專利名稱：：一種獲得est-ssr標記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種獲得EST-SSR標記的方法。技術(shù)背景SSR簡單序列重復標記(Simplesequencer印eat,簡稱SSR標記)，也叫微衛(wèi)星序列重復，是長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，其重復單位一般為2-6個核苷酸，它們廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，而且分布比較均勻，平均每10kb的DNA序列中就會出現(xiàn)一個微衛(wèi)星序列，SSR標記因為具有共顯性、高度重復性、高度豐富的多態(tài)性等優(yōu)點，成為構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學、進行分子標記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測、目標性狀分子標記篩選和法醫(yī)鑒定的理想工具。表達序列標簽(ExpressedSequenceTag,EST)中也含有SSR序列，被稱為EST-SSR，基于EST的SSR標記(即EST-SSR標記)是近年發(fā)展起來的新型分子標記，與基因組SSR標記(即genomic-SSR標記)相對應(yīng)。與基因組SSR標記相比，EST-SSR標記有其獨特的優(yōu)越性從標記開發(fā)的角度來說，省去了SSR引物開發(fā)過程中的克隆和測序步驟，充分利用了現(xiàn)有測序數(shù)據(jù)，降低了開發(fā)成本；從應(yīng)用的效果角度考慮，EST-SSR來自基因轉(zhuǎn)錄區(qū)段，可以反映出基因表達的信息，為功能基因提供"絕對"的標記，可直接定位決定重要表型性狀的等位基因(ChenX，SalaminiF，GebhardtC.2001.Apotatomolecularfunctionmapforcarbohydratemetabolismandtransport.TheoreticalandAppliedGenetics.102(2):284-295);由于EST-SSR兩翼序列保守性好，因此在不同物種間有較好的通用性(CordeiroGM，CasuR，MclntyreCL，etal.2001.Microsatellitemarkersfromsugarcane(Saccharumspp.)ESTscrosstransferabletoerianthusandsorghum.PlantSci.160:1115-1123;DecroocqV，F(xiàn)aveMG,HagenL，etal.2003.DevelopmentandtransferabilityofapricotandgrapeESTmicrosatellitemarkersacrosstaxa.TheorApplGenet.106(5):912-922)。EST-SSR標記的諸多優(yōu)點和許多物種的大量EST序列獲得為EST-SSR標記開發(fā)提供基礎(chǔ)，然而不同的開發(fā)方法對標記開發(fā)的效率有一定影響。研究表明，10X的mRNA3，端有重復序列，這可以作為SSR標記(HateyF，YanoM，ShomuraA，etal.1998.Expressedsequencetagsforgenes:areview.Gnent.Sel.Evol.30(1):521-541;YammanotoK，SasakiT.1997.LargescaleESTsequencinginrice.PlantMolecularBiology,35(1):135-144)。研究表明，由于EST-SSR標記來自高度保守的基因轉(zhuǎn)錄區(qū)，其多態(tài)性水平低于基因組SSR標記(ScottKD，EgglerP，SeatonG，etal.2000.AnalysisofSSRsderivedfromgr即eESTs.Theor.Appl.Genet,100:723-726)。來自3，EST的SSR標記高于來自5，EST的SSR標記(ScottKD,EgglerP，SeatonG，etal.2000.AnalysisofSSRsderivedfromgrapeESTs.Theor.Appl.Genet,100:723-726)，3'EST可能包含cDNA的3'轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(3'UTR)，這個區(qū)域的變異頻率要遠大于5'EST,所以大多數(shù)研究是從3'EST入手開發(fā)EST-SSR以提高出現(xiàn)多態(tài)性標記的可能性，但這種方法容易錯過存在于5'EST的SSR標記；也有報道認為SSR隨著重復次數(shù)的增多，其產(chǎn)生多態(tài)性的可能性會增大，所以許多研究把目標鎖定SSR重復次數(shù)達到一定的數(shù)量以上的序列，而這種方法也會錯過一些具有多態(tài)性的SSR短序列?？傊?，目前的SSR標記的開發(fā)方法都存在效率不高、費時費力的問題。目前，還沒有一種高效開發(fā)EST-SSR標記方法的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種獲得EST-SSR標記的方法。