專利名稱：一種微生物冷凍干燥保護(hù)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物凍藏技術(shù)，具體地說是一種用于微生物冷凍干燥保 藏的保護(hù)劑，本發(fā)明還涉及該保護(hù)劑的用途。
背景技術(shù)：
近年來，由于食品安全的需要，微生態(tài)制劑的研究和開發(fā)得以較快發(fā) 展，雙歧桿菌和乳酸菌在微生態(tài)制劑的研究方面?zhèn)涫苡H睞，除了它具有常
見益生菌的生理功能如促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用、生物屏障和生物拮抗作 用、免疫調(diào)節(jié)作用外，還具有抑制內(nèi)毒素產(chǎn)生、改善飼養(yǎng)環(huán)境、產(chǎn)生細(xì)菌 素廣譜抑菌等作用。但實(shí)際生產(chǎn)中卻很少使用。原因在于雙歧桿菌和乳 酸桿菌的營(yíng)養(yǎng)要求很高，生長(zhǎng)條件極為苛刻，特別是在冷凍干燥過程中細(xì) 胞死亡率很高，極大地限制了高活性雙歧桿菌和乳酸菌制劑的生產(chǎn)。
冷凍干燥制劑因?yàn)榛罹２仄陂L(zhǎng)、貨架時(shí)間長(zhǎng)、活菌數(shù)量高而被廣泛 研究和應(yīng)用。在凍干過程中，培養(yǎng)條件、收獲期、冷凍速率、保護(hù)劑、殘 留水分及復(fù)水條件等都或多或少影響冷凍干燥菌體的存活率，其中保護(hù)劑 是最復(fù)雜、也最難選擇的一個(gè)關(guān)鍵因素。因此，積極尋求新型凍干保護(hù)劑， 最大限度降低細(xì)胞的損失，是制備高活性雙歧桿菌和乳酸菌凍干制劑及進(jìn) 一步延長(zhǎng)活菌保藏期的技術(shù)關(guān)鍵。
目前，還沒有將水蘇糖直接作為益生菌冷凍干燥保護(hù)劑的成分的研究 和報(bào)道。水蘇糖在微生態(tài)制劑方面的研究仍然僅是用作凍干菌粉的稀釋劑 或作為雙歧因子。如專利CN101028290A用于降低人或禽畜血清膽固醇的 益生菌制劑及工藝中，按重量比例稱取屎鏈球菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌 混合凍干菌粉，按比例添加到玉米粉或水蘇糖中，制備粉劑或膠囊劑，能 調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群，降低血清膽固醇。又如專利CN101028289A調(diào)整菌群預(yù)防 或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑及工藝中，將高溫干燥或冷凍干燥后獲得的干燥菌粉，按重量比例添加到乳糖和水蘇糖再制備成陰道外用或口服 益生菌膠囊劑及外用泡騰片。這些報(bào)道都是在得到凍干菌粉以后，加入水 蘇糖作為稀釋劑或者促生長(zhǎng)因子。目前還沒有將水蘇糖作為凍干保護(hù)劑的 應(yīng)用。同時(shí)，以往常用的保護(hù)劑亦存在保護(hù)劑配方非常復(fù)雜、保護(hù)效果穩(wěn) 定性差等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供水蘇糖的新用途；
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供 一種含有水蘇糖的冷凍干燥保護(hù)劑；
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述保護(hù)劑的應(yīng)用。
發(fā)明人嘗試尋找新的冷凍干燥保護(hù)劑，用以降低凍干菌劑菌種的死亡 率，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，水蘇糖對(duì)微生物的冷凍干燥具有良好的保護(hù)作用，從 而可以用于制備冷凍干燥菌劑。
進(jìn)一步，發(fā)明人嘗試尋找含有水蘇糖保護(hù)劑的較佳組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 谷氨酸鈉與水蘇糖對(duì)冷凍干燥效果具有較大交互影響作用。進(jìn)而本發(fā)明提 供了一種含有水蘇糖的冷凍干燥保護(hù)劑，包括水蘇糖、谷氨酸鈉、半乳糖 和脫脂奶粉。
通過正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以下配比的冷凍干燥保護(hù)劑具有較好的保護(hù)效
果
水蘇糖 0.8 ~ 5.5% 谷氨酸鈉0.1 ~ 0.6% 半乳糖 0.4-1.5% 脫脂奶粉 6~15% 優(yōu)選，該保護(hù)劑含有 水蘇糖 1.8-3.5% 谷氨酸鈉 0.2-0.5% 半乳糖 0.5-1.2% 脫脂奶粉8.5-12.5% 。更優(yōu)選，該保護(hù)劑含有
水蘇糖 3.0% 谷氨酸鈉 0.3% 半乳糖 1.0% 脫脂奶粉10% 。
上述保護(hù)劑在益生菌特別是雙歧桿菌、乳酸菌或酵母菌的冷凍干燥中 具有良好的應(yīng)用效果，能大幅降低冷凍干燥引起的菌種死亡。從而，利用 本發(fā)明保護(hù)劑制備冷凍干燥菌劑是有益的。制備冷凍干燥菌劑時(shí)，可釆用 常規(guī)方法添加本發(fā)明保護(hù)劑。
本發(fā)明還提供一種優(yōu)選的制備冷凍干燥菌劑的方法，包括如下步驟 制備菌泥，向菌泥中加入0.5 3.5倍菌泥體積的上述保護(hù)劑，混勻，20.0~ 37.8。C水洛平衡20~70min，液氮速凍15 ~ 100s和/或低溫(-18匸~-40°C ) 預(yù)冷凍1~4小時(shí)，然后冷凍干燥16~30h。
可釆用常規(guī)方法制備菌泥，例如，將微生物發(fā)酵液2000 ~ 12000rpm 離心5 15min，棄上清，留菌泥(bacteria mire, BM);也可將上述菌泥 繼續(xù)用生理鹽水洗滌，2000 12000rpm離心3 8min，棄上清得洗滌菌泥 (washed bacteria mire ， WBM )。
