專利名稱：：提取純化dna的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種提取純化DNA的試劑。
背景技術(shù)：
：DNA分離純化是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中非常重要的操作，核酸的質(zhì)量直接關(guān)系到后續(xù)操作能否順利進(jìn)行。生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，強(qiáng)化了對(duì)從各種生物檢材中獲得核酸的復(fù)雜方法的需求。例如，脫氧核糖核酸提供了廣泛的關(guān)于遺傳起源和遺傳多態(tài)性信息。這些信息可用于法醫(yī)遺傳學(xué)鑒定實(shí)踐。目前所存在的各種核酸純化方法皆可分成以下兩大類液相純化和固相純化。在液相純化中，核酸維持為液體狀態(tài)，而雜質(zhì)通過沉淀、離心被除去或者核酸被沉淀出來，而雜質(zhì)被保留；在固相純化中，核酸被結(jié)合到固相載體上，而雜質(zhì)被選擇性洗脫。例如，采用液相純化來分離的DNA保留在液相中，而雜質(zhì)被通過諸如沉淀和/或離心之類的方法除去。在固相純化中DNA結(jié)合到固相載體上，而雜質(zhì)如RNA、蛋白質(zhì)和磷脂等被選擇性洗脫。在DNA純化中，如果起始材料包括細(xì)胞，液相方法和固相方法都需要細(xì)胞或病毒共破裂，或裂解步驟。破裂或裂解步驟產(chǎn)生與污染物如RNA、脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)等混合的DNA。這種混合物還含有降解DNA的必須被除去和/或滅活以不感染產(chǎn)生基本上未降解的DNA的DNA酶。兩個(gè)純化大類以前都利用常規(guī)的方法，需要繁瑣的步驟，且通常用到有害的試劑，現(xiàn)在也出現(xiàn)了更快速的提取方法，如Chelex-100法，僅需要較少的步驟，且通常較少的有害試劑。Chelex-100法一種快速液相DNA純化方法，Chelex-100是一種化學(xué)整合樹脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成。含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽離子，整合多價(jià)金屬離子，尤其是選擇性整合二價(jià)離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強(qiáng)的結(jié)合力.能結(jié)合許多可能影響一步分析的其他外源物質(zhì)。通過離心除去Chelex-100顆粒，使這些與Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離，防止結(jié)合到Chelex中的抑制劑或雜質(zhì)帶到PCR反應(yīng)中，影響下一步的DNA分析，并通過結(jié)合金屬離子，防止DNA降解。利用螯合劑去除生物樣品中金屬雜質(zhì)而達(dá)到純化的目的。該法首先用去離子水洗滌生物樣品，加入螯合樹脂的懸浮液56'C孵育一定時(shí)間，IO(TC孵育8分鐘，然后通過離心去除雜質(zhì)。該方法簡(jiǎn)單、快速(僅涉及到兩種試劑的使用)。但該法提取得到的DNA純度不夠，不能滿足微量DNA生物樣品DNA提取純化的要求。固相提取方法近年來發(fā)展迅速，在核酸提取領(lǐng)域占有非常重要的地位。這類方法一般需要四個(gè)主要步驟裂解細(xì)胞使細(xì)胞膜、核膜DNA破裂以釋放DNA;釋放的DNA與固相載體結(jié)合；雜質(zhì)的洗滌；洗脫而得到純化的DNA。對(duì)于固相DNA純化，已使用了多種固相載體，如二氧化硅微球、薄膜過濾器、金屬氧化物、膠乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。當(dāng)核酸存在于在高濃度離液鹽以及低的pH溶液中時(shí)，能夠吸附到硅類介質(zhì)表面，并在低鹽高pH溶液中洗脫下來，從而達(dá)到提取純化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉從瓊脂糖凝膠中提取到DNA，而Marko使用玻璃粉成功提純質(zhì)粒DNA。Boom等對(duì)該方法加以改進(jìn)，用二氧化硅和硅藻土為固相吸附劑，用來提取純化人血清或尿液中的微量病原體基因組DNA。該方法需要六步離心、五種試劑從全血中純化DNA。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種提取純化DNA的試劑。本發(fā)明提供的提取純化DNA的試劑，由以下物質(zhì)組成預(yù)處理裂解液pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)10-100mM緩沖鹽，0.5-5g/100ml的表面活性劑，1-100mM的螯合劑，50-150mM的可溶性鹽和0.2-4mg/ml的蛋白酶K;裂解結(jié)合液pH二6.4-7.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20-150mM的緩沖鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10%(體積百分含量)的表面活性劑，0.5-4g/100ml的兼性離子去污劑，10-100mM的螯合劑以及15-30%(體積百分含量)的醇；洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4-6M的Chaotropic鹽，25-50%(體積百分含量)的醇和10-100mM的螯合劑；洗滌液II:75-80%(體積百分含量)乙醇水溶液；洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是0-20mM的Tris-HC1,0-2mM的EDTA;磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液的成分如下直徑為50-1200nm的納米級(jí)硅包被磁性微球50-100mg，其余為水。精斑和毛發(fā)中DNA的提取，需在預(yù)處理裂解液中加入DTT(二硫蘇糖醇)，上述預(yù)處理裂解液中，溶質(zhì)還包括0.025-0.05M的二硫蘇糖醇。所以本發(fā)明提供的另-種提取純化DNA的試劑，是由以下物質(zhì)組成預(yù)處理裂解液pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)10-100mM緩沖鹽，0.5-5g/100ml的表面活性劑，1-100raM的螯合劑，50-150mM的可溶性鹽和0.2-4mg/ml的蛋白酶K和0.025-0.05M的二硫蘇糖醇；裂解結(jié)合液pH=6.4-7.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20-150mM的緩沖鹽，3-8M的Chaotr叩ic鹽，l-10。/。(體積百分比)的表面活性劑，0.5-4g/100ml的兼性離子去污劑，10-100mM的螯合劑以及15-30%(體積百分含量)的醇；洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4-6M的Chaotr叩ic鹽，25-50%(體積百分含量)的醇和10-100mM的螯合劑；洗滌液II:75-80%(體積百分含量)乙醇水溶液；洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是0-20raM的Tris-HC1，0-2mM的EDTA;磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液的成分如下直徑為50-1200nm的納米級(jí)硅包被磁性微球50-100mg，其余為水。