本發(fā)明所提供的獲得EST-SSR標記的方法，包括如下步驟1)獲得基因組內(nèi)含有簡單序列重復的EST序列；2)在步驟1)得到的含有簡單序列重復的EST序列中，將含有相同簡單序列重復單元的EST序列歸為一類；3)將步驟2)得到的同類的EST序列進行序列拼接，得到簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群、簡單序列重復單元數(shù)目無變異的重疊群和沒有形成重疊群的EST序列；4)根據(jù)步驟3)中簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，再進行引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物，即為EST-SSR標記。上述方法中，在步驟3)后，還可包括如下步驟根據(jù)步驟3)中簡單序列重復單元數(shù)目無變異的重疊群內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，進行引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物。上述方法中，在步驟3)后，還可包括如下步驟根據(jù)步驟3)中沒有形成重4疊群的EST序列內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，進行引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物。上述方法中，所述基因組可為植物基因組、動物基因組或微生物的基因組。上述方法中，所述植物為大豆。在可獲得一定數(shù)量的EST數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的方法適用于所有物種EST-SSR標記的開發(fā)，具體如大豆；EST數(shù)據(jù)越豐富，利用本方法的開發(fā)標記的效果越好。本發(fā)明的另一個目的是提供一種EST-SSR標記，其中的一條序列如序列表中序列10所示，另一條序列如序列表中序列11所示。上述所述EST-SSR標記在構(gòu)建SSR多態(tài)性圖譜中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種大豆SSR多態(tài)性圖譜。本發(fā)明所提供的大豆SSR多態(tài)性圖譜，是按照包括如下步驟的方法得到的1)提取大豆的基因組DNA;2)以基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求3所述的EST-SSR標記進行PCR擴增；3)將PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得到大豆SSR多態(tài)性圖譜。在眾多EST-SSR序列中開發(fā)SSR多態(tài)性標記，選擇用以設(shè)計引物序列的策略對于開發(fā)效率是一個很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。本發(fā)明表明，單純區(qū)分3'、5'EST-SSR序列，并選擇公認變異頻率較高的3'EST-SSR序列設(shè)計引物，其效果并不理想，多態(tài)性的比率并不高，同時不能充分利用5'EST-SSR序列的開發(fā)潛力。相比之下，利用冗余序列拼接尋找可能的SSR變異位點開發(fā)多態(tài)性標記的策略不必區(qū)分EST序列類型，而且鑒定出多態(tài)性引物的可能性更大，從而提高了從EST數(shù)據(jù)資源中開發(fā)SSR標記的效率。本發(fā)明在常規(guī)EST-SSR開發(fā)方法的基礎(chǔ)上，對序列的前處理環(huán)節(jié)進行改進，有效的利用EST數(shù)據(jù)庫高度冗余的特性，尋找含有潛在的SSR變異位點的冗余EST序列群，將其拼接成序列重疊群后進行引物設(shè)計及引物多態(tài)性檢測，與比常規(guī)方法相比，開發(fā)效率可提高2-4倍，減少工作量和經(jīng)費消耗，從而縮短了研發(fā)時間、降低了開發(fā)成本，同時降低了錯過多態(tài)性SSR位點的可能性。本發(fā)明所提供的標記可用于構(gòu)建動植物的SSR多態(tài)性圖譜，進而用于動植物的QTL定位，尋找與其對應(yīng)的性狀；標記還可用于研究動植物系統(tǒng)進化關(guān)系；標記還可用來鑒定物種。因此，本發(fā)明的方法及標記將有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為拼接結(jié)果及簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群的選擇示意圖。圖2大豆SSR多態(tài)性圖譜。(圖中泳道編號分別與表l中品種編號對應(yīng))具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例l、獲得大豆的EST-SSR標記一、引物的設(shè)計1、獲取大豆基因組內(nèi)的EST序列從NCBI生物信息資源數(shù)據(jù)庫中下載大豆EST序列，共獲得了458220條大豆EST序列。2、搜索含有SSR(即簡單序列重復)的EST序列用SSRIT(SimpleSequenceR印eatIdentificationTool)軟件對步驟l得到的所有EST序列進行在線搜索，得到含有簡單重復序列的EST序列(稱作SSR-EST序列)；搜索的標準為二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復單元的重復次數(shù)分別大于或等于6、5、4、4、4。