專利名稱：一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌。本發(fā)明還涉及一種用上述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法。
背景技術(shù)：
脂肪醇是合成表面活性劑、洗滌劑、增塑劑及其他多種精細(xì)化學(xué)用品的基礎(chǔ)化工 原料，廣泛應(yīng)用于紡織、日化、造紙、食品、醫(yī)藥、皮革等領(lǐng)域。其中，C12-C14鏈長的脂肪醇 稱作中碳脂肪醇，也稱作洗滌劑醇，是表面活性劑的主要原料，中碳醇的產(chǎn)量占總醇產(chǎn)量的 55%之多。其價(jià)格直接影響著脂肪醇的價(jià)格和利潤，因此，中碳醇的生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用和 市場前景。目前，工業(yè)上生產(chǎn)的脂肪醇主要來自兩個(gè)方面(1)合成脂肪醇以化石能源_烯烴為原料合成脂肪醇，主要是通過羰基合成法和 齊格勒合成法進(jìn)行，前者的原料是α-烯烴或內(nèi)烯烴，后者的原料為乙烯；(2)天然脂肪醇以天然油脂為原料生產(chǎn)天然脂肪醇，其主要工藝路線是在Cu-Cr 或Cd-Cu-Cr等催化劑作用下，將脂肪酸甲酯或游離脂肪酸進(jìn)行催化加氫得到脂肪醇(趙國 志等，1994)。隨著石油資源的日益減少和價(jià)格的極不穩(wěn)定，以烯烴為原料的合成脂肪醇產(chǎn)業(yè)正 面臨著很大的發(fā)展障礙。對于天然脂肪醇而言，國內(nèi)天然脂肪醇的油脂原料主要從馬來西 亞、印度尼西亞和菲律賓等國家進(jìn)口，其價(jià)格隨石油和豆油價(jià)格漲價(jià)而猛漲，造成天然脂肪 醇生產(chǎn)成本過高，這是引起國內(nèi)天然脂肪醇價(jià)格居高不下的主要原因。因此，尋找合適、豐 富的脂肪醇制備原料將是今后脂肪醇工業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)方向。而利用微生物法合成脂肪醇可 以很好的解決原料來源問題，并且和化學(xué)催化相比，微生物催化合成脂肪醇是一種更加綠 色環(huán)保的方法，因此是今后脂肪醇工業(yè)發(fā)展的一個(gè)新的方向。大腸桿菌具有遺傳背景清楚，生長速度快，可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，因此可以很 好的用于代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。脂肪醇生產(chǎn)中很關(guān)鍵的一步是脂肪酸的生產(chǎn)，而乙酰_CoA(乙 酰輔酶A)到丙二酰-CoA的轉(zhuǎn)化，是脂肪酸生物合成中的限速酶。在大腸桿菌中過量表達(dá) 乙酰-CoA羧化酶可以加快其脂肪酸合成的速率，從而使其積累更多的脂肪酸。硫脂酶催化脂酰-ACP為游離脂肪酸，但是大腸桿菌自身的硫脂酶主要作用于 C16和C18的脂酰-ACP，因此它主要積累C16和C18的脂肪酸。而據(jù)報(bào)道，U. californica, C. calophylla, C. hookeriana以及C. palustvis等生長的種子中積累癸酸和月桂酸等 中短鏈脂肪酸(Voelker et al.，1992，F(xiàn)ilichkin et al. ,2005, Dehesh et al.，1996， Katayoon et al.，1996)。因此，在大腸桿菌中過量表達(dá)U. californica的硫脂酶基因BTE， 或 C. calophylla 的 Cc FatB2,或 C. hookeriana 的 Ch FatB2,或 C. palustvis 的 Cp FatB1 ^ 便可以獲得中短鏈的脂肪酸。游離脂肪酸在大腸桿菌脂酰-C0A合成酶(fadD)的作用下活化為脂酰_CoA，它可 繼續(xù)在脂酰-CoA脫氫酶(fadE)的作用下轉(zhuǎn)化為烯酰-CoA，從而進(jìn)入β-氧化途徑。脂酰-CoA是脂肪醇生物合成途徑的一個(gè)中間物，有必要阻止脂酰-CoA進(jìn)入降解代謝途徑以 積累脂酰-CoA用于中碳脂肪醇的生物合成。大腸桿菌自身并不能完成脂酰-C0A到脂肪醇的轉(zhuǎn)化，但是來源于Arabidopsis thaliana和Simmondsia chinensis的脂酰-CoA還原酶具有將脂酰-CoA還原為脂肪醇 的活性。因此，在大腸桿菌內(nèi)過量表達(dá)A. thaliana的脂酰-CoA還原酶編碼基因CER4或 S. chinensis的脂酰-CoA還原酶編碼基因FAR，就可以在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)脂酰-CoA到脂肪 醇的轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌。本發(fā)明的又一目的是提供利用上述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中提供的用于制備中碳脂肪醇的，是通過以下方法構(gòu)建 而成通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因和脂酰-CoA 還原酶基因，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達(dá)載體 pET-30a(+)或pACYCDuet-1，載體片斷膠回收后，將載體基因片段按摩爾比為1_2 4-5 的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4-7°C連接15-30小時(shí)，連接產(chǎn)物于38_42°C熱擊轉(zhuǎn)化 E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板培養(yǎng)15-30小時(shí)，PCR篩選陽性克隆。陽性克隆提取質(zhì) 粒DNA，酶切和測序鑒定后，熱擊轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE 基因后即得目標(biāo)工程大腸桿菌。本發(fā)明提供的利用上述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法，是將工程大腸桿 菌以1-2 100-130(體積)的比例接種內(nèi)含卡那霉素和氯霉素的M9液體培養(yǎng)液中， 在35-37 V，225rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltlnm為0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為 0. 1-0. 2mmol化―1，誘導(dǎo)目的蛋白的過量表達(dá)，然后轉(zhuǎn)入28_30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)18-24小 時(shí)；培養(yǎng)后的菌液離心取上清液，用等體積的正己烷萃取，制得中碳脂肪醇，所得脂肪醇通 過GC-MS分析其組成及含量。正己烷減壓蒸餾后回收使用。本發(fā)明是在大腸桿菌中表達(dá)了調(diào)控脂肪酸生物合成以及控制脂肪酸鏈長以及還 原脂肪酸的一系列關(guān)鍵酶基因。所獲得的工程大腸桿菌可高密度培養(yǎng)，生長速度快，可很好 的用于脂肪醇的生物合成。


