專利名稱：基于pH的反饋補(bǔ)料生產(chǎn)賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸的方法，具體地說(shuō)涉及一種基于PH的反饋控制補(bǔ) 加碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-賴氨酸(以下簡(jiǎn)稱賴氨酸)是八種人體必需氨基酸中最重要的一種，它對(duì)調(diào)節(jié) 生物體內(nèi)代謝平衡，提高生物對(duì)谷類蛋白質(zhì)的吸收，改善人類膳食營(yíng)養(yǎng)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)生 長(zhǎng)發(fā)育均有重要作用。賴氨酸被廣泛用作動(dòng)物飼料添加劑、食品添加劑、藥品等。2006年全 球賴氨酸的消費(fèi)量達(dá)到85萬(wàn)噸，其中90%的賴氨酸用作飼料添加劑，約5%用作食品添加 劑，5%用作醫(yī)藥中間體。賴氨酸的工業(yè)生產(chǎn)始于1958年，日本木下祝郎、中山清等采用紫外線照射谷氨酸 棒桿菌得到了一株?duì)I養(yǎng)缺陷型突變株，其L-賴氨酸生成量達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)水平。目前，微生 物發(fā)酵法已成為生產(chǎn)賴氨酸的主要方法，工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模逐年擴(kuò)大。近年來(lái)，隨著原材料價(jià)格 的上漲和市場(chǎng)的激烈競(jìng)爭(zhēng)，為了提高賴氨酸產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本，仍有大量關(guān)于賴氨酸發(fā) 酵方面的研究報(bào)道，主要集中在選育高產(chǎn)賴氨酸菌株、改進(jìn)發(fā)酵工藝和開發(fā)新資源等方面。賴氨酸產(chǎn)生菌屬于具有多重遺傳標(biāo)記的突變株，能在胞外大量積累賴氨酸是由于 菌體的代謝調(diào)節(jié)處于異常狀態(tài)，對(duì)環(huán)境條件非常敏感。發(fā)酵條件如碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、PH及 溶解氧等對(duì)賴氨酸的合成有重要影響。其中，底物(葡萄糖)濃度是影響菌體代謝的一個(gè) 重要參數(shù)，它主要通過(guò)控制相關(guān)酶的合成或活性影響菌體的代謝途徑，通常稱作葡萄糖效 應(yīng)(俞俊棠，《新編生物工藝學(xué)》，化學(xué)工業(yè)出版社，2003年，110頁(yè))。葡萄糖可通過(guò)“葡萄 糖效應(yīng)”阻遏、抑制多種酶的合成，如氨基酸合成酶等，這種阻遏作用主要是其分解代謝物 引起的。在以葡萄糖為碳源的賴氨酸發(fā)酵中，葡萄糖的分解代謝物阻遏會(huì)引起多種副產(chǎn)物 如丙氨酸等的積累，從而影響糖對(duì)賴氨酸的轉(zhuǎn)化率(張克旭，《代謝控制發(fā)酵》，中國(guó)輕工業(yè) 出版社，1998年，299頁(yè))。目前，賴氨酸發(fā)酵主要采用的是批式發(fā)酵模式。在菌體生長(zhǎng)階段需要提供一定 濃度的葡萄糖以獲得足夠濃度的菌體，而在菌體產(chǎn)酸階段需要維持較低的葡萄糖濃度，這 樣能夠激活賴氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，從而強(qiáng)化二氧化碳固定反 應(yīng)，提高賴氨酸產(chǎn)率。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)酵模式，在賴氨酸的生產(chǎn)過(guò)程中一般采用補(bǔ)料的方 法，但是現(xiàn)有的補(bǔ)料方法主要是按照預(yù)定程序流加，屬于無(wú)反饋的流加，雖然操作比較簡(jiǎn) 單，但是不能真實(shí)反映發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度的變化；或者靠人工定時(shí)取樣分析再調(diào)整流 加速率，糖濃度的控制滯后，導(dǎo)致葡萄糖濃度波動(dòng)大。另外，由于在線測(cè)定葡萄糖濃度有困 難，所以目前無(wú)法實(shí)現(xiàn)在線測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的濃度并及時(shí)反饋控制。因此在賴氨酸發(fā) 酵生產(chǎn)過(guò)程中，其補(bǔ)料具有盲目性，發(fā)酵生產(chǎn)的重復(fù)性也較差。在賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，準(zhǔn)確控制及時(shí)補(bǔ)加氮源也是十分重要的。在賴氨酸發(fā) 酵生產(chǎn)的不同階段，菌體內(nèi)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的二氧化碳固定反應(yīng)與丙酮酸 激酶催化生成丙酮酸的途徑的分配系數(shù)直接影響賴氨酸的得率。由于發(fā)酵液中銨根和硫酸根的存在能夠激活賴氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶(文獻(xiàn)Agric. Biol. Chem.， 1979，43 (12)，P. 2480)，有利于解除天冬氨酸對(duì)于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制，增 加二氧化碳固定反應(yīng)的代謝流量，從而達(dá)到強(qiáng)化賴氨酸合成途徑的效果，所以發(fā)酵液中的 硫酸銨濃度與上述的分配系數(shù)直接有關(guān)，維持適宜的硫酸銨濃度是調(diào)節(jié)上述兩個(gè)途徑分配 系數(shù)的關(guān)鍵。因此在賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中還需要流加氮源硫酸銨和氨，既維持了適宜的PH 值，又能夠提高賴氨酸的產(chǎn)量。在賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中目前普遍采用的是按照預(yù)定程序或 人工定時(shí)取樣分析后流加硫酸銨，用發(fā)酵液的PH值作為反饋信號(hào)控制氨的流加。這種方式 導(dǎo)致硫酸銨濃度(相當(dāng)于銨離子摩爾濃度的二分之一，在發(fā)酵的PH下，發(fā)酵液中氨的存在 形態(tài)主要是銨離子)的控制也不精確并且重復(fù)性差，影響賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有的賴氨酸生產(chǎn)方法在補(bǔ)料時(shí)具有盲目性，影響生 產(chǎn)控制，使得發(fā)酵產(chǎn)量低的缺陷。提供一種通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵液中的PH變化，利用pH值反饋控 制補(bǔ)料，維持一定的葡萄糖濃度和/或維持一定的硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比，從而簡(jiǎn)化 生產(chǎn)工藝，在不增加額外設(shè)備的情況下使賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量大幅度提高的PH反饋補(bǔ)料生 產(chǎn)賴氨酸的方法。