3、將SSR-EST序列進行歸類根據(jù)簡單序列重復單元種類的不同，將步驟2得到的所有SSR-EST序列進行分類，將含有相同種類簡單序列重復單元的SSR-EST序列歸為一類。如將含有AT重復單元的序列歸為一類。4、同類SSR-EST序列拼接使用軟件CExpress對歸為同類的SSR-EST序列進行拼接，冗余SSR-EST序列被拼接在一起，形成重疊群。得到簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群、簡單序列重復單元數(shù)目無變異的重疊群和沒有形成重疊群的EST序列。5、根據(jù)SSR重復數(shù)目變異的重疊群進行設(shè)計引物從拼接結(jié)果中選擇具有SSR重復數(shù)目變異的重疊群(Contig)，根據(jù)重疊群內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物(圖l)，得到EST-SSR標記。再根據(jù)沒有形成重疊群的EST序列內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，得到EST-SSR標記。此步驟中，將每個SSR重復數(shù)目變異的重疊群(Contig)均進行引物設(shè)計，包括同類的SSR-EST序列形成幾個contig、且各contig內(nèi)的重復數(shù)目都是有變異的情況；如簡單序列重復單元為AT，形成了2個contig，第一個contig內(nèi)AT重復數(shù)目有5、6的，第二個contig內(nèi)AT重復數(shù)目有7、8的，則兩個contig都進行引物設(shè)計。每個contig中重復序列兩端的側(cè)翼序列都是很保守的，根據(jù)保守序列進行引物設(shè)計。二、引物多態(tài)性檢測(一)材料所用的植物材料如表l所示，表l中的所有品種均可以從國家種質(zhì)庫獲得。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(二)實驗方法1、大豆基因組DNA的提取采用CTAB法提取植物材料的基因組DNA。(1)CTAB提取液的配制a)1MTris-HC1(pH8.0):稱取121.1gTris溶于800ml水中，攪拌條件下加入37%濃鹽酸。pH接近8.0時，用稀HC1準確調(diào)至8.0，加入重蒸水至總體積1L，分裝，高壓滅菌。溶于800ml蒸鎦水中。完全溶解后用蒸餾水定容至1L，分裝，高壓滅菌。c)0,5MEDTA(pH8.0):稱取186.1gEDTA-Na2'2H20加入800ml雙蒸水，用磁力攪拌器攪拌，加入NaOH(10M)調(diào)pH至8.0。待EDTA-Na2'2H20完全溶解后，再用稀NaOH準確調(diào)p^8.0，加入雙蒸水定容至lL，滅菌。(2)基因組DNA提取流程取l克新鮮葉片(除去大葉脈)放于液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨均勻至細粉狀。然后轉(zhuǎn)到50ml離心管中，加入15-20ml的65。C預(yù)熱的DNA提取液，混勻后放于65'C水浴鍋中水浴2小時，水浴期間要將離心管每隔約15分鐘左右倒置幾次，使葉片粉末與提取液充分接觸。水浴后，在室溫下冷卻5min，加入15ml氯仿異戊醇(24:1)溶液，倒置幾次。在室溫下，輕輕搖動5-10min。將50ml離心管放入離心機，2000-2800rpm，10min。取上清液，加入15ml氯仿異戊醇(24:1)溶液倒置幾次，重復上次的操作。取上清后，加入50HlRNase(10mg/ml)室溫下放置30min，在加入等體積異丙醇(-2(TC保存)倒置15次以上，靜置30分鐘，將異丙醇倒出，得到白色絮狀沉淀，用70%乙醇洗去抽體液，得到純凈DNA，自然風干后用滅菌的超純水溶解，4。C保存，備用。2、DNA質(zhì)量檢測釆用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。把溶解好的DNA母液稀釋10倍，取出2W加入8W0.25%溴酚藍，在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳檢測，以入DNA(50ng/W)作為標準，設(shè)置濃度梯度，將待測DNA與入DNA比較產(chǎn)物濃度，確定PCR反應(yīng)的最適宜濃度。3、PCR反應(yīng)體系及程序采用梯度PCR方法確定引物的最佳退火溫度(本研究使用TECHNEPCR儀，型號為TC-512)。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測梯度PCR擴增產(chǎn)物。表2梯度PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系(16ul)試劑用量模版DNA(50-100ng)2.4pdPCRbuffer1.6^1MgCl2(25mM)1.2ixldNTP(2.5mM)0.24nlTagDNA合成酶(5units/nl)0.24ial<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>所設(shè)計的引物經(jīng)梯度PCR確定退火溫度之后，用特異退火溫度PCR對引物多態(tài)性驗證材料進行擴增，最后采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物(IOOW恒功率，電泳約l小時)，確定引物多態(tài)性。