圖1是在實(shí)施例1中構(gòu)建pA-accAB⑶表達(dá)載體過程的示意圖；圖2是在實(shí)施例1中構(gòu)建pET-BTE/CER4表達(dá)載體過程的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過在大腸桿菌中過量表達(dá)乙酰-CoA羧化酶、硫脂酶、脂酰-CoA還原酶， 并失活大腸桿菌的脂酰-CoA脫氫酶，使大腸桿菌能夠高效地將糖類轉(zhuǎn)化為中碳脂肪醇。本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增乙酰-CoA羧化酶基因，硫脂酶基因，脂酰-CoA還原酶基因， 用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達(dá)載體pET-30a(+)或pACY⑶uet-Ι，載體片斷膠回收后，將載體基因片段按摩爾比為1 5的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4°C連接過夜，連接產(chǎn)物42°C熱擊轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板培 養(yǎng)過夜，PCR篩選陽性克隆。陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，酶切和測序鑒定后，熱擊轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21 (DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE基因后即得目標(biāo)工程大腸桿菌。硫脂酶基因?yàn)閬碓从赨mbellularia californica的BTE基因，或來源于Cuphea calophylla的Cc FatB2基因，或來源于Cuphea hookeriana的Ch FatB2基因，或來源于 Cuphea palustvis 的 Cp FatB1 基因，或同 BTE，Cc FatB2, Ch FatB2 和 Cp FatB1 同源性超過 70%的DNA序列。脂酰-CoA還原酶基因?yàn)閬碓从贏rabidopsis thaliana的CER4基因，或來源于 Simmondsia chinensis的FAR基因，或同CER4和FAR基因同源性超過70%的DNA序列。乙酰-CoA 羧化酶基因?yàn)閬碓从?Acinetobacter calcoaceticus 的 accABCD 基因， ^jfeiJIT- E. coli 白勺 accABCD SS, ^^iHT Corynebacteriumglutamicum 白勺 dtsRl-accBC 基因，或同這些基因同源性超過70 %的DNA序列。脂酰-CoA脫氫酶基因?yàn)榇竽c桿菌的fadE基因。構(gòu)建好的工程大腸桿菌以1 100的比例接種內(nèi)含卡那霉素和氯霉素的M9液體 培養(yǎng)液中，在37°C，225rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltlnm (需氧量)為0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至 終濃度為0. Immol · L—1，誘導(dǎo)目的蛋白的過量表達(dá)，然后轉(zhuǎn)入30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)18-24 小時(shí)。培養(yǎng)后的菌液12000g離心10分鐘，取上清液，用等體積的正己烷萃取2-3次，減壓 蒸發(fā)除去正己烷后，制得中碳脂肪醇，所得脂肪醇通過GC-MS分析其組成及含量。正己烷減 壓蒸餾后回收使用。以下舉實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，U. californica的BTE基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE 基因以用于生物合成中碳脂肪醇。1. 1)外源基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1. 1)外源基因的克隆1. 1. 1. 1)A. calcoaceticus乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆提取A. calcoaceticus基因組DNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增下列基 因accA :acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit) GeneID(NCBI) 2878570 ；accBC ( accB 禾口 accC ^？ 13 ) :accB :biotin carboxyl carrier protein ofacetyl-CoA, GeneID(NCBI) 2878571 ；accC :acetyl_CoA carboxylase, GeneID(NCBI) 2878572 ；accD :acetyl_CoA carboxylase, beta subunit, GeneID(NCBI) :2878573。再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。1. 1. 1. 2)硫脂酶基因的克隆提取U. californica的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增克隆其硫脂酶基因BTE，GI (NCBI) :170555。再利用膠回收試劑盒回收目的基因。1. 1. 1. 3)脂酰-CoA還原酶基因的克隆提取A. thaliana的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增脂酰-CoA還原酶基因CER4，GI (NCBI) :240256152。再利用膠回收試劑盒回收目的基 因。1. 1. 2)表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1. 2. 1) pA-accABCD表達(dá)載體的構(gòu)建(請參閱圖1)1. 1. 2. 1. 1) pA-accA 載體的構(gòu)建將膠回收后的accA基因與pACYCDuet-Ι載體(Novagen)用BamH I和Sac I進(jìn)行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pA-accA后，再通過限制性酶切和測序鑒定。1. 1. 2. 1. 