人胰高血糖素樣 肽-1的復(fù)合物純品。
全文摘要
一種人胰高血糖素樣肽-1的復(fù)合物及其制備方法，屬肽或蛋白質(zhì)的修飾復(fù)合物及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。該復(fù)合物中的人胰高血糖素樣肽-1指人胰高血糖素樣肽-1(7-36)NH2，該復(fù)合物由人胰高血糖素樣肽-1和經(jīng)琥珀酰亞胺活化的活性集團(tuán)的單甲氧氨基聚乙二醇組成，兩著通過(guò)前者的氨基酸游離氨基和后者的琥珀酰亞胺酯鍵形成的酰胺鍵連接在一起。將人胰高血糖素樣肽-1與含經(jīng)琥珀酰亞胺活化的活性基團(tuán)的單甲氧基聚乙二醇進(jìn)行mPEG修飾反應(yīng)，兩者連接成人胰高血糖素-1的復(fù)合物，即mPEG-GLP-1。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便，原料易得。本發(fā)明的方法制備的產(chǎn)物，人胰高血糖素樣肽-1生物穩(wěn)定性高，體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，生物利用度高。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101962652SQ20091008953
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者唐先兵, 王青青 申請(qǐng)人:揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司