本發(fā)明的目的之二在于上述維持一定葡萄糖濃度和/或維持一定的硫酸銨與賴 氨酸摩爾濃度比的基礎(chǔ)上，提出了分段控制賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的方法，進(jìn)一步促進(jìn)賴氨酸的 發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的基于pH的反饋補(bǔ)料生產(chǎn)賴氨酸的方法，包括使用常規(guī)方法制備生 產(chǎn)賴氨酸的種液，然后進(jìn)行賴氨酸好氧發(fā)酵；本發(fā)明是在賴氨酸好氧發(fā)酵進(jìn)行過(guò)程中，按照 賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之間的比例關(guān)系(該比例關(guān)系可以 由本領(lǐng)域技術(shù)人員針對(duì)不同的發(fā)酵菌種自行測(cè)定得到)，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通過(guò) 向發(fā)酵液中流加該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)， 使之既不產(chǎn)生葡萄糖抑制，也不構(gòu)成限制，達(dá)到維持一定的葡萄糖濃度，從而提高賴氨酸發(fā) 酵產(chǎn)量的目的。此時(shí)硫酸銨的流加可采用常規(guī)方法；或，在賴氨酸好氧發(fā)酵進(jìn)行過(guò)程中，按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中所需的硫酸銨添 加速率(由賴氨酸合成速率乘以擬維持的發(fā)酵液中的硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比得到)和 氨消耗速率之間的比例關(guān)系(該比例關(guān)系可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員針對(duì)不同的發(fā)酵菌種自 行測(cè)定得到)，配制硫酸銨和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液 的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，使之既不產(chǎn)生硫酸銨抑制，也不構(gòu)成限制， 達(dá)到維持一定的硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸摩爾濃度比，從而提高賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的目的。此 時(shí)葡萄糖的流加可采用常規(guī)方法；或，在賴氨酸好氧發(fā)酵進(jìn)行過(guò)程中，按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗速率、 所需的硫酸銨添加速率(由賴氨酸合成速率乘以擬維持的發(fā)酵液中的硫酸銨與賴氨酸摩 爾濃度比得到)和氨消耗速率之間的比例關(guān)系(該比例關(guān)系可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員針對(duì)不 同的發(fā)酵菌種自行測(cè)定得到)，配制葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加 該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，使之既不產(chǎn)生葡萄糖抑制和硫酸銨抑制，也不構(gòu)成限制，達(dá)到維持發(fā)酵液中一定的葡萄糖濃度和維持一定 的硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸摩爾濃度比，從而提高賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的目的；或，將上述3種控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)的技術(shù) 方案聯(lián)合使用，來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)。本發(fā)明的基于pH的反饋補(bǔ)料生產(chǎn)賴氨酸的方法具體包括以下步驟(1)按常規(guī)方法制備生產(chǎn)賴氨酸的種液配制生產(chǎn)賴氨酸的種子培養(yǎng)基，按常規(guī) 方法滅菌；將生產(chǎn)賴氨酸的菌種接入生產(chǎn)賴氨酸的種子培養(yǎng)基中；在適宜的溫度下?lián)u床培 養(yǎng)至對(duì)數(shù)期得到生產(chǎn)賴氨酸的種液；(2)好氧發(fā)酵將步驟(1)制得的生產(chǎn)賴氨酸的種液接入經(jīng)常規(guī)方法滅菌的生產(chǎn) 賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到發(fā)酵液，其中生產(chǎn)賴氨酸的種液的接種量為生產(chǎn)賴氨酸的發(fā) 酵培養(yǎng)基質(zhì)量的8% 18%，發(fā)酵液中的初始葡萄糖濃度為40克/升 180克/升；在好 氧發(fā)酵的過(guò)程中控制發(fā)酵液的溫度為30°C 34°C，利用pH的反饋來(lái)控制發(fā)酵液的pH在
6.5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；通過(guò)在好氧發(fā)酵過(guò)程中調(diào)節(jié)向發(fā)酵液中通入的空 氣量及調(diào)節(jié)對(duì)發(fā)酵液的攪拌轉(zhuǎn)速，使得發(fā)酵液中的溶解氧保持在 20%飽和度。所述的控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)是(1)按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之間的比例關(guān)系， 配制葡萄糖和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的PH在6. 5
7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；或(2)按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中所需的硫酸銨添加速率和氨消耗速率之間的比例 關(guān)系，配制硫酸銨和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的PH在 6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；或(3)按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸銨添加速率和氨消 耗速率之間的比例關(guān)系，配制葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合 溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；或(4)將上述(1)、(2)和(3)所述的3種控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任 意一個(gè)值附近波動(dòng)的技術(shù)方案聯(lián)合使用，來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè) 值附近波動(dòng)。在好氧發(fā)酵開始進(jìn)行時(shí)所加的流加液是氨水或液氨。采用常規(guī)的手動(dòng)或自動(dòng)的pH 控制方法，通過(guò)向發(fā)酵液中流加氨水或液氨，來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意 一個(gè)值；此時(shí)，發(fā)酵液中葡萄糖的濃度、發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比在持 續(xù)降低。