2) pA-accABC 載體的構(gòu)建將膠回收后的accBC基因與pA-accA載體用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，載體與 外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，PCR篩選陽性 克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pA-accABC后，再通過限制性酶切和測序鑒定。1. 1. 2. 1. 3) pA-accD 載體的構(gòu)建將膠回收后的accD基因與pACYCDuet-Ι載體(Novagen)用BamH I和Sac I進(jìn)行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pA-accD后，再通過限制性酶切和測序鑒定。1. 1. 2. 1. 4) pA-accABCD 表達(dá)載體的構(gòu)建以pA-accD重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含有T7啟動子的accD基因即T7_aCCD，用Sal I和Afl II分別雙酶切T7-aCCD和pA-accABC，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例， 4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5ci，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒 pA-accABCD后，再通過限制性酶切和測序鑒定pA-accABCD。1. 1. 2. 2) pET-BTE/CER4表達(dá)載體的構(gòu)建(請參閱圖2)1. 1. 2. 2. 1) pET-BTE 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的BTE基因與pET_30a(+)載體用Nde I和Not I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pET-BTE后，再通過限制性酶切和測序鑒定 pET-BTE。1. 1. 2. 2. 2) pET_CER4 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的CER4基因和pET_30a(+)載體用Bgl II和Xho I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒PET-CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定 PET-CER4。1. 1. 2. 2. 3) pET_BTE/CER4 表達(dá)載體的構(gòu)建以pET-CER4為模板，PCR擴(kuò)增含有T7啟動子的CER4基因T7-CER4。然后分別將T7-CER4和載體pET-BTE用Not I和Xho I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的 比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重 組質(zhì)粒PET-BTE/CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定pET_BTE/CER4。1. 2) pA-accADBC 和 pET_BTE/CER4 共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-BTE/CER4熱擊轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選獲得陽性克 隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒后再通過酶切和測序鑒定；然后將pA-accADBC重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化 含有PET-BTE/CER4的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選獲得陽性克隆，提取陽性克隆的 質(zhì)粒后再通過酶切和測序鑒定。由此獲得了含有pA-accADBC和pET_BTE/CER4兩個(gè)表達(dá)載 體的工程大腸桿菌。1. 3)大腸桿菌fadE基因的敲除采用TargeTron 基因敲除系統(tǒng)(Sigma-Aldrich)對大腸桿菌的fadE基因進(jìn)行敲 除。1. 4) SDS-PAGE鑒定目標(biāo)蛋白的表達(dá)將活化后的工程大腸桿菌按1 100的接種量接種到IOmL LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi) 含50 μ g · ml/1的卡那霉素和34 μ g · ml/1氯霉素)，37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)2h，在菌液中加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉(zhuǎn)入30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)3_4h，誘導(dǎo)表達(dá)目的 蛋白。取出誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物，12000g離心2min，收集菌體，菌體細(xì)胞用0. 05mol/L的磷酸緩 沖液(pH7. 8)洗滌一次，按1 10的比例再用此緩沖液重懸細(xì)胞，加入等體積2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin，瞬時(shí)高速離心，10% SDS-PAGE電泳檢測，即可檢測到目標(biāo)蛋白的 表達(dá)。1. 5)工程大腸桿菌的培養(yǎng)將活化后的工程大腸桿菌按1 100的比例接種到M9液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含 50 yg -mr1的卡那霉素和34 μ g -mr1氯霉素)，37°C，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltlnm為 0. 6-0. 8時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉(zhuǎn)入在30°C，225rpm條 件下，繼續(xù)培養(yǎng)18-24h。1.6)脂肪醇的提取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液在12000g條件下，離心lOmin，收集上清液，并用等體積的正己 烷萃取2-3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷后即得中碳脂肪醇。正己烷回收利用。1. 7)脂肪醇組成及含量的測定得到的脂肪醇通過GC-MS測定其組成及含量。實(shí)施例2通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD), C. calophylla的Cc FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例3通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. hookeriana的Ch FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例4
