專利名稱：應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸的方法
專利說(shuō)明本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生 物有機(jī)酸的方法。
背景技術(shù)：
用微生物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)品時(shí)遇到的一個(gè)難題是細(xì)胞代謝產(chǎn)物的反饋抑制， 其現(xiàn)象是在微生物細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程中，菌體以特定的底物為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)向細(xì)胞內(nèi) 或細(xì)胞外分泌代謝產(chǎn)物，某些細(xì)胞代謝產(chǎn)物的濃度達(dá)到一定范圍后，目標(biāo)產(chǎn)品不再增加，而 雜質(zhì)則大量增加，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)率無(wú)法提高，同時(shí)大量雜質(zhì)還會(huì)干擾后續(xù)的分離。如果采用過(guò) 程工程手段將反饋物質(zhì)及時(shí)從發(fā)酵罐中除去，就有可能解除反饋抑制，增加發(fā)酵產(chǎn)率，創(chuàng)造 巨大的經(jīng)濟(jì)效益。已有的研究表明，解除反饋抑制后，微生物細(xì)胞發(fā)酵的產(chǎn)率可以大幅度提 高，產(chǎn)量甚至可以增加50%以上甚至更多。從工程的角度解決反饋抑制現(xiàn)象，需要研究新型微生物細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程。目前微生 物細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程分為三種方式批次發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵。生產(chǎn)上多采用批次發(fā)酵 方式，一般都是一次性投料，一次性收獲產(chǎn)品。其中必然有反饋抑制存在。雖然已經(jīng)有人進(jìn) 行過(guò)連續(xù)發(fā)酵的研究，但由于生物反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如一些化學(xué)反應(yīng)迅速，加上連續(xù)發(fā)酵容易受 污染，產(chǎn)物濃度低、原料浪費(fèi)多，所以連續(xù)發(fā)酵難以被發(fā)酵工業(yè)接受。相比連續(xù)發(fā)酵方式，采用半連續(xù)發(fā)酵方式更具有前景。它不是像化工反應(yīng)那樣恒 定不斷地進(jìn)料和出料，而是在微生物細(xì)胞發(fā)酵到達(dá)一定階段后才進(jìn)行發(fā)酵罐(即生物反應(yīng) 器)的進(jìn)料和出料。目前半連續(xù)發(fā)酵大多數(shù)只是在間歇發(fā)酵一段時(shí)間后流加一些原料和前 體，而不移走產(chǎn)物。這種“半連續(xù)”發(fā)酵又稱為補(bǔ)料式發(fā)酵或流加式發(fā)酵，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于 抗生素等次生代謝產(chǎn)物的大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程，取得了十分顯著的成功，有的過(guò)程提高產(chǎn)量達(dá) 到幾倍以上。人們也探索了在流加原料的基礎(chǔ)上，移走一些產(chǎn)物，以達(dá)到真正半連續(xù)發(fā)酵，這對(duì) 減少反饋抑制最為有效，而流加補(bǔ)料常常是為了控制發(fā)酵罐中的代謝。盡管做了大量工作， 移走產(chǎn)物的嘗試并沒(méi)有流加原料那樣成功。存在的問(wèn)題是移走產(chǎn)物的操作必然產(chǎn)生對(duì)微生 物細(xì)胞和酶活性的影響，移走產(chǎn)物時(shí)也必須用到分離介質(zhì)，而分離介質(zhì)本身也可能產(chǎn)生對(duì) 微生物細(xì)胞發(fā)酵的影響；還有，分離產(chǎn)物的過(guò)程常常包含劇烈的物理化學(xué)變化，要保持在發(fā) 酵的溫和條件如常溫常壓，溫和的PH下實(shí)現(xiàn)分離產(chǎn)物是有難度的?；谝陨显颍苑磻?yīng)和分離相耦合的新型微生物細(xì)胞發(fā)酵工藝就成為國(guó)內(nèi)外研 究的熱點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研究了萃取發(fā)酵、膜反應(yīng)器發(fā)酵、離子交換吸附發(fā)酵等過(guò)程。 例如，中國(guó)和法國(guó)的學(xué)者分別研究了用超濾膜反應(yīng)器和萃取法解除丙酸抑制，實(shí)現(xiàn)了丙酸 與發(fā)酵液的分離。但添加仲胺和氫氧化鈉作為萃取劑和反萃取劑又使成本增加。盡管超濾 膜反應(yīng)器法結(jié)果令人鼓舞，但膜的污染使過(guò)濾速率迅速下降是令人頭痛的難題。擴(kuò)張床吸附(Expanded Bed Adsorption, EBA)技術(shù)是上世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái) 的非常有前景的分離手段，在擴(kuò)張床層析柱中裝填有分離介質(zhì)，料液經(jīng)分離介質(zhì)后，分離介質(zhì)適度膨脹，分離介質(zhì)之間存在較大空隙，料液中固體小顆粒能直接通過(guò)床層而目標(biāo)產(chǎn)物 被分離介質(zhì)捕獲；同時(shí)專門(mén)設(shè)計(jì)的分離介質(zhì)能夠形成穩(wěn)定分級(jí)的床層結(jié)構(gòu)，使得分離效果 可 與固定床層析相當(dāng)。擴(kuò)張床吸附集固液分離、濃縮和初期純化于一個(gè)操作單元之中，能直 接從含有固體顆粒的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)液或勻漿液中捕獲目標(biāo)產(chǎn)物，從而減少了操作步驟， 能降低成本，縮短操作時(shí)間，提高收率。本發(fā)明創(chuàng)造性的將動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附與生物發(fā)酵相耦合的技術(shù)應(yīng)用于生物有機(jī)酸 生產(chǎn)過(guò)程，包括脫氧腺苷鈷胺素(VB12)發(fā)酵過(guò)程中丙酸的在線吸附分離、乙酸發(fā)酵、檸檬 酸發(fā)酵、乳酸發(fā)酵、富馬酸發(fā)酵、酒石酸發(fā)酵、丁二酸發(fā)酵以及長(zhǎng)鏈二元酸發(fā)酵的過(guò)程集成 等。