此后，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度降低到預(yù)先設(shè)定點(diǎn)時(shí)，將流加液換成葡萄糖和氨的混合 溶液，采用常規(guī)的手動(dòng)或自動(dòng)的PH控制方法，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液，來(lái)控制發(fā) 酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，從而間接維持了發(fā)酵液中葡萄糖的濃 度在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)；在發(fā)酵結(jié)束前1 2小時(shí)，將流加液改為氨水或液氨。采用常 規(guī)的手動(dòng)或自動(dòng)的PH控制方法，通過(guò)向發(fā)酵液中流加氨水或液氨，來(lái)控制發(fā)酵液的pH在 6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃度，發(fā)酵結(jié)束；或當(dāng)發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預(yù)先設(shè)定的發(fā)酵液中硫 酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)時(shí)，將流加液換成硫酸銨和氨的混合溶液，采用常規(guī)的手動(dòng)或自動(dòng)的PH控制方法，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液，來(lái)控制發(fā)酵 液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，從而間接維持了發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生 的賴氨酸的摩爾濃度比在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)；在發(fā)酵結(jié)束前1 2小時(shí)，將流加液改為 氨水或液氨。采用常規(guī)的手動(dòng)或自動(dòng)的PH控制方法，通過(guò)向發(fā)酵液中流加氨水或液氨，來(lái) 控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃 度，發(fā)酵結(jié)束；或當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度降低到預(yù)先設(shè)定的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度的預(yù)先設(shè)定 點(diǎn)，并且，發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預(yù)先設(shè)定的發(fā)酵液中硫酸 銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)時(shí)，將流加液換成葡萄糖、硫酸銨和氨的混 合溶液，采用常規(guī)的手動(dòng)或自動(dòng)的PH控制方法，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液，來(lái)控制 發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，從而間接維持了發(fā)酵液中葡萄糖的 濃度在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)，并且，發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比在預(yù)先 設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)；在發(fā)酵結(jié)束前1 2小時(shí)，將流加液改為氨水或液氨。采用常規(guī)的手動(dòng)或 自動(dòng)的PH控制方法，通過(guò)向發(fā)酵液中流加氨水或液氨，來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之 間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃度，發(fā)酵結(jié)束。所述的葡萄糖和氨的混合溶液中葡萄糖與氨的質(zhì)量濃度比為8 1 15 1之 間的任意一個(gè)值，葡萄糖的濃度為400克/升 600克/升；所述的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度 降低到預(yù)先設(shè)定點(diǎn)，其預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為葡萄糖的濃度為5克/升 20克/升之間的任意一個(gè) 值。所述的硫酸銨和氨的混合溶液中硫酸銨與氨的質(zhì)量濃度比為2 1 4 1之間 的任意一個(gè)值，硫酸銨的濃度為100克/升 200克/升；所述的發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的 賴氨酸的摩爾濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為12 14之間的任意一個(gè)值。所述的葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液中，葡萄糖硫酸銨氨的質(zhì)量濃度比為 8 15 2 4 1，葡萄糖的濃度為400克/升 600克/升；所述的發(fā)酵液中葡萄糖的 濃度的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為5克/升 20克/升之間的任意一個(gè)值，所述的發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn) 生的賴氨酸的摩爾濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為12 14之間的任意一個(gè)值。本發(fā)明中pH值的反饋控制可通過(guò)市售的pH電極(傳感器)、儀表和執(zhí)行機(jī)構(gòu)完 成，或由人工完成。本發(fā)明中所述的生產(chǎn)賴氨酸的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，本領(lǐng)域人員可根據(jù)現(xiàn)有 技術(shù)，按照生產(chǎn)賴氨酸時(shí)各種不同菌種所需種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，采用常規(guī)培養(yǎng)基配 方進(jìn)行配制。本發(fā)明的方法對(duì)于這些種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均適用。所述的菌種可以是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)或鈍齒棒 Iflif (Corynebacterium crenatum)等。