上述二硫蘇糖醇的濃度優(yōu)選是0.04M-0.05M。上述所有的預(yù)處理裂解液中，緩沖鹽的濃度優(yōu)選為20-80mM，表面活性劑的濃度優(yōu)選為0,5-4g/100ml，螯合劑的濃度優(yōu)選為20-80mM，可溶性鹽的濃度優(yōu)選為50-130mM，蛋白酶K的濃度優(yōu)選為0.2-2mg/ml;所述可溶性鹽更優(yōu)選為80-100mM，蛋白酶K更優(yōu)選為0.2-1mg/ml;所述預(yù)處理裂解液中的表面活性劑為陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑，優(yōu)選是陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為十二烷基磺酸鈉或十二烷基肌氨酸鈉；所述消化液還包括一種可溶性鹽溶液，DNA從細(xì)胞核中釋放并與組蛋白分離后，需要提高DNA在溶液中的溶解度。DNA在一定濃度氯化鈉溶液中的溶解度很高，Na+與帶負(fù)電的DNA結(jié)合成DNA鈉鹽。這使DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)并維持DNA在溶液中的穩(wěn)定性。在某些實(shí)施例中，可以使用NaCl等可溶性鹽。蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛各種生物檢材，如血斑、精斑、煙蒂、毛發(fā)、組織等首先要經(jīng)過預(yù)處理裂解液浸泡，并在50-65。C的溫度下孵育0.5h-4h后，方可進(jìn)行后續(xù)提取操作。孵育的溫度優(yōu)選為56-60°C。通過預(yù)處理裂解液對(duì)生物樣本的預(yù)處理，一是能夠使載體上黏附的細(xì)胞(如血白細(xì)胞、精子細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)和DNA與載體分離或與組織中脫離，游離在預(yù)處理裂解液中；二是裂解細(xì)胞，使DNA和蛋白質(zhì)、磷脂等污染物釋放至消化液中，通過離心等方法去除載體后即形成粗裂解液并完成樣本預(yù)處理。預(yù)處理后形成的粗裂解液中包含DNA及蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片、磷脂等細(xì)胞污染物。為了更充分的裂解細(xì)胞，最大程度的使DNA從細(xì)胞中釋放出來，并使釋放出來的DNA與磁性微球結(jié)合以達(dá)到分離純化的目的，可以使用裂解結(jié)合液。上述裂解結(jié)合液中，Chaotropic鹽的濃度優(yōu)選為4-6M，緩沖鹽的濃度優(yōu)選為50-120mM，螯合劑的濃度優(yōu)選為20-80mM，表面活性劑的濃度優(yōu)選為2-8%(體積百分比)，兼性離子去污劑的濃度優(yōu)選為l-3g/100ml，醇的濃度優(yōu)選為20-28%(體積百分含量)；所述裂解結(jié)合液中的表面活性劑優(yōu)選用非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑為TritonX-lOO、Tween20、Tween21、Tween.40、Tween60、Tween80、Tween85、NP-40、Brij30或Span20;所述兼性離子去污劑是3-(3陽膽胺丙基)-二甲氨基-l-丙磺酸；所述醇是乙醇、異丙醇或聚乙二醇。上述洗滌液I中，Chaotropic鹽的濃度優(yōu)選為4.2-5.8M，醇為30-45%(體積百分含量)的乙醇，螯合劑的濃度優(yōu)選為20-80raM。上述洗滌液II優(yōu)選為75%乙醇水溶液。上述洗滌液I和II用來洗滌DNA-磁性納米微球形成的復(fù)合體，以除去與磁珠結(jié)合的除核酸以外的污染物如蛋白質(zhì)、磷脂。所述洗脫液中的Tris-HC1的濃度優(yōu)選10mM、EDTA的濃度優(yōu)選lmM，所述洗脫液pH優(yōu)選為8.0。在除去與固相載體結(jié)合的蛋白質(zhì)、磷脂等污染物后，必須將與固相載體結(jié)合的DNA洗脫至水相溶液中才能應(yīng)用于后續(xù)法醫(yī)DNA分析。DNA-磁性微球復(fù)合體與洗脫液接觸后，可以使DNA與固相載體分離。洗脫液可以是低離子強(qiáng)度的水相溶液，也可以是無離子水或是一定PH的低離子強(qiáng)度的水溶液。洗脫液PH值必須能夠保證DNA穩(wěn)定性、完整性。可以是低濃度TE(lOmMTris-HCl，lmMEDTA，pH8.0)洗脫與固相載體結(jié)合的DNA。上述每ml磁珠懸浮液的中的納米級(jí)硅包被磁性微球優(yōu)選為50mg。在上述試劑中，所述緩沖鹽為Tris-HCl、磷酸鹽或HEPES鹽。上述Chaotropic鹽在水性溶液中具有高溶解度。高濃度的Chaotropic鹽能夠引起蛋白質(zhì)打開折疊、破壞核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)并使變性的蛋白質(zhì)和雙鏈DNA溶解。通常認(rèn)為，這是由于Chaotropic鹽離子能夠破壞其所在溶液體系中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使變性的蛋白質(zhì)和變性DNA表現(xiàn)出比其正確折疊或天然構(gòu)象時(shí)更高的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，而且能夠保證讓DNA優(yōu)先結(jié)合到磁性納米微球上。這種Chaotropic鹽可以是任何已知的Chaotropic鹽，如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍、尿素、碘化鈉、碘化鉀、氯化鋰、高氯酸鈉、三氯醋酸鹽。發(fā)明中使用的是胍鹽(如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍)。尤其是異硫氰酸胍，能夠更好的裂解細(xì)胞并抑制核酸酶的活性，是一中非常有效DNA純化試劑。Chaotropic鹽可以38M濃度存在于裂解結(jié)合液中。在本發(fā)明任何一種含有Chaotr叩ic鹽的試劑中，Chaotropic鹽的濃度必須要低于其所在該試劑中的溶解度。一定Chaotropic鹽的濃度大小能夠影響DNA與磁性納米微球結(jié)合。Chaotropic鹽必須達(dá)到一定的濃度才能促使DNA與磁性微球的結(jié)合。但是過高的鹽濃度會(huì)使蛋白質(zhì)變性和DNA降解，并從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)和大分子的雙鏈DNA在Chaotropic鹽濃度為0.5~2M時(shí)穩(wěn)定存在于溶液中。相反，RNA、小分子DNA如單鏈DNA、DNA片段，在濃度為2~5M時(shí)穩(wěn)定純?cè)谟谌芤后w系中。上述螯合劑是一種能夠與Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zr^+等金屬離子相結(jié)合的復(fù)合物。螯合劑中至少有兩個(gè)的非金屬離子與游離金屬陽離子形成共價(jià)鍵并與其結(jié)合，與螯合劑結(jié)合的金屬離子將不再游離于溶液體系中。當(dāng)溶液體系中有螯合劑存在時(shí)，會(huì)降低溶液中金屬離子的濃度。