特異退火溫度PCR體系與梯度PCR相同，其反應(yīng)程序如下表4梯度PCR反應(yīng)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4、電泳檢測方法在16ulPCR產(chǎn)物中加入6ul甲酰胺雙色LoadingBuffer(98%的甲酰胺，10mM的EDTA，0.25%的溴酚藍，0.25%的二甲苯菁)，置于PCR儀中在94'C下變性10min，使產(chǎn)物解鏈。然后立即放入冰水混合物中冷卻。PCR產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠(PA)測序膠上分離，在100W恒功率下電泳約2小時，銀染檢測。電泳儀采用Biolab垂直電泳儀，變性PCR產(chǎn)物進樣量為6ul。具體步驟如下(1)玻璃板清洗及制膠前處理用溫水加上洗滌劑把玻璃板反復擦洗，用蒸餾水沖一遍，再用酒精擦凈并晾干。制膠前用70%酒精擦拭凹口玻璃板，均勻涂抹2%剝離硅烷(10mlR印elSaline溶于490ml三氯甲烷)后；在另一塊玻璃板用70%酒精擦拭后均勻涂抹0.5%(10ulBindingSaline和10ul冰乙酸溶于2ral95%乙醇)，雙板晾干后，進行玻璃板的組裝、灌膠。(2)灌膠把配制好的膠液50ml(含有200W過硫酸銨和20WTEMED)混勻，排出氣泡后沿灌膠口邊緣灌進，邊灌邊輕輕敲打，防止出現(xiàn)氣泡。待膠流動至底部邊緣，插入齒梳(梳齒向外側(cè)平端向內(nèi)側(cè))，靜置至少30min，使膠液充分聚合凝固。(3)電泳拔出梳子，立即用蒸餾水沖洗點樣口，刮去附著在點樣口上多余的膠，插入梳子，點適量LoadingBuffer，預(yù)電泳約20分鐘，加變性后PCR產(chǎn)物6ul，電泳時間依據(jù)SSR擴增產(chǎn)物的分子量加以調(diào)整。(4)固定電泳結(jié)束后取下玻璃板，把玻璃凹口板取下，附著膠體的玻璃板放入固定液中固定20分鐘(固定液100ml冰醋酸和900ml蒸餾水的混合液)。(5)水洗取出固定液中的玻璃板，放入蒸餾水中，水洗IO分鐘。(6)銀染把水洗后的玻璃板放入銀染液中染色20-30分鐘(銀染液1000ml蒸餾水和2ml硝酸銀溶液的混合液)，硝酸銀見光易分解，因此銀染過程中應(yīng)注意避光。(7)水洗蒸餾水水洗7-8秒鐘，洗去膠面殘留的硝酸銀溶液。(8)顯影于上步的水洗槽中把玻璃板迅速取出，放入顯影液中，進行顯影。(顯影液1000ml蒸餾水、30g無水碳酸鈉、200W硫代硫酸鈉溶液和1500W甲醛溶液的混合液)。(9)固定待影像清晰后，取出玻璃板，放入固定液中進行固定。(10)水洗，風干用自來水洗去固定液殘留在膠面的酸味，將膠板置于通風處風干后，統(tǒng)計數(shù)據(jù)。結(jié)果如表5所示。多態(tài)性引物的比率二多態(tài)性引物數(shù)目/所有引物數(shù)目。以獲得的多態(tài)性引物中的l例為例，說明檢測結(jié)果。該多態(tài)性引物(g卩EST-SSR分子標記)的一條序列如序列表中序列10所示，另一條序列如序列表中序列l(wèi)l所示。用該引物對表1中所示材料分別進行PCR擴增，進行多態(tài)性檢測，結(jié)果如圖2所示。實驗設(shè)3次重復，均得到相同的結(jié)果。圖2也就是大豆品種的SSR多態(tài)性圖譜。說明本發(fā)明標記可以用于構(gòu)建大豆SSR多態(tài)性圖譜。表5、來自Contig序列的EST-SSR多態(tài)性統(tǒng)計檢測項目序列數(shù)所有引物數(shù)目多態(tài)引物數(shù)目多態(tài)性引物比率(%)EST總數(shù)目1101105045.45總3'EST27271462.96總5'EST75753648總其他EST88562.5三、EST-SSR標記的可靠性檢測為了驗證所開發(fā)的EST-SSR標記的多態(tài)性確屬SSR序列的重復次數(shù)改變，進行如下多態(tài)性引物在不同基因型上的PCR產(chǎn)物測序比較。從上述開發(fā)的具有多態(tài)性的EST-SSR標記中選擇3對SES71、SES74和SES176;對同一引物，選擇多態(tài)性驗證中擴增產(chǎn)物有長度差異的兩份材料；具體如下以SES71為引物，分別以吉育47、墾鑒l的基因組為模板，PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序；以SES74為引物，分別以紅豐ll、黑農(nóng)44的基因組為模板，PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序；以SES176為引物，分別以Charleston東農(nóng)594的基因組為模板，PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果如下1、引物ses71的源序列〉gi|18729506|gb|BM525336.1|BM525336sal22fl0.ylGm-cl059GlycinesojacDNAcloneSOYBEANCLONEID:Gm-c1059-29715'，mRNAsequenceAATGATTATTCTGAATTGATTTCTTAACCCAAAAAAA(序列1)ses