本申請(qǐng)中涉及到的百分號(hào)"％"，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比； 但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指溶液100ml中含有溶質(zhì)若干克；液 體之間的百分比，是指在20。C時(shí)容量的比例。
若未特別說明，本發(fā)明中涉及到的溶液的溶劑為水。
本發(fā)明將水蘇糖應(yīng)用于菌種的冷凍干燥保護(hù)，作為凍干保護(hù)劑的成分 之一，拓寬了水蘇糖的應(yīng)用。將水蘇糖與谷氨酸鈉等試劑優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，形成 了很好的凍千保護(hù)劑的組合水蘇糖0.8~3.5%、谷氨酸鈉0.1~0.6%、半 乳糖0.4~1.5%、脫脂奶粉6~15%，其對(duì)短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌等多 種雙歧桿菌和乳桿菌、乳球菌等多種乳酸菌和酵母菌都有很高的凍干保護(hù) 率且保護(hù)效果穩(wěn)定。解決了微生態(tài)制劑研究中凍干保護(hù)劑復(fù)雜且保護(hù)效果生菌的保藏提供了很 好的保護(hù)劑的組方，有利于菌種在保藏過程中的穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn) 一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限 制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所 作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的 常規(guī)手段。
實(shí)施例中所述的低溫保存是指在4'C下保存，未特別指明保存條件是 指在常溫(25°C)下保存。
在實(shí)施例中，冷凍干燥菌劑的制備及菌種存活率的計(jì)算釆用如下方式 進(jìn)行在常規(guī)的適宜條件下培養(yǎng)各待保藏或冷凍干燥的菌株，將微生物發(fā) 酵液2000 ~ 12000rpm離心5 ~ 15min,棄上清，留菌泥(bacteria mire, BM);也可將上述菌泥繼續(xù)用生理鹽水洗滌，2000~ 12000rpm離心3~ 8min，棄上清得洗滌菌泥(washed bacteria mire， WBM)。將得到的菌泥 與0.5-3.5倍體積的保護(hù)劑混勻，在20.0-37.8。C水浴平衡20 ~70min， 再通過液氮速凍15-100s或低溫(-18°C~-40°C)預(yù)冷凍1~4小時(shí)，然 后冷凍干燥16 30h，復(fù)水，37.0-38.5。C水洛20 45min，混勻后連續(xù)稀 釋計(jì)數(shù)，計(jì)算保護(hù)劑對(duì)于菌種的存活率，即凍干前后相同體積活菌數(shù)之比。
實(shí)施例中涉及的菌種及來源見表1。
_表1供保藏的菌種及來源_
_菌種名稱_來源
短雙歧桿菌(5折^&c^7'ww BB2) ( CGMCC保藏號(hào)3200 ) CGMCC 短雙歧桿菌CB折^Z7ac,e,ii/;w Z)"ve ) 1.2213 CGMCC 青春雙歧桿菌CS(/ i/o6acfeA"/ww ofc/o/escew"51) 6070 CICC 青春雙歧桿菌CS折《/oZ)"c/en'w/w "i/ofeycew^ BA15) 本實(shí)驗(yàn)室 青春雙歧桿菌(5訴do6a"en'"w "cfo/esce"他BA11) 本實(shí)驗(yàn)室 小雞雙歧桿菌(及y^o6flrfe〃'"w/w〃WT/w ) 1.2240 CGMCC/J、7鳥雙歧才干菌(5zykto6a"er/w附；w〃on/附Bi) 小雞雙歧桿菌(5折cto6a"en'MW pw〃on/w B3)
本實(shí)驗(yàn)室 本實(shí)驗(yàn)室
兩歧雙歧桿菌(及)Wo6""en力w 6折dww) 1.2212 動(dòng)物雙歧才千菌C8zy i/oZ)fl"er/w附aw/附a/z'力1.2268 嬰兒雙歧桿菌(^/Wo6a"eWwm /"/朋to) 1.2202
豬雙歧桿菌 C6(/Woto"e〃'ww 1.2184 長(zhǎng)雙歧桿菌CSzy^o6"cfen、w /o"gww) 1.2186
德氏乳桿菌保加利亞亞種(丄.c/e/6n^cfe7 B"/gan'ow) 1.2161 CGMCC
注CICC為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；CGMCC為中國(guó)普 通微生物菌種保藏管理中心。BB2是本實(shí)驗(yàn)室分離篩選鑒定得到的短雙歧 桿菌菌株，該菌株已于2009年07月22日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心(地址北京巿朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微 生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為雙歧桿菌(說y^^acten'wm 平)，保藏號(hào)為CGMCCNo.3200。
在保護(hù)劑的研究和設(shè)計(jì)中，以短雙歧桿菌BB2為供試菌株，進(jìn)行水蘇 糖單因素試驗(yàn)，其中固定其他三種組合物比例為谷氨酸鈉0.1%、半乳
干酪乳桿菌(丄.owe/) 1.539 鼠李糖乳桿菌(丄.r/2cwmomy) 6157 嗜酸乳桿菌(/:.""'^/7/ //船)1.2467 植物乳桿菌CL/ /朋,"n/w) 1.242 戊糖片球菌(iW/ococc船/ ewtosace一 10196 糞腸球菌(jE她racocciw々ecflfo)1.125 屎腸球菌(嵐eracoccM511.2334 乳酸片球菌CPe&'ococcM51 acW/acft'd) 1.4 乳酸享L球菌(Zactococc附/a"/os) 1.2829 乳酸享L球菌(丄actococcM51 /a"/cs)23609 產(chǎn)朊假絲酵母(Ca"&Wa W/的2.1004 酉良酒酵母(iS"acc/wramyce51 cercv/W"e) 2.1793 深紅酵母(及/w^ torw/fl rw6ra )2.1515 中國(guó)紅酵母(i /zodoton^a ) 2.1391