這幾個(gè)產(chǎn)品都是重要的生物化工產(chǎn)品，也是我國(guó)在國(guó)際上有一定市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)的發(fā)酵產(chǎn)品 的代表，但與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，在發(fā)酵技術(shù)和分離技術(shù)上還有不小的差距，產(chǎn)品質(zhì)量和成本面 臨發(fā)達(dá)國(guó)家技術(shù)不斷進(jìn)步造成的威脅，急需發(fā)展有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、高產(chǎn)量、高收率、低成本 和無(wú)污染的發(fā)酵工程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)應(yīng)用微生物細(xì)胞生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品時(shí)出現(xiàn)的反饋抑制現(xiàn)象，從生 物過(guò)程集成的角度出發(fā)，將動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中的擴(kuò)張床層析柱與發(fā)酵罐直接耦連， 創(chuàng)造性的將動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附與生物發(fā)酵相耦合的技術(shù)應(yīng)用于生物有機(jī)酸生產(chǎn)，從而提供一 種應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸的方法。本發(fā)明能夠克服目前在利用微生物細(xì)胞或直接用酶系進(jìn)行催化反應(yīng)生產(chǎn)某種產(chǎn) 品的過(guò)程中，常常伴隨有代謝物積累到一定濃度時(shí)，反饋抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，造成產(chǎn)品收率低、 原料利用率低、生產(chǎn)效率下降的問(wèn)題。本發(fā)明是在微生物細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程中，伴隨微生物細(xì)胞 的生長(zhǎng)會(huì)向細(xì)胞外發(fā)酵液中分泌目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸，此時(shí)參與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的酶 系受到目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸的反饋抑制使得細(xì)胞代謝速度減慢時(shí)，通過(guò)將帶有微生物細(xì)胞 的發(fā)酵液直接泵入動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中裝有分離介質(zhì)的擴(kuò)張床層析柱中，經(jīng)過(guò)一定的 吸附分離過(guò)程，實(shí)現(xiàn)在線吸附目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸而不造成層析柱的堵塞；去除目標(biāo)產(chǎn)品 生物有機(jī)酸的發(fā)酵液可循環(huán)回流至發(fā)酵罐。微生物細(xì)胞生長(zhǎng)所受抑制得以解除，微生物細(xì) 胞恢復(fù)生長(zhǎng)活力，微生物細(xì)胞生物量提高，生物有機(jī)酸產(chǎn)品產(chǎn)量增加。本發(fā)明的應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸的方法包括以下步 驟(1)采用常規(guī)方法培養(yǎng)微生物細(xì)胞種子，其是將C源在115°C下單獨(dú)滅菌30分鐘 后用于制備微生物細(xì)胞種子培養(yǎng)基；將需培養(yǎng)的微生物細(xì)胞種子接種于已滅菌后的種子 罐中的微生物細(xì)胞種子培養(yǎng)基中，在溫度為20-40°C的常壓下采用好氧或厭氧方式進(jìn)行初 級(jí)培養(yǎng)微生物細(xì)胞種子20-60小時(shí)；其中需培養(yǎng)的微生物細(xì)胞種子與微生物細(xì)胞種子培 養(yǎng)基的體積比為5-10% ；以質(zhì)量百分比計(jì)，微生物細(xì)胞種子培養(yǎng)基的組成滅菌后的C源 2-4%，N源2-4%，無(wú)機(jī)鹽0. 2-0. 5%，生長(zhǎng)因子(誘導(dǎo)物)0. 0005-0. 01 %，及水；且用無(wú)機(jī) 堿調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH為6. 5-7 ；優(yōu)選的將分離介質(zhì)用去離子水浸泡12-24小時(shí)后，再用lmol -L"1 HCl溶液浸泡分 離介質(zhì)4-6小時(shí)以去除分離介質(zhì)中的有機(jī)物及金屬雜質(zhì)，然后用去離子水洗滌分離介質(zhì)至 中性；用Imol NaOH浸泡洗滌后的分離介質(zhì)4-6小時(shí)，將分離介質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離堿型；最后用去離子水反復(fù)沖洗轉(zhuǎn)化 為游離堿型的分離介質(zhì)至中性，洗脫出多余的NaOH后裝于與 動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的發(fā)酵罐直接耦連的擴(kuò)張床層析柱中；所述的種子罐是在溫度為121°C下滅菌30分鐘；所述的分離介質(zhì)是自身的化學(xué)成分為高分子化合物，其性質(zhì)為弱堿性陰離子交換 分離介質(zhì)，結(jié)構(gòu)由骨架和功能基團(tuán)兩部分組成，骨架為丙烯酸系、苯乙烯系、環(huán)氧樹(shù)脂系中 的一種，功能基團(tuán)選自伯胺、仲胺、叔胺、季胺所組成的組中的至少一種。(2)將C源在115°C下單獨(dú)滅菌30分鐘后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基；將步驟(1)培 養(yǎng)好的微生物細(xì)胞種子接種于已滅菌的發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中得到帶有微生物細(xì)胞 的發(fā)酵液，在溫度為20-40°C的常壓下采用好氧或厭氧方式進(jìn)行微生物細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)； 其中培養(yǎng)好的微生物細(xì)胞種子與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為5-10% ；以質(zhì)量百分比計(jì)，發(fā) 酵培養(yǎng)基的組成滅菌后的C源2-6%，N源2-4%，無(wú)機(jī)鹽0. 2-0. 5 %，生長(zhǎng)因子(誘導(dǎo) 物)0. 