所述的谷氨酸棒桿菌可以是谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709、谷氨酸棒桿菌DSM 5714、谷氨酸棒桿菌DSM 12866、谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5101、中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程 研究所的谷氨酸棒桿菌TK26、天津科技大學(xué)的谷氨酸棒桿菌TK12或上海工業(yè)微生物研究 所的谷氨酸棒桿菌ΠΠ28等。所述的黃色短桿菌可以是黃色短桿菌FERM-P 1708、黃色短桿菌FERM-P6463、黃色短桿菌FERM-P 6464、江南大學(xué)的黃色短桿菌XQ-8、江南大學(xué)的黃色短桿菌WSH-L 1或江 南大學(xué)的黃色短桿菌FB42等。所述的乳糖發(fā)酵短桿菌可以是乳糖發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712或江南大學(xué)的乳糖 發(fā)酵短桿菌AL039等。所述的鈍齒棒桿菌可以是沈陽(yáng)藥科大學(xué)的鈍齒棒桿菌D6ch95等。本發(fā)明提供的基于pH的反饋補(bǔ)料生產(chǎn)賴氨酸的方法，是基于這樣的構(gòu)思在賴氨 酸好氧發(fā)酵過(guò)程中，需要補(bǔ)加氨水或液氨，在調(diào)節(jié)PH的同時(shí)，氨能夠提供菌體生長(zhǎng)和賴氨 酸合成所需的氮源。由于好氧發(fā)酵過(guò)程的氨消耗速率與葡萄糖消耗速率存在一定的比例關(guān) 系，可以考慮補(bǔ)加氨水或液氨調(diào)節(jié)PH的同時(shí)補(bǔ)加葡萄糖，利用pH來(lái)控制葡萄糖的流加速率 從而間接維持發(fā)酵液中葡萄糖的濃度一定；另一方面，賴氨酸合成速率與氨消耗速率之間 存在比例關(guān)系，由此可計(jì)算得到為了維持一定的發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃 度比所需的硫酸銨添加速率。本發(fā)明根據(jù)葡萄糖消耗速率、所需的硫酸銨添加速率和氨消 耗速率的關(guān)系，將葡萄糖、硫酸銨和氨按此關(guān)系配制在同一溶液中，用該混合溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵 液的PH值。在向發(fā)酵液中流加該混合溶液以調(diào)節(jié)pH的過(guò)程中，通過(guò)將pH控制在很窄的范 圍內(nèi)，使得加入的氨(按當(dāng)量計(jì))與合成賴氨酸消耗的氨量相等，所以流加該混合溶液控制 PH的同時(shí)，隨同氨加入發(fā)酵液中的葡萄糖量正好補(bǔ)充了消耗的葡萄糖量，和/或隨同氨加 入發(fā)酵液的硫酸銨與合成的賴氨酸成一定比例。因而，只要將PH控制在很窄的范圍內(nèi)，就 可以保證發(fā)酵液中葡萄糖的濃度和/或發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比只 在很窄的范圍內(nèi)波動(dòng)。這樣的方法可以在不改變生產(chǎn)設(shè)備的情況下，僅在補(bǔ)料罐中加入葡 萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，就能夠通過(guò)PH信號(hào)的反饋來(lái)間接控制葡萄糖和/或硫酸銨 的補(bǔ)加，即，在控制發(fā)酵液的PH的同時(shí)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中葡萄糖濃度和/或發(fā)酵液中硫酸銨與 產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比的控制。而PH的控制是很成熟的技術(shù)，可以很方便地使用市售 的PH電極(傳感器)、控制儀表和執(zhí)行機(jī)構(gòu)來(lái)完成，也可以人工控制。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的基于pH的反饋補(bǔ)料生產(chǎn)賴氨酸的方法的優(yōu)點(diǎn)在 于通過(guò)利用PH信號(hào)反饋控制葡萄糖和/或硫酸銨的補(bǔ)加，從而間接控制了發(fā)酵液中葡萄 糖的濃度和/或發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比，達(dá)到較準(zhǔn)確的控制葡萄糖 濃度和/或發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比的目的，并且可以提高目的產(chǎn)物 賴氨酸的產(chǎn)量。在發(fā)酵過(guò)程中不需要增加額外設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1使用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) DSM 12866 進(jìn)行 pH 反饋控制 補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，所用培養(yǎng)基如下1)種子培養(yǎng)基(g/L)蔗糖 25.0，玉米漿 30. OmL，(NH4)2SO4 2.0，乙酸銨 6.0， MgSO4 ·7Η20 0. 4，KH2PO4 · 3H2O 1. 0，L-丙氨酸 0. 35，味精 0. 1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 01 ,MnSO4 · H2O 0. 01，生物素50 μ g，菸酰胺5mg，硫胺素0. 2mg, ρΗ7· O 7· 2，0· 075MPa壓力滅菌15分鐘。2)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 50. 0，玉米漿 40. OmL, (NH4) 2S0425. 0，KH2PO4 · 3H20 3. 0，MgSO4 · 7H20 1. 5，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 015，MnSO4 · H2O 0· 015，生物素 0. 8mg,菸酰胺 0. 8mg,硫胺素0. 45mg, ρΗ7· 0 7· 2,0. 075MPa壓力滅菌15分鐘。從生長(zhǎng)良好的活化斜面刮一滿環(huán)菌苔轉(zhuǎn)入裝有30mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶 中，9層紗布封口，31. 5°C、200rpm搖床培養(yǎng)22小時(shí)，按8%的接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng) 基的5升自動(dòng)控制發(fā)酵罐Biotech-2002 (上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中，發(fā)酵罐帶 有溫度、PH、溶解氧自動(dòng)控制功能。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵溫度控制在31. 5°C，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧在5 10%飽和度之間。開始階段通過(guò)pH反饋用蠕動(dòng)泵自動(dòng)流 加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 5 6. 6。發(fā)酵8小時(shí)， 發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度降至20克/升，停止流加質(zhì)量濃度為25%的氨水，開始向發(fā)酵液 中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 5 6. 6，流加的混 合溶液中葡萄糖濃度為500克/升，氨濃度為50克/升。