游離金屬離子濃度的降低使核酸酶失活，能夠有效防止DNA被核酸酶降解、起到保護(hù)DNA完整性的作用。很多可供使用的螯合劑，不僅限于EDTA、EGTA、CDTA。上述的試劑制成的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所提供的試劑及試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)從各種類型生物樣本(血液、血斑、精液、精斑、毛發(fā)、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑、脫落細(xì)胞等接觸性檢材、腐敗陳舊檢材)中提取、純化DNA。且能夠同時(shí)滿足常規(guī)及微量DNA的樣本的提取要求。利用本發(fā)明試劑純化所得的DNA無需進(jìn)一步純化，即可應(yīng)用于STR復(fù)合擴(kuò)增、DNA測(cè)序、DNA定量等下游分析操作。本發(fā)明的試劑及其試劑盒系統(tǒng)提取的DNA特別適合應(yīng)用于PCR擴(kuò)增(STR、DNA測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等)。本發(fā)明的有益效果如下整體操作簡(jiǎn)單、快速；廣泛的生物樣品適用范圍，能夠?qū)崿F(xiàn)大多數(shù)生物樣品的DNA提?。涣呀庑Ч?，保證細(xì)胞的充分裂解以釋放DNA;純化能力強(qiáng)，能夠在混合有大量PCR抑制劑或污染物的樣本中得到足夠純且可完全滿足于下游PCR、DNA測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量等操作的DNA;提取效率高。能夠達(dá)到90%以上的提取效率，最大化避免DNA在提取操作過程的損失；將該發(fā)明提供的試劑和方法應(yīng)用于已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品的提取，經(jīng)過整個(gè)提取過程，通過以下公式計(jì)算得到提取效率(洗脫得到的DNA量(ng)/加入DNA標(biāo)準(zhǔn)品(G1471，Promega公司)總量(ng)能夠有效提高痕量、降解等微量DNA生物樣品的STR分型成功率；靈活的試劑體系，通過擴(kuò)大試劑的操作體系，可實(shí)現(xiàn)大體積樣本中所含微量DNA樣本的富集；整個(gè)操作能夠避免離心操作，可適用用于各種DNA自動(dòng)化提取操作平臺(tái)。圖1為采用實(shí)施例1的試劑和方法提取DNA的效果驗(yàn)證圖，其中圖1A是微量血液的DNASTR分型圖譜，圖1B是熒光定量PCR電泳圖譜。圖2為3X3mm血斑(FTA卡)STR分型圖譜。圖3為棉簽上血斑(2ul抗凝血)STR分型圖譜。圖4為2u1液態(tài)抗凝血與PCR抑制劑等混合在無色棉布上形成血斑的STR圖譜。圖5為2y1液態(tài)抗凝血滴在牛仔褲形成血斑的STR分型圖譜。圖6為1n1精液在無色棉布上形成精斑的STR分型圖譜。圖7為50u1唾液滴在棉簽上形成的口腔拭子的STR分型圖譜。圖8為煙蒂STR分型圖譜。圖9為自然脫落毛發(fā)STR分型圖譜。圖10為人體組織塊的DNATyper15STR分型圖譜。圖11為手機(jī)上的脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖12為毛衣上的脫落細(xì)胞STR分型圖譜。v圖13為錢包上脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖14為杯口脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖15為鍵盤脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖16為腐敗血斑STR分型圖譜。圖17為腐敗組織STR分型圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、提取純化微量血液中的DNA以及效果驗(yàn)證一、提取純化微量血液中的DNA以及STR復(fù)合擴(kuò)增分析1、試劑試劑如下預(yù)處理裂解液pH為7.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)10raMTris-HC1，0.5g/100ml的十二烷基磺酸鈉(SDS)，1mM的EDTA和50mM的NaCl水溶液，0.5mg/ml的蛋白酶K。裂解結(jié)合液:pH為6.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50mM的Tris-HC1，3M的異硫氰酸胍，1%(體積百分比)的TritonX-IOO，0.5g/100ml的3-(3-月旦胺丙基)-二甲氨基-l-丙磺酸(CHAPS)，10mM的EDTA以及15%(體積百分含量)的乙醇。洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4M的鹽酸胍，25%(體積百分含量)的乙醇和lOraM的EDTA。洗滌液II:75%(體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是10mM的Tris-HC1，lmM的EDTA。懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級(jí)硅包被磁性微球(直徑是60nm)(奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司)為50mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA1)預(yù)處理在1.5ml離心管中首先加入100ul預(yù)處理裂解液，然后將0.lul液態(tài)抗凝血加入預(yù)處理裂解液中，渦旋振蕩，56t:溫浴30min。充分振蕩后，通過離心去除載體(指生物細(xì)胞所粘附或附著的固體物質(zhì))，得到粗裂解液。2)核酸吸附于固相載體往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液(加入量為10ul濃度為50mg/ml的溶液)和300nl的裂解結(jié)合液，形成了磁性納米微球-DNA的復(fù)合體，該復(fù)合體在粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中。3)復(fù)合體分離將離心管漩渦振蕩后，放于磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場(chǎng)力的作用下，將步驟2)中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體從粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中分離出。4)洗滌往離心管中加入500y1洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體；往離心管中加入500ul洗滌液n，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體，重復(fù)本操作一次。洗滌可以將結(jié)合在固相載體(磁性納米微球)上的核酸之外的物質(zhì)去除。5)洗脫在洗滌結(jié)束后，用20ul槍頭吸干殘留液體，室溫晾干5-10min(室溫超過30"C時(shí)，晾干5min即可；室溫低于3(TC時(shí)晾干7-IO分鐘，但最多不可超過10min)。然后往離心管中加入30ul的洗脫液，65。C溫浴5-8min，磁分離，吸取DNA，4。