實(shí)施例l糖0.4%、脫脂奶粉8%。結(jié)果如表2所示。
表2水蘇糖不同水平的凍干存活率及多重比較結(jié)果
試驗(yàn)組《 攀 *右存活率(％)
1045.48 ± 3.34 C d
21.058.68 ± 8.78 BC bc
32.560.88 ±3.69 ABC abc
44.077.75 ±5.14 A a
55.569.19 ± 6.74 AB ab
注數(shù)字右側(cè)標(biāo)示的大寫和小寫字母分別表示統(tǒng)計(jì)的顯著水平p《0.01和p < 0.05 的多重比較結(jié)果。
從表中看出，在保護(hù)劑中添加1%的水蘇糖，即可顯著提高對(duì)于雙歧 桿菌BB2的凍干保護(hù)率。隨著水蘇糖含量的增加，存活率也顯著提高，凍 干保護(hù)率與水蘇糖在復(fù)合保護(hù)劑中含量呈強(qiáng)正相關(guān)(R2=0.9949),最高時(shí) (4%)可比不添加水蘇糖時(shí)的凍干保護(hù)率提高70.9%。因此，水蘇糖對(duì)于
雙歧桿菌的冷凍干燥有極強(qiáng)的保護(hù)作用。
在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步釆用三因素二水平有交互作用的正交試驗(yàn)，來 考察谷氨酸鈉和半乳糖與水蘇糖之間的交互作用。各因素和水平如表3所 示。
表3正交實(shí)驗(yàn)涉及的因素及水平
水平水蘇糖(％)谷氨酸鈉半乳糖
12.00.31.0
23.00.62.0
正交表Ls(2、及各組合的存活率結(jié)果見表4，模型因素顯著性檢驗(yàn)結(jié) 果見表5。
表4各正交組合凍干存活率及多重比較結(jié)果
"(27)A (水蘇糖)B (谷氨酸鈉)Ax BC (半乳糖)Ax CBxCAxBxC存活率(％) 及差異顯著性
試驗(yàn)號(hào)12345671111111160.58 ± 4.58 c D
2111222275.00 ± 6.84 b BC
3122112278.85 ± 9.02 b AB
4122221180.29 ± 8.36 b AB
52121212卯.87土5.74a A83.17 ± 3.28 ab
6 2 1 2 2 12 1 AB
65.38 ± 4.15 c
7 2 2 1 1 22 1 CD
76.44 ± 5.95 b
_J_^_^_J_^_11_^_BC
注l)A、 B、 C分別代表試驗(yàn)因素水蘇糖、谷氨酸鈉和半乳糖，AxB、 AxC、 B xC、 AxBxC分別表示ABC三因素間的互作；2)數(shù)字右側(cè)標(biāo)示的大寫和小寫字母分 別表示統(tǒng)計(jì)的顯著水平p《0.01 (其差異性用A、 B、 C、 D表示)和p《0.05 (其差異 性用a,b,c表示)的多重比較結(jié)果
表5正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵蛩仫@著性檢驗(yàn)結(jié)果因素或組合自由度 F值Pr〉F顯著性
A1 5.670.0255
B1 0.950.3397
C1 4.690.0405承
AxB1 39.42<細(xì)1**
AxC1 1.980.1721
BxC1 0.420.5221
AxBxC1 12.760.0015*承
注顯著性中"*"分別表示該因素對(duì)模型的影響極顯著(p《0.01沐顯著(p《0.05)。
從表5看出，水蘇糖、半乳糖和谷氨酸鈉的交互作用、三者的交互作
用對(duì)組合保護(hù)效果有顯著影響，其中以水蘇糖和谷氨酸鈉的交互作用影響 最大，目前尚無相關(guān)報(bào)道。但是普遍認(rèn)為，谷氨酸鈉單獨(dú)使用效果不佳， 與糖類復(fù)合使用冷凍保護(hù)效果大大提高。本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表明，谷氨酸鈉與半 乳糖的交互作用不顯著，而水蘇糖和谷氨酸鈉的交互作用影響顯著。從表
4看出，組合5 (即試驗(yàn)號(hào)5)的凍干保護(hù)效果最好，活菌存活率達(dá)到了 90.87%。
實(shí)施例2
在適宜條件下培養(yǎng)短雙歧桿菌(B訴^6acte〃'Mm 6"ve BB2)。將該發(fā)酵 液2000ipm (即每分鐘2000轉(zhuǎn))離心5min (即5分鐘)，棄上清，留菌體， 取一定量生理鹽水洗滌，5000rpm離心4min，棄上清，留菌體(washed bacteria mire, WBM)，菌泥1.5倍體積加入保護(hù)劑A (水蘇糖0.8%、谷氨
10酸鈉0.1%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉12%)，混勾，33。C水洛平衡35min， 液氮速凍20s ("s"代表"秒"，以下同)，冷凍干燥16h (h代表小時(shí))，立 即復(fù)水，37。C水洛30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為48.32%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得 到保護(hù)劑的保護(hù)率為32.79%。