71在吉育47中的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果CCAACAAAACAAGGGCGTAT(序列2)ses71在墾鑒1中的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果:CTCTGGCTCAGCCAACAAAACAAGGGCGTAT(序列3)2、引物ses74的源序列:gi|7028158|gb|AW457941.1|AW457941sh97g07.ylGm-cl016GlycinemaxcDNAcloneGENOMESYSTEMSCLONEID:Gm-c1016-81495，，mRNAsequenceTCTTATTGTACAA(序列4)ses74在紅豐11中的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果:(序列5)ses74在黑農(nóng)44中的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果:AAGTTGT(序歹U6)3、引物SES176的源序列:>gi|7588597|gb|AW704389.1|AW704389sk30e03.ylGm-cl028GlycinemaxcDNAcloneGENOMESYSTEMSCLONEID:Gm-cl028-37015'，mRNAsequenceTACACCATGTTCATATTTGCTNTCTCCATCTTCATGTTCT(序列7)sesl76在Charleston中的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果AATTTAATTTCACTCGTAATTCACTTATCGTGATTGCCGAAT(序列8)Sesl76在東農(nóng)594中的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果:TTCAATTTAATTTCACTCGTAATTCACTTATCGTGATTGCCGAAT(序列9)表6、多態(tài)性引物擴增產(chǎn)物抽樣測序結(jié)果引物名稱引物序列供試材料SSR重復基產(chǎn)物序列元及重復次數(shù)5,ctTTTCCCTCTTCCGCTTTT3'吉育47(tttc)3seqidno.25'ATACGCCCTTGTTTTGTTGG3'墾鑒lCTTTC)6SEQIDNO.35'GTATCAAGCACGGACAGGC3'紅豐11(TTTC)2SEQIDNO.55'ACAACTTATTCAGACCCACCC3'黑農(nóng)44(TTTC)4SEQIDNO.65'GCGGAACAATGAACAAACA3'Charleston(CTTT)3SEQIDno.85'ATTCGGCAATCACGATAAGT3'東農(nóng)594(CTTT)4SEQIDno.9ses71sesl76分析測序結(jié)果，所選三對表現(xiàn)多態(tài)性的引物(SES71，SES74，SES176)分別以三對不同大豆基因型基因組DNA為模板的擴增，其引物序列在測序結(jié)果中均能找到匹配位置，通過測序結(jié)果與源序列進一步對比發(fā)現(xiàn)，三對引物擴增得到的產(chǎn)物序列與他區(qū)域均能完全匹配，說明產(chǎn)物長度多態(tài)來自SSR重復次數(shù)差異，此結(jié)論表明本發(fā)明的SSR標記開發(fā)結(jié)果是可靠的。實施例2:本發(fā)明的EST-SSR標記開發(fā)方法與常規(guī)方法的比較現(xiàn)有方法從實施例1中得到的所有EST-SSR序列中，隨機挑取191條進行引物開發(fā)設(shè)計，每條序列得到一對引物，共得到191對引物。然后用實施例l中實驗二中所述方法檢測每對引物的多態(tài)性，并統(tǒng)計多態(tài)性引物的比率，結(jié)果如表7。多態(tài)性引物的比率=多態(tài)性引物數(shù)目/所有引物數(shù)目。表7、現(xiàn)有方法的EST-SSR多態(tài)性統(tǒng)計所有設(shè)計的多態(tài)性引物多態(tài)性引物比檢測項目序列數(shù)引物數(shù)目數(shù)目率(％)EST總數(shù)目1911913015.713'EST數(shù)目3232721.885'EST數(shù)目1441442215.28其他EST151516.67比較表5和表7的研究結(jié)果，可以看出兩種方法的共同特點是3'EST產(chǎn)生多態(tài)性引物的比率均高于5'EST和其他來源EST，但不顯著；橫向比較兩種方法，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法產(chǎn)生多態(tài)引物的比例明顯高于前者?，F(xiàn)有的隨機選擇EST-SSR序列進行引物設(shè)計，所得到的多態(tài)性引物占引物總數(shù)的比例約為15.71%。單純選擇3，SSR-EST序列設(shè)計引物，多態(tài)性引物比率為21.88%，單純選擇5，SSR-EST序列設(shè)計引物，多態(tài)性引物比率為15.28%，其他類型EST序列產(chǎn)生多態(tài)性引物的比率為6.67%。而發(fā)明的的EST-SSR標記開發(fā)方法的最低效率也可達到45.45yo，是普通方法平均開發(fā)效率的3倍。