C或-20。C保存。3、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將實(shí)施例1提取的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增，復(fù)合擴(kuò)增采用的是市售的商業(yè)STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒(如美國ABI公司的Id試劑盒)。然后用3130型遺傳分析儀檢測(cè)，結(jié)果如圖1A所示，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。二、提取純化微量血液中的DNA以及濃度檢測(cè)1、提取DNA從不同體積(l、2、3、4和5ul)的液態(tài)抗凝血中提取DNA。提取的方法與上述步驟一相同，其區(qū)別在于所用試劑的量提取l、2、3、4lU液態(tài)抗凝血中的DNA的方法與上述步驟一相同，并且所用的預(yù)處理裂解液均是100tll;磁珠懸浮液均是10ul;裂解結(jié)合液均是300ul;洗滌液I均是500ul;洗滌液II均是500ul;洗脫液均是30ul。提取5P1液態(tài)抗凝血中的DNA，所用的預(yù)處理裂解液200u1;磁珠懸浮液20ul;裂解結(jié)合液600ul;洗滌液I5(K)ul;洗滌液II500ul;洗脫液50ul。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(QuantifierHuman,ABI公司)和Qubif熒光定量系統(tǒng)檢測(cè)所提取的DNA的濃度，結(jié)果如表l所示，該試劑盒整體提取效率高。表l還顯示采用兩種不同的定量方法(實(shí)時(shí)熒光定量PCR和染料定量)，兩種方法定量結(jié)果相當(dāng)，表明DNA完整性卓越，表明DNA在提取的過程中DNA斷裂極少。表l.不同體積液態(tài)抗凝血中提取的DNA的濃度檢測(cè)結(jié)果血液體積(ul)DNA提取量(ng)理論DNA量(ng)QuantifierHumanQubi嚴(yán)熒光定量130.2531.2033261.3161.42663100.5298.69994135.12136.081325167.11165.34165三、DNA提取效率評(píng)價(jià)采用300ngDNA標(biāo)準(zhǔn)品(G1471,Promega公司)作為初始DNA(60ul)，采用實(shí)施例1步驟一提供的試劑和方法進(jìn)行提取，通過DNA熒光定量方法檢測(cè)出最終回收的DNA量，并按照公式提取效率=洗脫得到的DNA回收量(ng)/加入DNA標(biāo)準(zhǔn)品的量(300ng)計(jì)算出DNA提取效率。其中，熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下1)配制7份含300ngDNA(30ul體系)的標(biāo)準(zhǔn)品，其中6份作為樣本，采用本發(fā)明的試劑和方法進(jìn)行提取。余下一份作為陽性對(duì)照，與其余6份同樣的標(biāo)準(zhǔn)品在DNA提取后進(jìn)行電泳比較；2)為了便于比較，6個(gè)提取樣本仍然采用30ul體系洗脫；3)在獲得6個(gè)30ulDNA樣本后，最終在每個(gè)30體系中同樣取20ul樣本，上樣并進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳圖如圖IB(M為分子量Marker(A/HindlllDNA分子量Marker),其分子量范圍500bp-23kb;1-6為該專利提供試劑和方法提取得到的DNA(在30ul體系中取20ul電泳)；陽性對(duì)照為含有300ngDNA標(biāo)準(zhǔn)品(在30ul體系中取20ul電泳)所示，通過1-6號(hào)樣本和陽性對(duì)照的電泳結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)1-6號(hào)樣本在DNA電泳條帶的亮度、寬度和位置等方面與陽性對(duì)照樣本基本一致，表明在提取過程中DNA損失小，DNA提取效率高，所提取DNA完整性好。而且，DNA熒光定量結(jié)果表明該發(fā)明提供的試劑和方法DNA提取效率高于90%。定量結(jié)果如表2所示，DNA提取效率高達(dá)93.67%。表2.DNA提取效率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2、提取純化血斑中的DNA以及效果驗(yàn)證將FTA卡上3X3mm血斑作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化血斑中的DNA1、試劑試劑如下預(yù)處理裂解液pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50mMTris-HCl，3g/100ml的十二烷基磺酸鈉(SDS)，50mM的CDTA和100mM的NaCl水溶液，0.2mg/ml的蛋白酶K。裂解結(jié)合液pH為7.0，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)100mM的Tris-HC1，5M的異硫氰酸胍，5%(體積百分比)的TritonX-100，2g/100ml的3-(3-膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，50mM的EDTA以及20%(體積百分比)的乙醇。洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)5M的鹽酸胍，35%(體積百分含量)的乙醇和50mM的EDTA。洗滌液II:75%(體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是10mM的Tris-HC1,lmM的EDTA。磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級(jí)硅包被磁性微球(直徑是200nra)(奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司)為50mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA1)預(yù)處理在1.5ml離心管中首先加入200ul預(yù)處理裂解液，然后將FTA卡上3X3rara血斑加入預(yù)處理裂解液中，渦旋振蕩，56'C溫浴30min。充分振蕩后，通過離心去除載體(指生物細(xì)胞所粘附或附著的固體物質(zhì))，得到粗裂解液。2)核酸吸附于固相載體往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液(加入量為20iU濃度為50mg/ral的溶液)和600ii1的裂解結(jié)合液，形成了磁性納米微球-DNA的復(fù)合體，該復(fù)合體在粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中。3)復(fù)合體分離將離心管漩渦振蕩后，放于磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場(chǎng)力的作用下，將步驟2)中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體從粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中分離出。