0005-0. 01%，及水；且用無(wú)機(jī)堿調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5-7 ；伴隨微生物細(xì)胞的 生長(zhǎng)繁殖，微生物細(xì)胞生物量得以積累，目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸不斷合成，當(dāng)微生物細(xì)胞內(nèi)的 酶系參與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝(發(fā)酵過(guò)程中伴隨微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，微生物細(xì)胞內(nèi)會(huì) 有相應(yīng)的酶系在微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品代謝的過(guò)程中起到特定的功能)時(shí)受到目標(biāo)產(chǎn)品 生物有機(jī)酸(質(zhì)量濃度達(dá)到1-10% )的反饋抑制，使得發(fā)酵罐中的帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵 液(培養(yǎng)液)的PH由6. 5-7降低到5-6范圍，并導(dǎo)致帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液中的微生物 細(xì)胞代謝速度減慢，開(kāi)啟動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的電磁閥和液體泵；所述的發(fā)酵罐是在溫度為121°C下滅菌30分鐘；(3)將步驟(2)發(fā)酵罐中pH為5-6的帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液直接從步驟(1)的 動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中的擴(kuò)張床層析柱的底部進(jìn)入層析柱中，使層析柱中的分離介質(zhì)膨 脹，膨脹后的分離介質(zhì)的高度與原分離介質(zhì)的高度比為2 1-3 1，分離介質(zhì)之間存在較 大空隙，帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液中含有一定濃度的生物有機(jī)酸，當(dāng)帶有微生物細(xì)胞的發(fā) 酵液由擴(kuò)張床層析柱中的分離介質(zhì)之間的空隙穿過(guò)時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸被分離介質(zhì)直 接吸附，由分離介質(zhì)之間的空隙穿過(guò)的含有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液，從擴(kuò)張床層析柱上部回 流至發(fā)酵罐中，當(dāng)發(fā)酵罐中的帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液的PH回至6. 5-7時(shí)關(guān)閉動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式 吸附反應(yīng)器的電磁閥和液體泵；在擴(kuò)張床層析柱中可實(shí)現(xiàn)在線吸附目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸而 不造成層析柱的堵塞，使得發(fā)酵罐中的目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸濃度降低，微生物細(xì)胞生長(zhǎng)所 受抑制得以解除，微生物細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)活力，微生物細(xì)胞生物量繼續(xù)上升，帶有微生物細(xì)胞 的發(fā)酵液的PH回至6. 5-7 ；當(dāng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中的C源濃度低于質(zhì)量百分濃度為1-2 %時(shí)，按C源補(bǔ)料 液與原始發(fā)酵培養(yǎng)基配方中C源的濃度比為100 1的補(bǔ)料策略進(jìn)行C源補(bǔ)料，使發(fā)酵培 養(yǎng)基中的C源濃度恢復(fù)至質(zhì)量百分比為2-6%，從而使微生物細(xì)胞在充足營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下保持 旺盛的連續(xù)生長(zhǎng)狀態(tài)，直到微生物細(xì)胞生長(zhǎng)活力下降至出現(xiàn)細(xì)胞衰亡或感染其他微生物細(xì) 胞(當(dāng)目標(biāo)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)衰亡時(shí)就會(huì)感染相應(yīng)噬菌體，即感染其他微生物細(xì)胞)時(shí) 停止發(fā)酵，真正實(shí)現(xiàn)半連續(xù)微生物細(xì)胞發(fā)酵；C源補(bǔ)料液的補(bǔ)料速率為0. 1-0. 51Γ1，補(bǔ)料方式為流加補(bǔ)料或間歇性補(bǔ)料；(4)將步驟(3)得到的吸附有生物有機(jī)酸的分離介質(zhì)用水進(jìn)行淋洗，然后用洗脫 液進(jìn)行洗脫(淋洗、洗脫、再生、平衡后的分離介質(zhì)可重復(fù)利用)；收集脫附液、濃縮脫附液得到生物有機(jī)酸。所述的洗脫液是氫氧化鈉、氯化鈉或它們的混合物。本發(fā)明的應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)的生物有機(jī)酸選自丙酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、酒石酸、丁二酸、長(zhǎng)鏈二元酸等中的一種。所述的開(kāi)啟動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的電磁閥和液體泵是依據(jù)步驟(2)發(fā)酵罐中 的帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液(培養(yǎng)液)的PH降低到5-6范圍；當(dāng)發(fā)酵罐中的帶有微生物細(xì) 胞的發(fā)酵液(培養(yǎng)液)的PH回至6. 5-7時(shí)關(guān)閉動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的電磁閥和液體泵， 以進(jìn)行間歇式操作。所述的微生物細(xì)胞種子是丙酸桿菌屬中的一種、乳桿菌屬中的一種、丁二酸放線 桿菌、重組大腸桿菌或丁二酸厭氧螺菌等。所述的C源選自葡萄糖、蔗糖或玉米粉等中的一種。所述的N源選自玉米漿、酵母膏或蛋白胨等中的一種。所述的無(wú)機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀、氯化鎂、磷酸二氫鉀、硫酸銨等所組成的組中至少一種。