其所述的在適宜條件下培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為大豆蛋白胨5.0克，胰 蛋白胨(BBL)5g，酵母提取物5g，葡萄糖15g, K2HPQ4 2g, MgCl2 6H20 0.5g, ZnS04*7H20 0.25g, CaCl2 0.15g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g， FeCl3微 量，吐溫曙80 1mL,蒸餾水1000mL。調(diào)整pH6.5左右，121。C滅菌15 min, 冷卻備用；也可以是其他雙歧桿菌的培養(yǎng)基。厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35"C, 每間隔2 3h進(jìn)行120rpm攪拌，持續(xù)10min，培養(yǎng)48 72小時(shí)，得到雙 歧桿菌的發(fā)酵液。
實(shí)施例3
按照實(shí)施例2中的方法培養(yǎng)短雙歧桿菌(說;/^o^"en'wm ^eve BB2)。 將該發(fā)酵液3500rpm離心8min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗 滌，3500rpm離心5min，棄上清，留菌體，菌泥1.5倍體積加入保護(hù)劑B (水蘇糖1.5%、谷氨酸鈉0.2%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%)，混勻， 35。C水洛平衡40min,液氮速凍40s，冷凍干燥15h，立即復(fù)水，37。C水洛 30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為62.94%。 常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 49.27%。
實(shí)施例4
按照實(shí)施例2中的方法培養(yǎng)短雙歧桿菌(及y^^acfeWwm Z m^ BB2) (CGMCC No.3200)。將該發(fā)酵液2500rpm離心10min，棄上清，留菌體， 取一定量生理鹽水洗滌，4000rpm離心5min，棄上清，留菌體，菌泥3 倍體積加入保護(hù)劑C (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.5%、脫脂 奶粉10%),混勻，37'C水洛平衡45min,液氮速凍80s，冷凍干燥18h,立即復(fù)水，37.8'C水洛30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到 保護(hù)劑的保護(hù)率為87.66%。低溫保存12月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率, 得到保護(hù)劑的保護(hù)率為75.56%。
實(shí)施例5
按照實(shí)施例2中的方法培養(yǎng)短雙歧桿菌(及y^o6acten、w 6reve)1.2213 (CGMCC)。將該發(fā)酵液2000rpm離心15min，棄上清，留菌體，取一定 量生理鹽水洗滌，12000rpm離心3min,棄上清，留菌體，菌泥1.5倍體 積加入保護(hù)劑A(水蘇糖0.8。/。、谷氨酸鈉0.1%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉 12%)，混勾，33。C水浴平衡35min,液氣速凍20s,冷凍干燥16h,立即 復(fù)水，37"C水浴30min，混句，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑 的保護(hù)率為49.15%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到 保護(hù)劑的保護(hù)率為33.82%。
實(shí)施例6
按照實(shí)施例2中的方法培養(yǎng)短雙歧桿菌(及:/^o^"m'M附6reve ) 1.2213 (CGMCC)。將該發(fā)酵液2500rpm離心8min，棄上清，留菌體，取一定 量生理鹽水洗滌，6000rpm離心6min,棄上清，留菌體，菌泥1.5倍體積 加入保護(hù)劑B(水蘇糖1.5%、谷氨酸鈉0.2%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%)， 混勻，35。C水浴平衡40min,液氮速凍40s，冷凍干燥15h，立即復(fù)水，37°C 水浴30min，混勻，連續(xù)稀脊計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 65.88%。 3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 50.16%。
實(shí)施例7
按照實(shí)施例2中的方法培養(yǎng)短雙歧桿菌(說y^oZ)acfen'Mm 6wve) 1.2213 (CGMCC)。將該發(fā)酵液3500rpm離心10min,棄上清，留菌體，取一定 量生理鹽水洗滌，8000rpm離心5min，棄上清，留菌體，菌泥3倍體積加 入保護(hù)劑C(水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.5%、脫脂奶粉10%),混勻，37。C水洛平衡45min,液氮速凍80s,冷凍千燥18h，立即復(fù)水，37.8°C 水洛30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 85.64%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù) 率為76.78%。
實(shí)施例8
在適宜條件下培養(yǎng)青春雙歧桿菌6070 ( CICC )。將該發(fā)酵液2000rpm 離心5min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，10000rpm離心4min， 棄上清，留菌泥(bacteriamire， BM),菌泥1.5倍體積加入保護(hù)劑A (水 蘇糖0.8%、谷氨酸鈉0.1%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉12%)，混勻，33°C 水浴平衡35min，低溫(-18°C )預(yù)冷凍2.5小時(shí)，然后冷凍干燥16h，立 即復(fù)水，37'C水洛30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為51.22%。低溫保存6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得 到保護(hù)劑的保護(hù)率為32.56%。