4)洗滌往離心管中加入500ul洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體；重復(fù)本操作一次往離心管中加入500ul洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體，重復(fù)本操作一次。洗滌可以將結(jié)合在固相載體(磁性納米微球)上的核酸之外的物質(zhì)去除。5)洗脫在洗滌結(jié)束后，用20ul槍頭吸干殘留液體，室溫晾干5-10min(室溫超過30。C時(shí)，晾干5min即可；室溫低于30'C時(shí)晾干7-IO分鐘，但最多不可超過10min)。然后往離心管中加入50ul的洗脫液，65。C溫浴5-8min，磁分離，吸取DNA，4r或-20。C保存。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖2所示，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。實(shí)施例3、提取純化血斑中的DNA以及效果驗(yàn)證將1抗凝血滴在棉簽上的樣品作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化DNA1、試劑試劑如下預(yù)處理裂解液pH為8.5，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)100mM磷,(100mMNaH2P04，20mMNaCl，pH8.2)，5.0g/100ml的十二烷基肌氨酸鈉(SLS)，100niM的EGTA和150mM的NaCl水溶液，5.0mg/ml的蛋白酶K。裂解結(jié)合液pH為7.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)150mM的Tris-HCl，8M的硫氰酸胍，10%(體積百分比)的Tween20，4.0g/100ml的3-(3-膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，lOOraM的EGTA以及30%(體積百分含量)的異丙醇。洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)6M的硫氰酸胍，50%(體積百分含量)的乙醇和100mM的EDTA。洗滌液II:80%(體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是20mM的Tris-HC1，2mM的EDTA。磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級(jí)硅包被磁性微球(直徑是600nm)(奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司)為50mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA1)預(yù)處理在1.5ml離心管中首先加入200ul預(yù)處理裂解液，然后將滴在棉簽上的2ul液態(tài)抗凝血加入預(yù)處理裂解液中，渦旋振蕩，56。C溫浴30min。充分振蕩后，通過離心去除載體(指生物細(xì)胞所粘附或附著的固體物質(zhì))，得到粗裂解液。2)核酸吸附于固相載體往步驟1)得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液(加入量為20Ul濃度為50mg/ml的溶液)和600u1的裂解結(jié)合液，形成了磁性納米微球-DNA的復(fù)合體，該復(fù)合體在粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中。3)復(fù)合體分離將離心管漩渦振蕩后，放于磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場(chǎng)力的作用下，將步驟2)中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體從粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中分離出。4)洗滌往離心管中加入500nl洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體；重復(fù)本操作一次往離心管中加入500ul洗滌液I1，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體，重復(fù)本操作一次。洗滌可以將結(jié)合在固相載體(磁性納米微球)上的核酸之外的物質(zhì)去除。5)洗脫在洗滌結(jié)束后，用20ul槍頭吸干殘留液體，室溫晾干5-10min(室溫超過30°(3時(shí)，晾干5min即可；室溫低于3(TC時(shí)晾干7-IO分鐘，但最多不可超過10min)。然后往離心管中加入50ix1的洗脫液，65。C溫浴5-8min，磁分離，吸取DNA，4。C或-20。C保存。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖3所示，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pull叩峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法能夠有效提取到載體表面所粘附細(xì)胞內(nèi)的DNA，得到的DNA純度高，完整性好。實(shí)施例4、提取純化血斑中的DNA以及效果驗(yàn)證將2ul抗凝血、PCR抑制劑滴在棉布上形成的血斑作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA，其中，該抑制劑為lul血紅素(0.5mM)和1ul腐殖酸(2.5mg/ml)組成的混合物。一、提取純化DNA1、試劑試劑如下-預(yù)處理裂解液pH為7.7，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)30raMTris-HC1，2.0g/100ml的十二烷基肌氨酸鈉(SLS)，30mM的EGTA和80mM的NaCl水溶液，2.0mg/ml的蛋白酶K。裂解結(jié)合液:pH為7.1，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì):80mM的Tris-HCl，4M的硫氰酸胍，2%(體積百分比)的Tween20，1.5g/100ml的3-(3-膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，30rnM的EGTA以及24%(體積百分含量)的異丙醇。洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4.4M的鹽酸胍，30%(體積百分含量)的乙醇和30mM的EDTA。洗滌液II:80%(體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是lmM的EDTA。磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級(jí)硅包被磁性微球(直徑是1000nm)(奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司)為50mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA1)預(yù)處理在1.5ml離心管中首先加入200ul預(yù)處理裂解液，然后將本實(shí)施例的生物樣品加入預(yù)處理裂解液中，渦旋振蕩，56X:溫浴30min。