序列表<110>東北農(nóng)業(yè)大學<120>—種獲得EST-SSR標記的方法<160〉11<210〉1<211>551<212>DNA<213>人工序列〈220>〈223><400>1cagtgccaaatt3C33C3tttatagctctattgcagatggcctctgtttcatgaaaaatgttctttctttggtggggatataatggagaggtttcaaagctccagagttsgcctttgggstttttccsttctttctttctcaattgaatttggatttccacgattcstttsttctgttgscgcagctctstgcstsgccatttttctctggattgaacttccattgcgtsttcatggstctctaagatttEi3tgcaatttttccctcttcsgsccctatcgctcagccssgaccagttctttaaaatgattgggtgtgtttsctggc333ggtstgsgctcccttttttttttttstttttattctgaatgttcctgatc3ggct3ctgcgcsgctagsgcgttttttctgtgtatatngtgacgatctgtgatttctts55160120180240300360420480540〈210〉2〈211>136〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉〈400〉2cttttccctcttccgcttttttgcsgctagagatgaasaacaagaccctatctgtttattttcgttttttctttctttcttgstagssattttgcatagc60tttttctctggctcagccaa120caaaacaagggcgtat136〈210>3<400〉3cttttccctcC33g3ccctstggctcagccttccgcttttttgc3gct3gagatgaaaaatctgtttsttttcgttttttctttctttctaacaaaacs3gggcgtattgatsgssattttgcstsgc60ttctttctttcttttttctc120148<210〉4〈211〉468<212〉醒<213〉人工序列〈220>〈223〉〈400〉4tttatgcaasgaaggttgtcccgtgatattasggtgctstgaatctgagaataccactgtsccaatagcatcctctgccstgtcttttgatttttaaccctaattgcctgttcctsgctsttgaatgsttaggggtgggaggatgtattttggaatggccttctgtcttggctgttgggatctttctttcgsgctgtaat3ggag3t3gctsagattacaatt33ggatcacctt3C3tttttcttgatttgtattctta3tsgt3gtag3stgtgctggassttttattttgtacasagacttcccttgtggctatggctatccggtgtgggggc33aggcctgsgtCCtC3tCtCtC3ttacttgt60120180240300360420468〈210〉5〈211>170〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈223〉〈400〉5gt3tca3gcacggscaggcctgagtataccactgtcaatscsatagaasttaaacscctt60acatttttaagcaascctcatctctaacctcacttttgaatgatttctttcttgattaaa120ttttattcattacttgtaccaatsgcaaggggtgggtctgaataagttgt170<210〉6<211>178<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉<400>6cggscsggcctgsgtstsccactgtcsatscaatsgaasttaaacscctt60gcaaacctcatctctaacctcacttttgaatgatttctttctttctttct120ttattcattacttgtaccaatagcaaggggtgggactgaataagttgt178<210〉7<211>494<212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉<400〉7aaacactgaatccstttcctt33ttC3Cttatctcsscttattgacgacaggaagagatgtgctagaaagcatcttcstgsgttcgcgtcacaccgattacatcgstcsgatcgtgattttgctgctcagsttgacaaccgteisgcagsgctstctcct3ttctggttggsgtaCt3tt3Ctt3stctgaatcaccgastctgggatgtaggttgctcgtacaggcstt3tc3Cacgggttggtcaagcgtttt3tCtC3C3ttccgccasaccatcactttggctctagcagctntctac3cctsagccgcgttgtctttcttcttcaatttsct3ttacctt3gcggagga3ctcttgsctgatgttcatsttctttctttcstttctctcgtgtstsgstctstctccgcct333ggtg3ggtagatttcattgctntctc49460120180240300360420480<210〉8〈211