發(fā)酵12小時(shí)，發(fā)酵液中硫酸銨濃 度降至10克/升，開始采用恒速補(bǔ)料的方式流加硫酸銨溶液，流加速率為8mL/h，流加的硫 酸銨溶液濃度為500克/升，在27小時(shí)停止流加硫酸銨。在28小時(shí)停止流加葡萄糖和氨 的混合溶液，改為流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 5 6. 6，直至30小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中pH始終維持在6. 5 6. 6 ；在流加葡萄糖和氨的混合溶液期間發(fā)酵液 中葡萄糖濃度維持在18. 5克/升 21. 5克/升。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度為 5克/升，總葡萄糖糖消耗180克/升，賴氨酸產(chǎn)量為66. 1克/升，對(duì)葡萄糖得率為36. 7%。 與不補(bǔ)料的分批發(fā)酵(初始葡萄糖濃度為180克/升，賴氨酸產(chǎn)量53. 9克/升，發(fā)酵40小 時(shí))相比，產(chǎn)量提高了 23%，發(fā)酵周期縮短了 25%。實(shí)施例2其它發(fā)酵條件同實(shí)施例1。其中菌種采用黃色短桿菌(Brevibacterium flavum) FERM-P 1708，接種量為10%，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為60克/升，初始硫酸銨濃度 為22克/升，發(fā)酵溫度為30°C。開始階段通過(guò)pH反饋用蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25% 的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為7. 4 7. 5。發(fā)酵9小時(shí)，發(fā)酵液中殘余葡萄糖 濃度降至10克/升，開始采用恒速補(bǔ)料的方式流加葡萄糖溶液，流加速率為30mL/h，流加的 葡萄糖溶液濃度為600克/升，此時(shí)仍然在流加質(zhì)量濃度為25%的氨水。發(fā)酵13小時(shí)，發(fā) 酵液中硫酸銨濃度降至5克/升，賴氨酸濃度升至15克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比 是1 2.8，停止流加質(zhì)量濃度為25%的氨水，開始向發(fā)酵液中流加硫酸銨和氨的混合溶液 控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為7. 4 7. 5，流加的混合溶液中硫酸銨濃度為200克/ 升，氨濃度為100克/升。在29小時(shí)停止流加葡萄糖溶液以及硫酸銨和氨的混合溶液，改 為流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為7.4 7. 5，直至30小 時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中pH始終維持在7. 4 7. 5 ；在流加硫酸銨和氨的混合溶液期間發(fā)酵液 中硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 2.8 1 3. 2之間。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中殘 余葡萄糖濃度為3克/升，總葡萄糖糖消耗180克/升，賴氨酸產(chǎn)量為67. 5克/升，對(duì)葡萄 糖得率為37.5%。與不補(bǔ)料的分批發(fā)酵(初始葡萄糖濃度為180克/升，賴氨酸產(chǎn)量53. 9 克/升，發(fā)酵40小時(shí))相比，產(chǎn)量提高了 25%，發(fā)酵周期縮短了 25%。實(shí)施例3其它發(fā)酵條件同實(shí)施例1。其中菌種采用谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5101，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為40克/升，初始硫酸銨濃度為10克/升，發(fā)酵溫度為34°C。 開始階段通過(guò)PH反饋用蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制 范圍設(shè)定為6. 95 7. 05。發(fā)酵6小時(shí)，發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度降至15克/升，硫酸銨濃 度降至3克/升，賴氨酸濃度升至6克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比是1 1.8，停止 流加質(zhì)量濃度為25%的氨水，開始向發(fā)酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液控制發(fā) 酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為400克/升， 硫酸銨濃度為200克/升，氨濃度為50克/升。在28小時(shí)停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的 混合溶液，改為流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，直至30小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中pH始終維持在6. 95 7. 05 ；在流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液 期間，發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度維持在13. 5克/升 16. 5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃 度比維持在1 1.8 1 2.2。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度為2克/升，總葡 萄糖糖消耗180克/升，賴氨酸產(chǎn)量為66. 5克/升，對(duì)葡萄糖得率為36. 9%。與不補(bǔ)料的 分批發(fā)酵(初始葡萄糖濃度為180克/升，賴氨酸產(chǎn)量53.9克/升，發(fā)酵40小時(shí))相比， 產(chǎn)量提高了 23. 4%，發(fā)酵周期縮短了 25%。實(shí)施例4其它發(fā)酵條件同實(shí)施例1。其中采用的菌種為江南大學(xué)的乳糖發(fā)酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum) AL039，接種量為18 %，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度 為90克/升，初始硫酸銨濃度為35克/升。開始階段(第一階段)通過(guò)pH反饋用蠕動(dòng)泵 自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05。發(fā)酵8 小時(shí)，發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度降至5克/升，停止流加質(zhì)量濃度為25%的氨水，開始第二 階段，向發(fā)酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為600克/升，氨濃度為40克/升。發(fā)酵到20小時(shí)， 發(fā)酵液中硫酸銨濃度降到8克/升，賴氨酸濃度升至35克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度 比是1 3. 