通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. palustvis的Cp FatB1基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例5通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， U. californica的BTE基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用 于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例6通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. calophylla的Cc FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例7通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. hookeriana的Ch FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例8通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. palustvis的Cp FatB1基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以 用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例9通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，U. californica 的 BTE 基因和 A. thaliana 的 CER4 基因，并敲除大腸桿菌 的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。9. 1)外源基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建9. 1. 1)外源基因的克隆9. 1. 1. 1)C. glutamicum乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆提取C. glutamicum基因組DNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增下列基因dtsRl :acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit) ，GeneID(NCBI) 3345446 ；accBC :biotin carboxylase 禾口 biotin carboxyl carrier protein, GeneID(NCBI) 3343021 ；再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。9. 1. 1.2)硫脂酶基因的克隆提取U. californica的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物， PCR擴(kuò)增克隆其硫脂酶基因BTE，GI (NCBI) :170555。再利用膠回收試劑盒回收目的基因。9. 1. 1. 3)脂酰-CoA還原酶基因的克隆提取A. thaliana的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增脂酰-CoA還原酶基因CER4，GI (NCBI) :240256152。再利用膠回收試劑盒回收目的基 因。
9. 1. 2)表達(dá)載體的構(gòu)建9. 1. 2. 1) pA-dtsRl/accBC 表達(dá)載體的構(gòu)建9. 1. 2. 1. l)pA-dtsRl 載體的構(gòu)建將膠回收后的dtsRl基因用Pag I和BamH I進(jìn)行雙酶切，載體 pACYCDuet-1 (Novagen)用Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的 比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重 組質(zhì)粒pA-dtsRl后，再通過限制性酶切和測序鑒定。9. 1. 2. 1. 2) pA-dtsRl/accBC 載體的構(gòu)建分別將膠回收后的accBC基因與pA-dtsRl載體用Mun I和Pac I進(jìn)行雙酶切，載 體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，PCR篩 選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒PA-dtsRl/accBC后，再通過限制性酶切和測序鑒定。9. 1. 2. 2)pET-BTE/CER4 表達(dá)載體的構(gòu)建(附圖 2)9. 1. 2. 2. DpET-BTE 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的BTE基因與pET_30a(+)載體用Nde I和Not I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒ρΕΤ-ΒΤΕ后，再通過限制性酶切和測序鑒定 ρΕΤ-ΒΤΕ。9. 1. 2. 2. 2)pET_CER4 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的CER4基因和pET_30a(+)載體用Bgl II和Xho I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒PET-CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定 PET-CER4。9. 1. 2. 2. 3) pET-BTE/CER4 表達(dá)載體的構(gòu)建以pET-CER4為模板，PCR擴(kuò)增含有Τ7啟動子的CER4基因T7-CER4。