充分振蕩后，通過離心去除載體(指生物細(xì)胞所粘附或附著的固體物質(zhì))，得到粗裂解液。2)核酸吸附于固相載體往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液(加入量為20ul濃度為50mg/ml的溶液)和600u1的裂解結(jié)合液，形成了磁性納米微球-DNA的復(fù)合體，該復(fù)合體在粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中。3)復(fù)合體分離將離心管漩渦振蕩后，放于磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場(chǎng)力的作用下，將步驟2)中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體從粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中分離出。4)洗滌往離心管中加入500ul洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體；重復(fù)本操作一次往離心管中加入500ui洗滌液n，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體，重復(fù)本操作一次。洗滌可以將結(jié)合在固相載體(磁性納米微球)上的核酸之外的物質(zhì)去除。5)洗脫在洗滌結(jié)束后，用20ul槍頭吸干殘留液體，室溫晾干5-10min(室溫超過30'C時(shí)，晾干5min即可；室溫低于3(TC時(shí)晾干7-IO分鐘，但最多不可超過10min)。然后往離心管中加入50ul的洗脫液，65。C溫浴5-8min，磁分離，吸取DNA,4。C或-20。C保存。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖4所示，STR峰型較好，峰值較高，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例5、提取純化血斑中的DNA以及效果驗(yàn)證將2ul抗凝血滴在牛仔褲上作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化DNA1、試劑試劑如下預(yù)處理裂解液pH為8.3，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)70raMTris-HC1，4g/100ml的十二烷基肌氨酸鈉(SLS)，70mM的EGTA和120raM的NaCl水溶液，4mg/ml的蛋白酶K。裂解結(jié)合液pH為7.3，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)120mM的Tris-HC1，6M的鹽酸胍，3%(體積百分含量)的Tween20，3g/100ml的3-(3-膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，70rnM的EGTA以及26%(體積百分含量)的聚乙二醇。洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)5.6M的碘化鉀，45%(體積百分含量)的乙醇和70mM的EDTA。洗滌液II:75%(體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是10mM的Tris-HC1。磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級(jí)硅包被磁性微球(直徑是1200nm)(奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司)為50mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA提取純化DNA的方法與實(shí)施例3提供的方法的區(qū)別在于提取純化DNA的試劑不同，其余完全相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖5所示，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例6、提取純化精斑中的DNA以及效果驗(yàn)證將1"1精液滴在無色棉布上作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。精斑的提取與常規(guī)檢材存在微小差異，即在預(yù)處理裂解液中需加入DTT(二硫蘇糖醇)才能正常提取。一、提取純化DNA1、試劑試劑如下預(yù)處理裂解液pH為7.6，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)90mMTris-HC1，4.5g/100ml的十二烷基磺酸鈉(SDS)，6mM的EDTA和70mM的NaCl水溶液，1.0mg/ml的蛋白酶K，0.05MDTT(二硫蘇糖醇)。裂解結(jié)合液:pH為7.2，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì):20mM的Tris-HCl，7M的硫氰酸胍，2.5%(體積百分比)的Tween21，1.0g/100ml的3-(3-膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，20rnM的EGTA以及18%(體積百分含量)的異丙醇。洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4.6M的高氯酸鈉，40%(體積百分含量)的乙醇和15mM的EDTA。洗滌液II:75%乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是10慮的Tris-HCl，lmM的EDTA。磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級(jí)硅包被磁性微球(直徑是50nm)(奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司)為100mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA1)預(yù)處理在1.5ml離心管中首先加入200ul預(yù)處理裂解液，然后將本實(shí)施例的生物樣品加入預(yù)處理裂解液中，渦旋振蕩，56"C溫浴30min。充分振蕩后，通過離心去除載體(指生物細(xì)胞所粘附或附著的固體物質(zhì))，得到粗裂解液。2)核酸吸附于固相載體往步驟1)得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液(加入量為20yl濃度為100mg/ml的溶液)和600ul的裂解結(jié)合液，形成了磁性納米微球-DNA的復(fù)合體，該復(fù)合體在粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中。3)復(fù)合體分離將離心管漩渦振蕩后，放于磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場(chǎng)力的作用下，將步驟2)中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體從粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中分離出。