95，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，開始第三階段，向發(fā)酵液中流加葡萄糖、 硫酸銨和氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，流加的混合溶 液中葡萄糖濃度為600克/升，硫酸銨濃度為180克/升，氨濃度為60克/升。在64小時(shí) 停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改為流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的 pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，直至65小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖 濃度維持在3. 5克/升 6. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度維 持在3.5克/升 6.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 3.8 1 4. 2。發(fā) 酵結(jié)束時(shí)，殘余葡萄糖濃度為5克/升，總葡萄糖糖消耗272克/升，賴氨酸產(chǎn)量為109克 /升，對(duì)葡萄糖得率為40%。與葡萄糖、硫酸銨獨(dú)立補(bǔ)料的常規(guī)發(fā)酵方式(通過(guò)pH反饋用 蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25 %的氨水控制發(fā)酵液的pH ；當(dāng)殘余葡萄糖濃度在5克/升左 右、硫酸銨濃度在8克/升左右時(shí)開始流加，定時(shí)人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸 銨分8批加入。總葡萄糖糖消耗250克/升，賴氨酸產(chǎn)量95克/升，對(duì)葡萄糖得率為38% ) 相比，產(chǎn)量提高了 15%，對(duì)葡萄糖得率提高了 5%。實(shí)施例5
其它發(fā)酵條件同實(shí)施例1。其中采用的菌種為上海工業(yè)微生物研究所的谷氨酸 棒桿菌Π1128，接種量為8%，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為60克/升，初始硫酸銨濃度 為40克/升。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵溫度控制在32°C，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解 氧在1 5%飽和度之間。開始階段(第一階段)通過(guò)PH反饋用蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃 度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05。發(fā)酵到9小時(shí)，發(fā)酵 液中殘余葡萄糖濃度降至10克/升，停止流加質(zhì)量濃度為25%的氨水，開始第二階段，向 發(fā)酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05， 流加的混合溶液中葡萄糖濃度為500克/升，氨 濃度為38克/升。發(fā)酵到25小時(shí)，發(fā)酵液 中硫酸銨濃度降到15克/升，賴氨酸濃度升至49. 8克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比是 1 3，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，開始第三階段，向發(fā)酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和 氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄 糖濃度為500克/升，硫酸銨濃度為100克/升，氨濃度為50克/升。在64小時(shí)停止流加 葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改為流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控 制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，直至65小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄 糖濃度維持在8. 5克/升 10. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度 維持在8.5克/升 10.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 2.8 1 3.2。 發(fā)酵結(jié)束時(shí)，殘余葡萄糖濃度為5克/升，總葡萄糖糖消耗266克/升，賴氨酸產(chǎn)量為109 克/升，對(duì)葡萄糖得率為41%。與葡萄糖、硫酸銨獨(dú)立補(bǔ)料的常規(guī)發(fā)酵方式(通過(guò)pH反饋 用蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，當(dāng)殘余葡萄糖濃度在10克/ 升、硫酸銨濃度在15克/升時(shí)開始流加，定時(shí)人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸銨分 8批加入。總葡萄糖糖消耗250克/升，賴氨酸產(chǎn)量95克/升，對(duì)葡萄糖得率為38 % )相 比，產(chǎn)量提高了 15%，對(duì)葡萄糖得率提高了 8%。實(shí)施例6其它發(fā)酵條件同實(shí)施例1。其中采用的菌種為中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所的谷 氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) TK26，接種量為10%，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄 糖濃度為100克/升，初始硫酸銨濃度為35克/升，在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌 轉(zhuǎn)速控制溶解氧在10 15%飽和度之間。開始階段(第一階段)通過(guò)pH反饋用蠕動(dòng)泵 自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05。發(fā)酵 到15小時(shí)，發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度降至10克/升，停止流加質(zhì)量濃度為25%的氨水，開 始第二階段，向發(fā)酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為 6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為400克/升，氨濃度為27克/升。發(fā)酵到23 小時(shí)，發(fā)酵液中硫酸銨濃度降到20克/升，賴氨酸濃度升至44克/升，硫酸銨與賴氨酸摩 爾濃度比是1 2，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，開始第三階段，向發(fā)酵液中流加葡萄 糖、硫酸銨和氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，流加的混合 溶液中葡萄糖濃度為400克/升，硫酸銨濃度為120克/升，氨濃度為30克/升。