其所述的在適宜條件下培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為大豆蛋白胨0.5g,胰蛋 白胨(oxoid)0.5g，酵母粉(oxoid)lg，葡萄糖1.0g,無機(jī)鹽溶液4mL，蒸餾 水100ml，半胱氨酸鹽酸鹽0.05g(培養(yǎng)基煮沸后加入)，pH7.0,以上培養(yǎng) 基(液體)12rC滅菌15 min,冷卻備用；也可以是其他雙歧桿菌的培養(yǎng) 基。厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35°C ，每間隔2 ~ 3h進(jìn)行120rpm攪拌，持續(xù)10min, 培養(yǎng)48-72小時(shí)，得到雙歧桿菌的發(fā)酵液。其無機(jī)鹽溶液的配制為 CaCb(無水)0.2g, MgS04.7H20 0.48g, K2HP04 l.Og, NaCl 2g， NaHC03 10g, 混合CaCb和MgS04在300亳升蒸餾水中直至溶解，力口 500mL蒸餾水， 邊攪拌邊緩慢加入其他鹽類，繼續(xù)攪拌直至全部溶解，加200mL蒸餾水 混勻，保存到4'C下備用。
實(shí)施例9
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)青春雙歧桿菌6070 (CICC)。將該發(fā)酵液 4500rpm離心12min，棄上清，留菌泥(bacteria mirer BM)，菌泥1.5倍 體積加入保護(hù)劑B (水蘇糖1.5%、谷氨酸鈉0.2%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%)，混勻，35'C水浴平衡40min，低溫(-40°C ) 預(yù)冷凍1小時(shí)，冷 凍干燥15h，立即復(fù)水，37"C水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存 活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為80.13%。常溫保存6月后同樣的復(fù)水步驟 計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為72.41%。
實(shí)施例10
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)青春雙歧桿菌6070 (CICC)。將該發(fā)酵液 3500rpm離心13min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，12000rpm 離心4min ，棄上清，留菌泥(bacteria mire, BM)，菌泥3倍體積加入保 護(hù)劑C(水蘇糖2.5。/。、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.5%、脫脂奶粉10%), 混勻，37。C水洛平衡45min，低溫(-35。C )預(yù)冷凍1.5小時(shí)，冷凍干燥18h， 立即復(fù)水，37.8°〇水洛30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到 保護(hù)劑的保護(hù)率為79.12%。低溫保存12月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率， 得到保護(hù)劑的保護(hù)率為70.51%。
實(shí)施例11
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)青春雙歧桿菌6070 (CICC)。將該發(fā)酵液 2500rpm離心14min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，8000rpm 離心7min，棄上清，留菌泥(bacteria mire， BM)，菌泥3倍體積加入保 護(hù)劑C (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.5%、脫脂奶粉10%), 混勻，37。C水浴平衡45min,液氮速凍20s，再低溫(-35°C )預(yù)冷凍1小 時(shí)，冷凍干燥18h，立即復(fù)水，37.8。C水洛30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)， 計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為82.05%。常溫保存6月后同樣的復(fù) 水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為78.02%。
實(shí)施例12
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)青春雙歧桿菌(及:/^okcten'Mm
aflfo/esce"他)BAll。將該發(fā)酵液3000rpm離心9min,棄上清，留菌體， 取一定量生理鹽水洗滌，5000卬m離心8min,棄上清，留菌體，菌泥1.5
14倍體積加入保護(hù)劑D (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.1%、半乳糖1.0%、脫脂 奶粉8%),混勻，37。C水浴平衡40min,液氮速凍80s,冷凍干燥20h,立 即復(fù)水，37.5。C水浴30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保 護(hù)劑的保護(hù)率為80.11%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率， 得到保護(hù)劑的保護(hù)率為76.28%。