4)洗滌往離心管中加入500ul洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體；重復(fù)本操作一次往離心管中加入500ul洗滌液n，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體，重復(fù)本操作一次。洗滌可以將結(jié)合在固相載體(磁性納米微球)上的核酸之外的物質(zhì)去除。5)洗脫在洗滌結(jié)束后，用20ul槍頭吸干殘留液體，室溫晾干5-10min(室溫超過30t:時(shí)，晾干5min即可；室溫低于3(TC時(shí)晾干7-10分鐘，但最多不可超過10min)。然后往離心管中加入50ul的洗脫液，65。C溫浴5-8min，磁分離，吸取DNA，4。C或-2(TC保存。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖6所示，STR圖譜顯示STR峰值較高，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例7、提取純化唾液中的DNA以及效果驗(yàn)證將50u1唾液滴在棉簽上形成的口腔拭子作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化DNA1、試劑所用試劑與實(shí)施例2的區(qū)別在于所述氯化鈉水溶液的濃度為130mM，其余試劑完全相同。2、用步驟l的試劑提取純化DNA用步驟1的試劑提取純化DNA的步驟與實(shí)施例2提供的步驟以及所用的各試劑的量完全相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖7所示，STR圖譜顯示STR峰值較高，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例8、提取純化煙蒂中的DNA以及效果驗(yàn)證將煙蒂作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化DNA1、試劑所用試劑與實(shí)施例7的區(qū)別在于所用氯化鈉溶液的濃度為90rnM，其余試劑完全相同。2、用步驟l的試劑提取純化DNA提取方法與實(shí)施例7相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖8所示，STR圖譜顯示STR峰值較高，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例9、提取純化毛發(fā)中的DNA以及效果驗(yàn)證將自然脫落的毛發(fā)的毛根部分(總長(zhǎng)度約為1-3nim)作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。毛發(fā)的提取與常規(guī)檢材還存在差異，即在預(yù)處理裂解液中需加入DTT(二硫蘇糖醇)才能正常提取。一、提取純化DNA1、試劑所用試劑與實(shí)施例6的區(qū)別在于所用氯化鈉溶液的濃度為110mM，其余試劑完全相同。2、用步驟1的試劑提取純化DNA提取步驟與實(shí)施例6相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖9所示，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例10、提取人體組織中的DNA以及效果驗(yàn)證將人體組織塊(1-2mm3肌肉組織)作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化DNA1、試劑所用試劑與實(shí)施例7的區(qū)別在于所用氯化鈉溶液的濃度為140mM，其余試劑完全相同。2、用步驟1的試劑提取純化DNA提取步驟與實(shí)施例7相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖IO所示，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例11、提取人體脫落細(xì)胞中的DNA以及效果驗(yàn)證將手機(jī)上的脫落細(xì)胞作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。其中，脫落細(xì)胞的獲取步驟包括以下步驟用鑷子取少許棉簽(10-20mg)浸濕后擦拭脫落細(xì)胞所在物體表面，隨后取少許干燥棉簽(10-20mg)重復(fù)擦拭濕潤(rùn)表面，將兩粘附有脫落細(xì)胞的載體一并加入到預(yù)處理裂解液中，渦旋振蕩。一、提取純化DNA1、試劑所用試劑與實(shí)施例l相同。2、用步驟1的試劑提取純化DNA提取步驟與實(shí)施例2相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖ll所示，STR峰值較高，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例12-15實(shí)施例12提取的是毛衣上的脫落細(xì)胞的DNA，實(shí)施例13提取的是錢包上脫落細(xì)胞的DNA，實(shí)施例14提取的是杯口脫落細(xì)胞的DNA，實(shí)施例15提取的是鍵盤脫落細(xì)胞的DNA。實(shí)施例12-15中的脫落細(xì)胞的獲得方法、提取該脫落細(xì)胞的DNA所用的試劑和提取的方法與實(shí)施例ll均相同，其STR復(fù)合擴(kuò)增分析檢測(cè)結(jié)果如圖12、13、14和15所示，STR峰值較高，STR位點(diǎn)完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pull叩峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好并具較好的完整性。實(shí)施例16、腐敗生物樣品DNA提取結(jié)果將3X3mm的腐敗血斑作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化DNA1、試劑所用試劑與實(shí)施例l相同。2、用步驟1的試劑提取純化DNA提取步驟與實(shí)施例2相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖16所示，STR位點(diǎn)完整，無大片段位點(diǎn)丟失現(xiàn)象，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、Pull叩峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，獲得了符合STR復(fù)合擴(kuò)增要求的模板DNA實(shí)施例17、腐敗生物樣品DNA提取結(jié)果將l-2mm3的腐敗組織作為生物樣品，提取純化該樣品中的DNA。一、提取純化DNA1、試劑所用試劑與實(shí)施例l相同。2、用步驟1的試劑提取純化DNA提取步驟與實(shí)施例2相同。二、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將上述步驟得到的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增分析，其方法與實(shí)施例1提供的方法相同，結(jié)果如圖17所示，STR位點(diǎn)完整，無大片段STR位點(diǎn)丟失，分型準(zhǔn)確，無Pullup峰、stutter帶、split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，所得DNA純度高，該試劑能夠在腐敗生物樣本中純化得到相對(duì)完整的DNA片段。