在67小 時(shí)停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改為流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液 的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，直至68小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度維持在8. 5克/升 10. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度 維持在8.5克/升 10.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 1.8 1 2.2。 發(fā)酵結(jié)束時(shí)，殘余葡萄糖濃度為3克/升，總葡萄糖糖消耗300克/升，賴氨酸產(chǎn)量為135克 /升，對(duì)葡萄糖得率為45%。與葡萄糖、硫酸銨獨(dú)立補(bǔ)料的常規(guī)發(fā)酵方式(通過(guò)pH反饋用 蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，當(dāng)殘余葡萄糖濃度在10克/升、 硫酸銨濃度在20克/升時(shí)開始流加，定時(shí)人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸銨分10 批加入?？偲咸烟翘窍?02. 5克/升，賴氨酸產(chǎn)量121克/升，對(duì)葡萄糖得率為40% )相 比，產(chǎn)量提高了 11%，對(duì)葡萄糖得率提高了 1 2.5%。實(shí)施例7其它發(fā)酵條件同實(shí)施例1。其中采用的菌種為沈陽(yáng)藥科大學(xué)的鈍齒棒桿菌D6ch95, 接種量為10%，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為80克/升，初始硫酸銨濃度為42克/升， 在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧在15 20%飽和度之間。開始階 段(第一階段)通過(guò)PH反饋用蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH， PH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05。發(fā)酵到12小時(shí)，發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度降至10克/ 升，停止流加質(zhì)量濃度為25%的氨水，開始第二階段，向發(fā)酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶 液控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為500 克/升，氨濃度為36克/升。發(fā)酵到21小時(shí)，發(fā)酵液中硫酸銨濃度降到15克/升，賴氨酸 濃度升至49克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比是1 2. 95，停止流加葡萄糖和氨的混合 溶液，開始第三階段，向發(fā)酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液控制發(fā)酵液的pH，pH 控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為500克/升，硫酸銨濃度為 100克/升，氨濃度為45克/升。在67小時(shí)停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改 為流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，pH控制范圍設(shè)定為6. 95 7. 05，直至68 小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄 糖濃度維持在8. 5克/升 10. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度 維持在8.5克/升 10.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 2.8 1 3.2。 發(fā)酵結(jié)束時(shí)，殘余葡萄糖濃度為5克/升，總葡萄糖糖消耗290克/升，賴氨酸產(chǎn)量為145克 /升，對(duì)葡萄糖得率為50%。與葡萄糖、硫酸銨獨(dú)立補(bǔ)料的常規(guī)發(fā)酵方式(通過(guò)pH反饋用 蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制發(fā)酵液的pH，當(dāng)殘余葡萄糖濃度在10克/升、 硫酸銨濃度在15克/升時(shí)開始流加，定時(shí)人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸銨分10 批加入。總葡萄糖糖消耗298克/升，賴氨酸產(chǎn)量128克/升，對(duì)葡萄糖得率為43 % )相 比，產(chǎn)量提高了 14%，對(duì)葡萄糖得率提高了 16.3%。
權(quán)利要求
一種基于pH的反饋補(bǔ)料生產(chǎn)賴氨酸的方法，其特征是在賴氨酸好氧發(fā)酵進(jìn)行過(guò)程中，利用pH的反饋來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；所述的控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)是(1)按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之間的比例關(guān)系，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；或(2)按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中所需的硫酸銨添加速率和氨消耗速率之間的比例關(guān)系，配制硫酸銨和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；或(3)按照賴氨酸好氧發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸銨添加速率和氨消耗速率之間的比例關(guān)系，配制葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，通過(guò)向發(fā)酵液中流加該混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；或(4)將上述(1)、(2)和(3)所述的3種控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)的技術(shù)方案聯(lián)合使用，來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的向發(fā)酵液中流加葡萄糖和氨的混合 溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，是當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖的 