所述的生長(zhǎng)因子(誘導(dǎo)物)是氯化鈷等。所述的無(wú)機(jī)堿是氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸鎂或氨水等。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸的方法與已有的發(fā) 酵分離耦合反應(yīng)器相比，本發(fā)明的應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)與已有的發(fā)酵分離耦合 反應(yīng)器裝置有明顯的不同，本發(fā)明創(chuàng)造性的將動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中擴(kuò)張床層析柱通 過(guò)相應(yīng)閥門(mén)、管路、液體泵同發(fā)酵罐直接耦連，可根據(jù)特定研究對(duì)象的特定生物和理化規(guī)律 (生物代謝流規(guī)律、發(fā)酵液物理化學(xué)規(guī)律等)設(shè)定工作參數(shù)，能夠由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行遠(yuǎn)程遙 控和仿真模擬，使原來(lái)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的層析柱與發(fā)酵罐的直接耦連成為可能；且本發(fā)明的動(dòng)態(tài) 擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)與現(xiàn)有工業(yè)應(yīng)用的發(fā)酵罐不同，具有邊發(fā)酵、邊分離產(chǎn)物和移走抑 制物的能力，可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵方式的半連續(xù)性，提高效率，降低成本，增加效益。2.本發(fā)明采用擴(kuò)張床層析柱與發(fā)酵罐進(jìn)行直接耦連，有選擇地吸附某種代謝產(chǎn) 物，而不是不加選擇地將發(fā)酵液取走，是一個(gè)新的發(fā)酵與分離耦合的過(guò)程；而現(xiàn)有的固定床 層析柱無(wú)法實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程，對(duì)于利用現(xiàn)有的固定床層析柱得到發(fā)酵液，必須在固定床層析 柱前設(shè)置一個(gè)膜分離器分開(kāi)微生物細(xì)胞和發(fā)酵液。本發(fā)明方法中采用的擴(kuò)張床允許帶有固 體的物料直接進(jìn)入擴(kuò)張床層析柱，避免了固定床不能直接處理含固體物料的吸附與發(fā)酵罐 直接耦連所導(dǎo)致的堵塞問(wèn)題，省略了發(fā)酵罐和擴(kuò)張床層析柱之間額外附加的膜分離器，實(shí) 現(xiàn)了擴(kuò)張床層析柱與發(fā)酵罐的直接耦連和在線吸附產(chǎn)物。3.本發(fā)明應(yīng)用新穎，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)品代謝產(chǎn)物的反饋抑制現(xiàn)象普遍存 在，本發(fā)明不僅可以應(yīng)用于丙酸/VB12聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中，而且還可以推廣至其它生物有機(jī) 酸產(chǎn)品，例如乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、酒石酸、丁二酸以及長(zhǎng)鏈二元酸等。本發(fā)明能夠降 低生成成本，提高產(chǎn)品的質(zhì)量，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1.本發(fā)明的應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸方法中的一種動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)示意圖。附圖標(biāo)記1.發(fā)酵罐 2、22·管路3.洗脫液儲(chǔ)罐4.淋洗液儲(chǔ)罐5.再生液儲(chǔ)罐6.平衡液儲(chǔ)罐7、9、10、11、12、13、14、15、23.電磁閥8.液體泵 16、17、18.層析柱19.產(chǎn)品儲(chǔ)罐20.廢液儲(chǔ)罐 21.檢測(cè)器24.轉(zhuǎn)化罐
具體實(shí)施例方式現(xiàn)以厭氧生產(chǎn)丙酸/VB12聯(lián)合發(fā)酵及丙酸在線分離為例，采用分批發(fā)酵和半連續(xù) 發(fā)酵兩種方式來(lái)說(shuō)明采用本發(fā)明的應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸方法 的技術(shù)體系生產(chǎn)丙酸/VB12的先進(jìn)性。對(duì)比例.利用發(fā)酵罐進(jìn)行批次發(fā)酵(1)種子的制備采用常規(guī)方法培養(yǎng)微生物細(xì)胞種子，其是將葡萄糖在115°C下單獨(dú)滅菌30分鐘 后用于制備費(fèi)氏丙酸桿菌(propionibacterium freudenreichii)種子培養(yǎng)基；將需培養(yǎng) 的費(fèi)氏丙酸桿菌種子接種于已滅菌后的種子罐中的費(fèi)氏丙酸桿菌種子培養(yǎng)基中，在溫度為 30°C的常壓下采用厭氧方式進(jìn)行初級(jí)培養(yǎng)費(fèi)氏丙酸桿菌種子40小時(shí)；其中需培養(yǎng)的微生 物細(xì)胞種子與微生物細(xì)胞種子培養(yǎng)基的體積比為5-10% ；以質(zhì)量百分比計(jì)，費(fèi)氏丙酸桿菌 種子培養(yǎng)基的組成滅菌后的葡萄糖4 %，玉米漿4 %，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0. 4 %，碳 酸鈣0. 4%，氯化鈷0. 0005%,及去離子水；且用NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為6. 5-7. 0。種子罐是在溫度為121°C下滅菌30分鐘。(2)發(fā)酵階段將葡萄糖在115°C下單獨(dú)滅菌30分鐘后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基；將步驟(1)培養(yǎng)好 的費(fèi)氏丙酸桿菌種子接種于已滅菌的發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中得到帶有微生物細(xì)胞的發(fā) 酵液，在溫度為30°C的常壓下采用厭氧方式進(jìn)行微生物細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)90小時(shí)；發(fā)酵過(guò) 程中使用氨水控制發(fā)酵液PH為6. 5-7. 