實(shí)施例13
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)青春雙歧桿菌(5zy^oZ ""en'ww BAll)。將該發(fā)酵液3000rpm離心9min,棄上清，留菌體，取一定量生理 鹽水洗滌，9000rpm離心6min,棄上清，留菌體，菌泥2.0倍體積加入保 護(hù)劑E(水蘇糖2.0。/。、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉8%),混 勻，37。C水浴平衡40min，液氮速凍60s,冷凍干燥20h，立即復(fù)水，37.5°C 水浴30min,混勾，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 78.01%。 3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 63.73%。
實(shí)施例14
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)青春雙歧桿菌(及y^o^cfen'M/w ^fo/esce"to BA15)。將該發(fā)酵液2500rpm離心13min，棄上清，留菌體，取一定量生 理鹽水洗滌，7000rpm離心7min,棄上清，留菌體，菌泥2.0倍體積加入 保護(hù)劑F (水蘇糖1.8%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%), 混句，37.5。C水洛平衡30min,液氮速凍40s,冷凍干燥18h，立即復(fù)水， 37.5'C水浴30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保 護(hù)率為82.39%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為75.03%。
實(shí)施例15
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)青春雙歧桿菌CB折6fok7cteWww acfo/esce"fe BA15)。將該發(fā)酵液2500rpm離心12min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，6000rpm離心8min，棄上清，留菌體，菌泥1.5倍體積加入 保護(hù)劑F (水蘇糖1.8%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%), 混勻，37.5。C水浴平衡40min,液氮速凍60s，冷凍干燥18h，立即復(fù)水， 37.5'C水洛30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保 護(hù)率為80.99%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為74.47%。
實(shí)施例16
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)雞雙歧桿菌(及:/^oZ)acteWwwpw〃oram B!)。 將該發(fā)酵液2500rpm離心llmin，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗 滌，4500rpm離心5min，棄上清，留菌體，菌泥2.5倍體積加入保護(hù)劑E (水蘇糖2.0%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉8% )，混勻，37.5°C 水浴平衡20min，液氮速凍30s,冷凍干燥18h，立即復(fù)水，37.5。C水洛30min， 混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為60.22%。常 溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 53.48%。
實(shí)施例17
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)雞雙歧桿菌CBi/^o6acfeWi/m/w〃orawB3)。 將該發(fā)酵液3500rpm離心8min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗 滌，5000rpm離心5min,棄上清，留菌體，菌泥3倍體積加入保護(hù)劑E(水 蘇糖2.0%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉8%)，混勻，37.5°C 水洛平衡30min，液氮速凍60s,冷凍干燥18h,立即復(fù)水，37.5-C水浴30min, 混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為57.28%。常 溫保存1月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 50,08%。
實(shí)施例18
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)小雞雙歧桿菌1.2240 (CGMCC)。將該發(fā)酵液5500rpm離心10min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌， 5500rpm離心8min，棄上清，留菌泥(bacteria mire， BM)，菌泥3倍體 積加入保護(hù)劑C (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.5%、脫脂奶粉 10%),混勻，37。C水浴平衡45min，液氮速凍30s，再低溫(-30。C)預(yù)冷 凍2小時(shí)，冷凍干燥18h，立即復(fù)水，37.8。C水浴30min，混勻，連續(xù)稀 釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為89.14%。常溫保存6月后 同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為81.86%。