然后分別將 T7-CER4和載體ρΕΤ-ΒΤΕ用Not I和Xho I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的 比例，4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重 組質(zhì)粒PET-BTE/CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定pET_BTE/CER4。9. 2) pA-dtsRl/accBC 和 pET_BTE/CER4 共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-BTE/CER4熱擊轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選獲得陽性克 隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒后再通過酶切和測序鑒定；然后將pA-dtsRl/accBC重組質(zhì)粒熱擊 轉(zhuǎn)化含有PET-BTE/CER4的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選獲得陽性克隆，提取陽性克 隆的質(zhì)粒后再通過酶切和測序鑒定。由此獲得了含有pA-dtsRl/accBC和pET_BTE/CER4兩 個(gè)表達(dá)載體的工程大腸桿菌。9. 3)大腸桿菌fadE基因的敲除采用TargeTron 基因敲除系統(tǒng)(Sigma-Aldrich)對大腸桿菌的fadE基因進(jìn)行敲 除。9. 4) SDS-PAGE鑒定目標(biāo)蛋白的表達(dá)將活化后的工程大腸桿菌按1 100的接種量接種到IOmL LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含50 μ g · ml/1的卡那霉素和34 μ g · ml/1氯霉素)，37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)2h，在菌液中加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉(zhuǎn)入30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)3_4h，誘導(dǎo)表達(dá)目的 蛋白。取出誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物，12000g離心2min，收集菌體，菌體細(xì)胞用0. 05mol/L的磷酸緩 沖液(pH7. 8)洗滌一次，按1 10的比例再用此緩沖液重懸細(xì)胞，加入等體積2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin，瞬時(shí)高速離心，10% SDS-PAGE電泳檢測，即可檢測到目標(biāo)蛋白的 表達(dá)。9.5)工程大腸桿菌的培養(yǎng)將活化后的工程大腸桿菌按1 100的比例接種到M9液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含 50 yg -mr1的卡那霉素和34 μ g -mr1氯霉素)，37°C，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltlnm為 0. 6-0. 8時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉(zhuǎn)入在30°C，225rpm條 件下，繼續(xù)培養(yǎng)18-24h。9.6)脂肪醇的提取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液在12000g條件下，離心lOmin，收集上清液，并用等體積的正己 烷萃取2-3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷后即得中碳脂肪醇。正己烷回收利用。9. 7)脂肪醇組成及含量的測定得到的脂肪醇通過GC-MS測定其組成及含量。實(shí)施例10通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC) ,C. calophylla 的 Cc FatB2 基因和 A. thaliana 的 CER4 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例9。實(shí)施例11通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. hookeriana 的 Ch FatB2 基因和 A. thaliana 的 CER4 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例9。實(shí)施例12通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. palustvis 的 Cp FatB1 基因和 A. thaliana 的 CERl 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例9。實(shí)施例13通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD),U. californica的BTE基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE 基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例14通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD), C. calophylla的Cc FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例15通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. hookeriana的Ch FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例16通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰_CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. palustvis的Cp FatBi基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例17通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， U. californica的BTE基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用 于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例18通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. calophylla的Cc FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例19通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. hookeriana的Ch FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例20通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. palustvis的Cp FatBi基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以 用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例1。