0，當(dāng)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)后期(50-60小時(shí))時(shí) 向發(fā)酵液中添加前體5，6_ 二甲基苯并咪唑(DMB)使費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞合成脫氧腺苷鈷胺 素(VB12)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程定時(shí)跟蹤檢測(cè)生物量(0D值)及pH。其中，以質(zhì)量百分比計(jì)，費(fèi) 氏丙酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的組成滅菌后的葡萄糖6%，玉米漿4%，磷酸二氫鉀0. 46，氯化鈷 0. 00127，及自來(lái)水；且用NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5-7. 0。發(fā)酵罐是在溫度為121°C下滅菌30分鐘。(3)由于對(duì)比例中未將動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中的層析柱裝置(分離環(huán)節(jié))應(yīng)用 于發(fā)酵過(guò)程中，即無(wú)法實(shí)現(xiàn)丙酸產(chǎn)品的原位在線吸附回收，所以發(fā)酵結(jié)束后高效液相色譜 (HPLC)檢測(cè)產(chǎn)品只包括VB12。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)施例1.應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)丙酸/VB12請(qǐng)參見(jiàn)圖1。所用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)包括帶有攪拌裝置的發(fā)酵罐1，管路2，洗脫液儲(chǔ)罐3，淋洗液儲(chǔ)罐4，再生液儲(chǔ)罐5，平衡液儲(chǔ)罐6，電磁閥7、9、10、11、12、13、14、15及23，液體泵8，層析柱16、17及18，產(chǎn)品儲(chǔ)罐19，廢液儲(chǔ)罐20，檢測(cè)器21，管路22，轉(zhuǎn)化
罐24等。三個(gè)并聯(lián)的擴(kuò)張床層析柱 16、17、18的底部均開(kāi)有循環(huán)液進(jìn)口，擴(kuò)張床層析柱的 頂部均開(kāi)有循環(huán)液出口。一構(gòu)成循環(huán)液回路的循環(huán)液總管路22，在該總管路上帶有3個(gè)三通電磁閥12、13 及14，和4個(gè)四通電磁閥9、10、11及15。其中，擴(kuò)張床層析柱16、17、18的循環(huán)液出口分別通過(guò)管路與三通電磁閥12、13及 14相連通；擴(kuò)張床層析柱上部處的循環(huán)液總管路上的3個(gè)三電磁閥12、13及14分別通過(guò)管 路串連相連通，且并聯(lián)的第一個(gè)擴(kuò)張床層析柱16的循環(huán)液出口管路上的三通電磁閥14的 一端口通過(guò)管路與連通檢測(cè)器21的四通電磁閥15的一端口相連通，并聯(lián)的第三個(gè)擴(kuò)張床 層析柱18的循環(huán)液出口管路上的三通電磁閥12的一端口通過(guò)管路與連通轉(zhuǎn)化罐24的電 磁閥23的一個(gè)端口相連通；四通電磁閥15的一端口通過(guò)管路與發(fā)酵罐1相連通。檢測(cè)器21分別通過(guò)管路與產(chǎn)品儲(chǔ)罐19和廢液儲(chǔ)罐20相連通。循環(huán)液總管路上的四通電磁閥9、10、11分別通過(guò)管路與擴(kuò)張床層析柱16、17、18 的循環(huán)液進(jìn)口相連通；3個(gè)四電磁閥9、10及11分別通過(guò)管路串連相連通。液體泵8的出口分別通過(guò)管路與四通電磁閥9、10、11的循環(huán)液進(jìn)口相連通；液體 泵8的進(jìn)口通過(guò)管路與三通電磁閥7的一端口相連通；三通電磁閥7的另兩個(gè)端口分別通 過(guò)管路2與發(fā)酵罐1相連通，及通過(guò)管路與各自帶有閥門(mén)的洗脫液儲(chǔ)罐3、淋洗液儲(chǔ)罐4、再 生液儲(chǔ)罐5和平衡液儲(chǔ)罐6相連通。應(yīng)用上述動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)丙酸/VB12(1)采用常規(guī)方法培養(yǎng)微生物細(xì)胞種子，其是將葡萄糖在115°C下單獨(dú)滅菌30分 鐘后用于制備費(fèi)氏丙酸桿菌(propionibacterium freudenreichii)種子培養(yǎng)基；將需培 養(yǎng)的費(fèi)氏丙酸桿菌種子接種于已滅菌后的種子罐中的費(fèi)氏丙酸桿菌種子培養(yǎng)基中，在溫度 為30°C的常壓下采用厭氧方式進(jìn)行初級(jí)培養(yǎng)費(fèi)氏丙酸桿菌種子40小時(shí)；其中需培養(yǎng)的 微生物細(xì)胞種子與微生物細(xì)胞種子培養(yǎng)基的體積比為5-10% ；以質(zhì)量百分比計(jì)，費(fèi)氏丙酸 桿菌種子培養(yǎng)基的組成葡萄糖4%，玉米漿4%，硫酸銨0. 5%，磷酸二氫鉀0. 4%，碳酸鈣 0. 4%，氯化鈷0. 0005%，及去離子水；且用NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5-7. 0。種子罐是在溫度為121°C下滅菌30分鐘。將骨架為環(huán)氧樹(shù)脂、功能基團(tuán)為伯、仲、叔、季的弱堿性陰離子交換分離介質(zhì)用去 離子水浸泡12-24小時(shí)后，用lmol -L"1 HCl溶液浸泡4_6小時(shí)去除分離介質(zhì)中的有機(jī)物及 金屬雜質(zhì)，再用去離子水洗至中性；然后用lmol ^r1NaOH浸泡4-6小時(shí)，將分離介質(zhì)轉(zhuǎn)化為 游離堿型；最后用去離子水反復(fù)沖洗至中性，洗脫出多余的NaOH，然后裝于與動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式 吸附反應(yīng)器的發(fā)酵罐直接耦連的擴(kuò)張床層析柱16，17，18中。(2)將葡萄糖在115°C下單獨(dú)滅菌30分鐘后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基；將步驟(1)培 養(yǎng)好的費(fèi)氏丙酸桿菌種子接種于已滅菌的發(fā)酵罐1中的發(fā)酵培養(yǎng)基中得到帶有微生物細(xì) 胞的發(fā)酵液，在溫度為30°C的常壓下采用厭氧方式進(jìn)行微生物細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)120小時(shí)； 其中費(fèi)氏丙酸桿菌種子與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10% ；以質(zhì)量百分比計(jì)，發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成滅菌后的葡萄糖6%，玉米漿4%，磷酸二氫鉀0. 