〉156〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉8gcggaacaatgaacaaacactgaaacaccgattaccattacttacaagcgtttttgtctt60tctttctttctccatttcctcatcgatcagatctgaatcaatctcacattcttcsattta120<210〉9<211>160〈212〉薩<213〉人工序列<220〉<223〉<400〉9gcggascaattctttctttcttt33tttC3gaacaaacactgaaacaccgattaccattacttacsagcgtttttgtctt60tttctccatttcctcatcgatcagatctgaatcaatctcacattcttcaa120ctcgtaattcacttatcgtgsttgccgaat160〈210〉10<211〉20<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>〈400〉10tgtcgtccacattcctcata20〈210〉11<211>18<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>11ascaacaagccgcatcac18權(quán)利要求1、一種獲得EST-SSR標記的方法，包括如下步驟1)獲得基因組內(nèi)含有簡單序列重復的EST序列；2)在步驟1)得到的含有簡單序列重復的EST序列中，將含有相同簡單序列重復單元的EST序列歸為一類；3)將步驟2)得到的同類的EST序列進行序列拼接，得到簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群、簡單序列重復單元數(shù)目無變異的重疊群和沒有形成重疊群的EST序列；4)根據(jù)步驟3)中簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，再進行引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物，即為EST-SSR標記。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，在步驟3)后，包括如下步驟根據(jù)步驟3)中簡單序列重復單元數(shù)目無變異的重疊群內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，進行引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，在步驟3)后，包括如下步驟根據(jù)步驟3)中沒有形成重疊群的EST序列內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，進行引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的方法，，其特征在于所述基因組為植物基因組、動物基因組或微生物的基因組。'5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述植物為大豆。6、一種EST-SSR標記，其中的一條序列如序列表中序列IO所示，另一條序列如序列表中序列l(wèi)l所示。7、權(quán)利要求6中所述EST-SSR標記在構(gòu)建SSR多態(tài)性圖譜中的應(yīng)用。8、一種大豆SSR多態(tài)性圖譜，是按照包括如下步驟的方法得到的1)提取大豆的基因組DNA;2)以基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求6中所述的EST-SSR標記進行PCR擴增；3)將PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得到大豆SSR多態(tài)性圖譜。全文摘要本發(fā)明公開了一種開發(fā)EST-SSR標記的方法。該方法包括如下步驟1)獲得基因組內(nèi)含有簡單序列重復的EST序列；2)在步驟1)得到的含有簡單序列重復的EST序列中，將含有相同簡單序列重復單元的EST序列歸為一類；3)將步驟2)得到的同類的EST序列進行序列拼接，得到簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群、簡單序列重復單元數(shù)目無變異的重疊群和沒有形成重疊群的EST序列；4)根據(jù)步驟3)中簡單序列重復單元數(shù)目變異的重疊群內(nèi)簡單序列重復的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，再進行引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物，即為EST-SSR標記。與比常規(guī)方法相比，開發(fā)效率可提高2-4倍，減少工作量和經(jīng)費消耗，從而縮短了研發(fā)時間、降低了開發(fā)成本，同時降低了錯過多態(tài)性SSR位點的可能性。文檔編號C12Q1/68GK101619357SQ20091009040公開日2010年1月6日申請日期2009年7月31日優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日發(fā)明者瑋常,李文濱,滕衛(wèi)麗,雪趙,韓英鵬申請人:東北農(nóng)業(yè)大學