實(shí)施例19
按照實(shí)施例8中的方法培養(yǎng)小雞雙歧桿菌1.2240 (CGMCC)。將該發(fā) 酵液9000rpm離心4min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，6500rpm 離心5min，棄上清，留菌體，將上述菌泥繼續(xù)用生理鹽水洗滌，7500rpm 離心5min，棄上清得洗滌菌泥(washed bacteria mire, WBM),按菌泥3倍 體積加入保護(hù)劑C(水蘇糖2.0。/。、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉 8%)，混勻，37。C水浴平衡45min,液氮速凍60s,再低溫(-3(TC)預(yù)冷 凍1小時(shí)，冷凍干燥24h，立即復(fù)水，37.8。C水洛30min，混勻，連續(xù)稀 釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為77.08%。常溫保存6月后 同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為68.12%。
實(shí)施例20
在適宜條件下培養(yǎng)兩歧雙歧桿菌1.2212 (CGMCC)。將該發(fā)酵液 4500rpm離心8min,棄上清，留菌體，將上述菌體繼續(xù)用生理鹽水洗滌， 8500rpm離心3min，棄上清得洗滌菌泥(washed bacteria mire, WBM)， 按 菌泥3倍體積加入保護(hù)劑C(水蘇糖3%、谷氨酸納0.6%、半乳糖1%、脫 脂奶粉15%)，混勻，37。C水洛平衡45min,液氮速凍100s,再低溫(-30。C ) 預(yù)冷凍2小時(shí)，冷凍干燥24h,立即復(fù)水，37.8。C水浴30min，混勻，連 續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為90.13%。常溫保存6 月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為84.81%。
其所述的在適宜條件下培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為肉湯提取物3g,胰蛋白胨(BBL公司生產(chǎn))5g,酵母提取物5g,蛋白質(zhì)酶解物No.3(Difco公司生 產(chǎn))10g,植酮(BBL公司生產(chǎn))3g,肝浸出物150ml，葡萄糖10g，可溶性 淀粉0.5g，溶液A10ml，溶液B5ml，吐溫-80 lg， L-半胱氨酸鹽酸鹽溶 液10ml(0.05g/L)，馬血50ml，蒸餾水825ml， pH7.2。動(dòng)物浸膏的制備 加10 g干粉于170 ml水中，5(TC到6(TC下保溫lh,加熱至沸騰，維持5 min,調(diào)pH7.2，過濾。鹽溶液A: KH2P04 10g, K2HP04 10g，水lOOml。 鹽溶液B: MgS04.7H20 4g， MnS04'H20 0.2g, FeS04.7H20 0.2g， NaCl 0.2g， 水lOOml。也可以是其他乳酸菌培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基(液體)121。C滅菌 15min,冷卻備用；厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35。C，每間隔2 3h進(jìn)行120rpm 攪拌，持續(xù)10min,培養(yǎng)48-72小時(shí)，得到該雙歧桿菌的發(fā)酵液。
實(shí)施例21
按照實(shí)施例20的方法培養(yǎng)動(dòng)物雙歧桿菌1.2268 (CGMCC)。將該發(fā) 酵液7000rpm離心8min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，2500rpm 離心5min,棄上清，留菌體，將上述菌泥繼續(xù)用生理鹽水洗滌，9500rpm 離心3min，棄上清得洗滌菌泥(washed bacteria mire, WBM),按菌泥3倍 體積加入保護(hù)劑C(水蘇糖2.5。/。、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.5%、脫脂奶粉 10%),混勻，37。C水洛平衡45min,液氮速凍75s，再低溫(-30。C)預(yù)冷 凍3小時(shí)，冷凍干燥24h,立即復(fù)水，37.8。C水洛30min，混勻，連續(xù)稀 釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為90.47%。常溫保存6月后 同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為81.32%。
實(shí)施例22
按照實(shí)施例20的方法培養(yǎng)嬰兒雙歧桿菌1.2202 (CGMCC)。按實(shí)施 例21的方法制備菌泥和凍干保護(hù)，得到該菌凍干粉的的保護(hù)率為80.11%。 6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為69.89%。
實(shí)施例23
按照實(shí)施例20的方法培養(yǎng)豬雙歧桿菌1.2184 (CGMCC)、備菌泥和