46，氯化鈷0. 00127，及自來(lái)水；且用 NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5-7. 0。伴隨費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，微生物細(xì)胞生物量得以積累，目標(biāo)產(chǎn)品丙酸不斷合成，當(dāng)費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞內(nèi)的酶系參與微生物細(xì)胞生 長(zhǎng)代謝(發(fā)酵過(guò)程中伴隨微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，微生物細(xì)胞內(nèi)會(huì)有相應(yīng)的酶系在微生物 細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品 代謝的過(guò)程中起到特定的功能)時(shí)受到丙酸(質(zhì)量濃度達(dá)到1.0% )的反 饋抑制，使得發(fā)酵罐中帶有的細(xì)胞培養(yǎng)液(發(fā)酵液)的PH降低到5. 5時(shí)，導(dǎo)致帶有費(fèi)氏丙 酸桿菌細(xì)胞的發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞代謝速度減慢，開(kāi)啟動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的電磁閥 7和液體泵8。發(fā)酵罐是在溫度為121°C下滅菌30分鐘。(3)將步驟⑵發(fā)酵罐1中的pH為5. 5帶有費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞的發(fā)酵液經(jīng)管路2 直接從步驟(1)的動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中的擴(kuò)張床層析柱16、17、18的底部進(jìn)入層析柱 中，使層析柱16、17、18中的分離介質(zhì)膨脹，膨脹后的分離介質(zhì)的高度與原分離介質(zhì)的高度 比為2. 5 1，分離介質(zhì)之間存在較大空隙，帶有費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞的發(fā)酵液中含有一定濃 度的丙酸，當(dāng)帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液由擴(kuò)張床層析柱16、17、18中的分離介質(zhì)之間的空 隙穿過(guò)時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)品丙酸以陰離子形式(丙酸根形式)同再生好的分離介質(zhì)上的相同性質(zhì) 的陰離子(0H_)進(jìn)行離子交換，丙酸根以陰離子形式吸附于分離介質(zhì)上，OH—被置換下來(lái)隨 發(fā)酵液從擴(kuò)張床層析柱上部回流至發(fā)酵罐1中，實(shí)現(xiàn)在線吸附丙酸而不造成層析柱16、17、 18的堵塞，使得發(fā)酵罐1中的丙酸濃度降低。帶有費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞的發(fā)酵液從擴(kuò)張床層 析柱16、17、18上部的電磁閥12、13、14、15循環(huán)回流至發(fā)酵罐1中，由于回流發(fā)酵液中含有 0H—，發(fā)酵液的pH回升至細(xì)胞最適生長(zhǎng)環(huán)境6. 5-7. 0時(shí)，關(guān)閉動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的電磁 閥7和液體泵8。去除丙酸的費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞發(fā)酵液生長(zhǎng)所受抑制得以解除，費(fèi)氏丙酸桿 菌細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)活力，細(xì)胞量繼續(xù)上升。吸附柱16、17、18可開(kāi)啟相應(yīng)電磁閥進(jìn)行同時(shí)或輪換使用。當(dāng)發(fā)酵罐1中的發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低于質(zhì)量百分濃度為2%時(shí)，用質(zhì)量 濃度為60%的葡萄糖溶液(補(bǔ)料液)進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為0. lh—1，補(bǔ)料方式為流加補(bǔ)料， 使發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度恢復(fù)至質(zhì)量百分比為2-6 %，從而使費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞在充 足營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下連續(xù)生長(zhǎng)，使細(xì)胞保持旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)。直到費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)活力下 降至出現(xiàn)細(xì)胞衰亡或感染其他微生物細(xì)胞(當(dāng)目標(biāo)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)衰亡時(shí)就會(huì)感染 相應(yīng)噬菌體，即感染其他微生物)時(shí)停止發(fā)酵，真正實(shí)現(xiàn)半連續(xù)微生物細(xì)胞發(fā)酵。(4) 一次吸附完后，分別啟動(dòng)相應(yīng)的電磁閥7、9、10、11、12、13、14及15和液體泵 8，打開(kāi)淋洗液儲(chǔ)罐的閥門(mén)，將步驟(3)得到的吸附有丙酸的分離介質(zhì)用淋洗液(去離子水) 進(jìn)行淋洗，淋洗完成后關(guān)閉淋洗液儲(chǔ)罐閥門(mén)，淋洗液進(jìn)入廢液儲(chǔ)罐20。然后打開(kāi)洗脫液儲(chǔ)罐 3閥門(mén)，用洗脫液3(lmol/L的NaCl)進(jìn)行洗脫；脫附液經(jīng)管路通過(guò)檢測(cè)器21，收集脫附液于 產(chǎn)品儲(chǔ)罐19中，取出產(chǎn)品后濃縮脫附液得到丙酸。淋洗、洗脫、再生、平衡后的分離介質(zhì)可 重復(fù)利用。(5)當(dāng)回到發(fā)酵罐1中的費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞發(fā)酵液發(fā)酵至細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期 50-60小時(shí)(即微生物細(xì)胞生物量不再出現(xiàn)連續(xù)生長(zhǎng)狀態(tài))時(shí)，開(kāi)啟電磁閥7、10、11、23和 液體泵8，經(jīng)管路2、22，取出部分發(fā)酵液收集于一轉(zhuǎn)化罐24，向轉(zhuǎn)化罐24中添加前體5， 6-二甲基苯并咪唑(DMB)使微生物細(xì)胞合成脫氧腺苷鈷胺素(VB12)，根據(jù)取走發(fā)酵液的體 積，向發(fā)酵罐1中加入與取走發(fā)酵液等體積的培養(yǎng)基，按10%體積比進(jìn)行新一次的種子細(xì) 胞接種，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程的連續(xù)性。