濃度降低到預(yù)先設(shè)定點(diǎn)時(shí)，通過(guò)向發(fā)酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液，來(lái)控制發(fā)酵液的 pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，從而間接維持了發(fā)酵液中葡萄糖的濃度在預(yù) 先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的向發(fā)酵液中流加硫酸銨和氨的混合 溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，是當(dāng)發(fā)酵液中硫酸銨 與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預(yù)先設(shè)定的發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾 濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)時(shí)，向發(fā)酵液中流加硫酸銨和氨的混合溶液，來(lái)控制發(fā)酵液的PH在 6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，從而間接維持了發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸 的摩爾濃度比在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的向發(fā)酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨 的混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，是當(dāng)發(fā)酵液中葡 萄糖的濃度降低到預(yù)先設(shè)定的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)，并且，發(fā)酵液中硫酸 銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預(yù)先設(shè)定的發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩 爾濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)時(shí)，向發(fā)酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，來(lái)控制發(fā)酵液 的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，從而間接維持了發(fā)酵液中葡萄糖的濃度在 預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)，并且，發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比在預(yù)先設(shè)定點(diǎn) 附近波動(dòng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述的葡萄糖和氨的混合溶液中葡萄糖與 氨的質(zhì)量濃度比為8 1 15 1之間的任意一個(gè)值，葡萄糖的濃度為400克/升 600 克/升；所述的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度降低到預(yù)先設(shè)定點(diǎn)，其預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為葡萄糖的濃度 為5克/升 20克/升之間的任意一個(gè)值。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的硫酸銨和氨的混合溶液中硫酸銨與氨的質(zhì)量濃度比為2 1 4 1之間的任意一個(gè)值，硫酸銨的濃度為100克/升 200克 /升；所述的發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為1 2 1 4 之間的任意一個(gè)值。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液中， 葡萄糖硫酸銨氨的質(zhì)量濃度比為8 15 2 4 1，葡萄糖的濃度為400克/升 600克/升；所述的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為5克/升 20克/升之間的任 意一個(gè)值，所述的發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比的預(yù)先設(shè)定點(diǎn)為1 2 1 4之間的任意一個(gè)值。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是生產(chǎn)賴氨酸的菌種是谷氨酸棒桿菌、黃色短 桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌或鈍齒棒桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在賴氨酸好氧發(fā)酵開始進(jìn)行時(shí)向發(fā)酵液 中所加的流加液是氨水或液氨，通過(guò)向發(fā)酵液中流加氨水或液氨，來(lái)控制發(fā)酵液的PH在 6. 5 7. 5之間的任意一個(gè)值。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在賴氨酸好氧發(fā)酵結(jié)束前1 2小時(shí)，將 流加液改為氨水或液氨，通過(guò)向發(fā)酵液中流加氨水或液氨，來(lái)控制發(fā)酵液的PH在6. 5 7. 5 之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸，具體涉及基于pH的反饋控制補(bǔ)加碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的方法。在賴氨酸好氧發(fā)酵進(jìn)行過(guò)程中，利用pH的反饋來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；所述控制包括向發(fā)酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液、硫酸銨和氨的混合溶液、或葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液來(lái)控制發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個(gè)值附近波動(dòng)；從而分別間接維持了發(fā)酵液中葡萄糖的濃度在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)、間接維持了發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)、間接維持了發(fā)酵液中葡萄糖的濃度在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)，且發(fā)酵液中硫酸銨與產(chǎn)生的賴氨酸的摩爾濃度比在預(yù)先設(shè)定點(diǎn)附近波動(dòng)。
文檔編號(hào)C12P13/08GK101967501SQ20091008987
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者叢威, 劉輝, 張勇, 邢宇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所