權(quán)利要求1、一種提取純化DNA的試劑，由以下物質(zhì)組成預(yù)處理裂解液pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)10-100mM緩沖鹽，0.5-5g/100ml的表面活性劑，1-100mM的螯合劑，50-150mM的可溶性鹽和0.2-4mg/ml的蛋白酶K；裂解結(jié)合液pH＝6.4-7.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20-150mM的緩沖鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10％(體積百分比)的表面活性劑，0.5-4g/100ml的兼性離子去污劑，10-100mM的螯合劑以及15-30％(體積百分含量)的醇；洗滌液I溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4-6M的Chaotropic鹽，25-50％(體積百分含量)的醇和10-100mM的螯合劑；洗滌液II75-80％(體積百分含量)乙醇水溶液；洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是0-20mM的Tris-HCl，0-2mM的EDTA；磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液的成分如下直徑為50-1200nm的納米級(jí)硅包被磁性微球50-100mg，其余為水。2、一種提取純化DNA的試劑，由以下物質(zhì)組成預(yù)處理裂解液pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)10-100mM緩沖鹽，0.5-5g/100ml的表面活性劑，1-100mM的螯合劑，50-150mM的可溶性鹽和0.2-4mg/ml的蛋白酶K和0.025-0.05M的二硫蘇糖醇；裂解結(jié)合液pH=6.4-7.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20-150mM的緩沖鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10%(體積百分比)的表面活性劑，0.5-4g/100ml的兼性離子去污劑，10-100mM的螯合劑以及15-30%(體積百分含量)的醇；洗滌液I:溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4-6M的Chaotropic鹽，25-50%(體積百分含量)的醇和lO-lOOmM的螯合劑；洗滌液II:75-80%(體積百分含量)乙醇水溶液；洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是0-20mM的Tris-HC1，0-2mM的EDTA;磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液的成分如下直徑為50-1200mn的納米級(jí)硅包被磁性微球50-100mg，其余為水。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其特征在于所述預(yù)處理裂解液中，緩沖鹽的濃度為20-80mM，表面活性劑的濃度為0.5-4g/100ml，螯合劑的濃度為20-80raM，可溶性鹽的濃度為50-130mM，蛋白酶K的濃度為0.2-2mg/ml;所述可溶性鹽的濃度優(yōu)選為80-100mM，蛋白酶K的濃度優(yōu)選為0.2-1mg/ml;所述預(yù)處理裂解液中的表面活性劑為陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑，優(yōu)選是陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為十二垸基磺酸鈉或十二烷基肌氨酸鈉；所述可溶性鹽溶液為NaCl水溶液。4、根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的試劑，其特征在于:所述裂解結(jié)合液中，Chaotropic鹽的濃度為4-6M，緩沖鹽的濃度為50-120mM，螯合劑的濃度為20_80mM，表面活性劑的濃度為2_8%(體積百分比)，兼性離子去污劑的濃度為1-3g/100ml，醇的濃度為20-28%(體積百分含量)；所述裂解結(jié)合液中的表面活性劑優(yōu)選用非離子表面活性齊U，所述非離子表面活性劑為TritonX-IOO、Tween20、Tween21、Tween.40、Tween60、Tween80、Tween85、NP-40、Brij30或Span20;所述兼性離子去污劑是3陽(3-膽胺丙基)-二甲氨基-l-丙磺酸；所述醇是乙醇、異丙醇或聚乙二醇。5、根據(jù)權(quán)利要求l-4任一所述的試劑，其特征在于所述洗滌液I中，Chaotropic鹽的濃度為4.2-5.8M，醇是30-45%(體積百分含量)的乙醇，螯合劑的濃度為20-80raM。6、根據(jù)權(quán)利要求l-5任一所述的試劑，其特征在于所述洗滌液11優(yōu)選為75%(體積百分比)乙醇水溶液。7、根據(jù)權(quán)利要求l-6任一所述的試劑，其特征在于所述洗脫液中的Tris-HCl的濃度是10mM、EDTA的濃度是lmM，所述洗脫液pH為8.0。8、根據(jù)權(quán)利要求l-7任一所述的試劑，其特征在于所述每ml磁珠懸浮液中的納米級(jí)硅包被磁性微球?yàn)?0mg。9、根據(jù)權(quán)利要求l-8任一所述的試劑，其特征在于在所述試劑盒中，所述緩沖鹽為Tris-HC1、磷酸鹽或HEPES鹽；所述螯合劑為檸檬酸鹽、EDTA、EGTA或CDTA;所述Chaotropic鹽為異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍、尿素、碘化鈉、碘化鉀、氯化鋰、高氯酸鈉或三氯醋酸鹽，所述Chaotropic鹽優(yōu)選是異硫氰酸胍、硫氰酸胍或鹽酸胍，更優(yōu)選是異硫氰酸胍。10、權(quán)利要求1-9任一所述的試劑制成的試劑盒。全文摘要本發(fā)明公開了一種提取純化DNA的試劑。該試劑由以下物質(zhì)組成預(yù)處理裂解液pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)10-100mM緩沖鹽，0.5％-5％表面活性劑，1-100mM螯合劑和50-150mM可溶性鹽，0.2-4mg/ml蛋白酶K；裂解結(jié)合液pH＝6.4-7.4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20-150mM緩沖鹽，3-8MChaotropic鹽，1-10％表面活性劑，0.5-4％兼性離子去污劑，10-100mM螯合劑以及15-30％醇；洗滌液I溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4-6MChaotropic鹽，25-50％醇和10-100mM螯合劑；洗滌液II為75％乙醇水溶液；洗脫液為TE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH為8.0)；磁珠懸浮液為納米級(jí)硅包被磁性微球(50-100mg/ml)。采用該試劑提取DNA效率高達(dá)93.67％。文檔編號(hào)C12N15/10GK101613696SQ20091009033公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年8月5日優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日發(fā)明者健葉,姜伯瑋,趙興春申請(qǐng)人:公安部物證鑒定中心