(6)產(chǎn)品分析方法VB12 的測(cè)定從轉(zhuǎn)化罐24中收獲的費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞發(fā)酵液于4000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集細(xì)胞配成質(zhì)量濃度為2. 5%的菌懸液，沸水浴30分鐘破碎細(xì)胞，釋放費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物 VB12,10000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清液，上清液用0. 2um纖維素濾膜過(guò)濾。為了防止其光解， 整個(gè)操作過(guò)程中需避光進(jìn)行。取過(guò)濾好的上清液作為高效液相色譜(HPLC)的檢測(cè)樣品，色譜柱 BeckmanC18(5um,4. 6mmX25cm)；色譜檢測(cè)條件流動(dòng)相I為乙腈，流動(dòng)相II為醋酸鈉緩沖 液(pH值為3. 5)柱溫25°C;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm ；流速1. OmL .mirT1 ；進(jìn)樣量IOul。洗脫條件 0-5分鐘，質(zhì)量濃度15%乙腈恒速洗脫；5-15分鐘，質(zhì)量濃度15-30%乙腈梯度洗脫。測(cè)定 VB12產(chǎn)量采用HPLC快速分析方法[張玉明，食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(1) :124_127]。結(jié) 果見(jiàn)表1。丙酸的測(cè)定高效液相色譜法(HPLC)將丙酸經(jīng)0. 2um纖維素濾膜過(guò)濾作為HPLC的檢測(cè)樣 品，色譜柱BeckmanC18(5um，4. 6mmX25cm)；色譜條件流動(dòng)相I為乙腈，流動(dòng)相II為 0. 02mol · L-1K2HPO4 緩沖液(濃磷酸調(diào)節(jié) pH 值為 2. 8)，V I V II = 8 92 ；柱溫 30°C ； 檢測(cè)波長(zhǎng)215nm ；流速lmL · mirT1 ；進(jìn)樣量10μ L。結(jié)果見(jiàn)表1。在上述步驟1中，發(fā)酵所用菌種費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii), CICC 10019，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。表1顯示應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)與傳統(tǒng)加堿控制pH的發(fā)酵系統(tǒng)技術(shù)體 系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，由表1可知，采用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)技術(shù)體系進(jìn)行丙酸桿菌 厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酸/VB12，不但可回收丙酸產(chǎn)品，同時(shí)微生物細(xì)胞生物量和VB12產(chǎn)量都有 明顯提高。表1應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行丙酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酸/VB12實(shí)驗(yàn)
結(jié)果
權(quán)利要求
一種應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸的方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)將分離介質(zhì)裝于與動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的發(fā)酵罐直接耦連的擴(kuò)張床層析柱中；所述的分離介質(zhì)的結(jié)構(gòu)由骨架和功能基團(tuán)兩部分組成，骨架為丙烯酸、苯乙烯、環(huán)氧樹(shù)脂中的一種，功能基團(tuán)選自伯胺、仲胺、叔胺、季胺所組成的組中的至少一種；(2)將培養(yǎng)好的微生物細(xì)胞種子接種于已滅菌的發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中得到帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液，采用好氧或厭氧方式進(jìn)行微生物細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)；伴隨微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，微生物細(xì)胞生物量得以積累，目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸不斷合成，當(dāng)微生物細(xì)胞內(nèi)的酶系參與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝時(shí)受到目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸的反饋抑制，使得發(fā)酵罐中的帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液的pH由6.5 7降低到5 6范圍，并導(dǎo)致帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞代謝速度減慢，開(kāi)啟動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的電磁閥和液體泵；(3)將步驟(2)發(fā)酵罐中pH為5 