實(shí)施例21通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，U. californica 的 BTE 基因和 S. chinensis 的 FAR 基因，并敲除大腸桿菌 的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例9。實(shí)施例22通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. calophylla 的 Cc FatB2 基因和 S. chinensis 的 FAR基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例9。實(shí)施例23通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. hookeriana 的 Ch FatB2 基因和 S. chinensis 的 FAR 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例9。實(shí)施例24通過在大腸桿菌中共同過量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. palustvis 的 Cp FatBi 基因和 S. chinensis 的 FAR 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實(shí)施例9。
權(quán)利要求
一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌，通過下述方法得到通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增乙酰 CoA羧化酶基因、硫脂酶基因和脂酰 CoA還原酶基因，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達(dá)載體pET 30a(+)或pACYCDuet 1，載體片斷膠回收后，將載體∶基因片段按摩爾比為1 2∶4 5的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4 7℃連接15 30小時(shí)，連接產(chǎn)物于38 42℃熱擊轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板培養(yǎng)15 30小時(shí)，PCR篩選陽性克隆。陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，酶切和測序鑒定后，熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE基因后即得目標(biāo)工程大腸桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經(jīng)異丙基硫 代- β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)后過量表達(dá)硫脂酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經(jīng)異丙基硫 代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)后過量表達(dá)脂酰-CoA還原酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經(jīng)異丙基硫 代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)后過量表達(dá)乙酰-CoA羧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，工程大腸桿菌通過搖瓶或發(fā)酵罐進(jìn)行 培養(yǎng)。
6.一種利用權(quán)利要求1所述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法，將工程大腸桿菌以 1-2 100-130 (ν/ν)的比例接種內(nèi)含卡那霉素和氯霉素的Μ9液體培養(yǎng)液中，在35-37°C， 225rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltlnm為0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0. 1-0. 2mmol化一1， 誘導(dǎo)目的蛋白的過量表達(dá)，然后轉(zhuǎn)入28-30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)18-24小時(shí)；培養(yǎng)后的菌液 離心取上清液，用等體積的正己烷萃取，減壓蒸發(fā)除去正己烷后制得中碳脂肪醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備中碳脂肪醇的方法，其中，正己烷減壓蒸餾后回收使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備中碳脂肪醇的方法，其中，所得脂肪醇通過GC-MS分析其組 成及含量。
全文摘要
一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌和制備中碳脂肪醇的方法，該方法通過在大腸桿菌中過量表達(dá)硫脂酶基因，脂酰-CoA還原酶基因等，使大腸桿菌獲得生產(chǎn)中碳脂肪醇的能力，結(jié)合過量表達(dá)乙酰-CoA羧化酶基因并敲除大腸桿菌的脂酰-CoA脫氫酶基因，進(jìn)一步提高工程大腸桿菌的脂肪醇生產(chǎn)能力。該方法可用于重要化工原料中碳脂肪醇的生物合成。
文檔編號C12P7/02GK101899411SQ200910090469
公開日2010年12月1日 申請日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者劉煒, 咸漠, 孟鑫, 徐鑫, 楊建明, 鄭艷寧 申請人:青島生物能源與過程研究所