6的帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液直接從步驟(1)的動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中的擴(kuò)張床層析柱的底部進(jìn)入層析柱中，使層析柱中的分離介質(zhì)膨脹，膨脹后的分離介質(zhì)的高度與原分離介質(zhì)的高度比為2∶1 3∶1，分離介質(zhì)之間存在空隙，帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液中含有生物有機(jī)酸，當(dāng)帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液由擴(kuò)張床層析柱中的分離介質(zhì)之間的空隙穿過(guò)時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸被分離介質(zhì)直接吸附，由分離介質(zhì)之間的空隙穿過(guò)的含有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液，從擴(kuò)張床層析柱上部回流至發(fā)酵罐中，當(dāng)發(fā)酵罐中的帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液的pH回至6.5 7時(shí)關(guān)閉動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器的電磁閥和液體泵；當(dāng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中的C源濃度低于質(zhì)量百分濃度為1 2％時(shí)，按C源補(bǔ)料液與原始發(fā)酵培養(yǎng)基配方中C源的濃度比為100∶1的補(bǔ)料策略進(jìn)行C源補(bǔ)料，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的C源濃度恢復(fù)至質(zhì)量百分比為2 6％；(4)將步驟(3)得到的吸附有生物有機(jī)酸的分離介質(zhì)用水進(jìn)行淋洗，然后用洗脫液進(jìn)行洗脫；收集脫附液、濃縮脫附液得到生物有機(jī)酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的洗脫液是氫氧化鈉、氯化鈉或它們的 混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的微生物細(xì)胞種子選自丙酸桿菌屬、乳 桿菌屬、丁二酸放線桿菌、重組大腸桿菌或丁二酸厭氧螺菌中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的C源補(bǔ)料液的補(bǔ)料速率為 0. 1-0. 51Γ1 ；補(bǔ)料方式為流加補(bǔ)料或間歇性補(bǔ)料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征是所述的C源選自葡萄糖、蔗糖或玉米粉 中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的當(dāng)微生物細(xì)胞內(nèi)的酶系參與微生物 細(xì)胞生長(zhǎng)代謝時(shí)受到目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸的反饋抑制時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸的質(zhì)量濃度 為 1-10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征是所述的生物有機(jī)酸選自丙酸、乙酸、檸 檬酸、乳酸、富馬酸、酒石酸、丁二酸、長(zhǎng)鏈二元酸中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的分離介質(zhì)是先用去離子水浸泡后，再 用Imol -Γ1 HCl溶液浸泡分離介質(zhì)以去除分離介質(zhì)中的有機(jī)物及金屬雜質(zhì)，然后用去離子水洗滌分離介質(zhì)至中性；用Imol -Γ1 NaOH浸泡洗滌后的分離介質(zhì)，將分離介質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離 堿型；最后用去離子水反復(fù)沖洗轉(zhuǎn)化為游離堿型的分離介質(zhì)至中性，洗脫出多余的NaOH后 裝于與動(dòng)態(tài)擴(kuò) 張式吸附反應(yīng)器的發(fā)酵罐直接耦連的擴(kuò)張床層析柱中。
全文摘要
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及應(yīng)用動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)生物有機(jī)酸的方法。本發(fā)明是在微生物細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程中，伴隨微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)向細(xì)胞外發(fā)酵液中分泌目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸，此時(shí)參與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的酶系受到目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸的反饋抑制使得細(xì)胞代謝速度減慢時(shí)，通過(guò)將帶有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液直接泵入動(dòng)態(tài)擴(kuò)張式吸附反應(yīng)器中的裝有分離介質(zhì)的擴(kuò)張床層析柱中，經(jīng)過(guò)一定的吸附分離過(guò)程，實(shí)現(xiàn)在線吸附目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸而不造成層析柱的堵塞；去除目標(biāo)產(chǎn)品生物有機(jī)酸的發(fā)酵液可循環(huán)回流至發(fā)酵罐。微生物細(xì)胞生長(zhǎng)所受抑制得以解除，微生物細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)活力，微生物細(xì)胞生物量提高，生物有機(jī)酸產(chǎn)品產(chǎn)量增加。
文檔編號(hào)C12P7/52GK101967498SQ20091008987
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者張建飛, 李凌云, 王云山, 王鵬, 蘇志國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所