18凍干保護(hù)，得到該菌凍干粉的的保護(hù)率為83.04%。常溫保存3月后同樣 的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為76.45%。
實(shí)施例24
按照實(shí)施例20的方法培養(yǎng)長(zhǎng)雙歧桿菌1.2186 (CGMCC),按實(shí)施例 21的方法制備菌泥和凍干保護(hù)，得到該菌凍干粉的的保護(hù)率為79.44%。 常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 66.32%。
實(shí)施例25
在適宜條件下培養(yǎng)德氏乳桿菌保加利亞亞種(厶A/Z^wech7 wfep 5w/gaWc附)1.2161 (CGMCC)。將該發(fā)酵液8500rpm離心5min，棄上清， 留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，8000rpm離心5min，棄上清，留菌體， 菌泥2.5倍體積加入保護(hù)劑G(水蘇糖1.5%、谷氨酸鈉0.2%、半乳糖1.2%、 脫脂奶粉10%),混勻，37.5t:水洛平衡30min,液氮速凍30s,冷凍干燥 20h,立即復(fù)水，37.5。C水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率， 得到保護(hù)劑的保護(hù)率為63.63%。常溫保存1月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存 活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為56.70%。
其所述的在適宜條件下培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為酪蛋白胨10g/L，肉湯 提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫-80 lg/L,K2HP04 2g/L, 醋酸鈉5g/L，檸檬酸二銨2g/L， MgS04'7H20 0.2g/L， MnS04'H20 0.05g/L， pH6.2~6.5，也可以是其他乳酸菌培養(yǎng)基。以上液體培養(yǎng)基經(jīng)12廣C滅菌 15 min，冷卻備用；培養(yǎng)溫度35°C ，每間隔2 ~ 3h進(jìn)行120rpm攪拌lOmin, 培養(yǎng)18-72小時(shí)，得到該菌的發(fā)酵液。
實(shí)施例26
在適宜條件下培養(yǎng)干酪乳桿菌(丄.coy" ) 1.539 (CGMCC)。將該發(fā) 酵液lOOOOrpm離心7min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌， 6000rpm離心8min，棄上清，留菌體，菌泥2.5倍體積加入保護(hù)劑H (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉10%),混勻，37.5°C 水浴平衡35min,液氮速凍40s，冷凍干燥20h,立即復(fù)水，37.5。C水洛30min, 混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為90.63%。常 溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 82.69%。
所述的在適宜條件下培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為蛋白胨10克，牛肉膏IO 克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氫二鉀2克，醋酸鈉5克，檸檬 酸銨2克，硫酸鎂0.2克，硫酸錳0.2克，吐溫-80 1亳升，水1000毫升， 瓊脂1.5~2.0%， pH6.2~6.5,也可以是其他乳酸菌培養(yǎng)基。以上液體培 養(yǎng)基經(jīng)121。C滅菌15min，冷卻備用；培養(yǎng)溫度35。C,每間隔2 3h進(jìn)行 120rpm攪拌10min，培養(yǎng)18 72小時(shí)，得到該菌的發(fā)酵液。
實(shí)施例27
按照實(shí)施例25的方法培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌(Z^/z"m"w^ CICC 6157)。將 該發(fā)酵液8000rpm離心10min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌， 7000rpm離心7min，棄上清，留菌體，菌泥2.0倍體積加入保護(hù)劑H (水 蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉10%),混勻，37.5°C 水浴平衡35min,液氮速凍20s,冷凍干燥20h,立即復(fù)水，37.5。C水洛30min， 混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為83.33%。常 溫保存1月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 75.36%。
實(shí)施例28
按照實(shí)施例20的方法培養(yǎng)培養(yǎng)嗜酸乳桿菌(厶ac^fo; /2z7w) 1.2467 (CGMCC)。將該發(fā)酵液9500rpm離心8min，棄上清，留菌體，取一定量 生理鹽水洗滌，9000rpm離心6min,棄上清，留菌體，菌泥2.0倍體積加 入保護(hù)劑I (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉10% ), 混句，37.8。C水浴平衡45min,液氮速凍40s，冷凍干燥20h，立即復(fù)水， 37.(TC水浴30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保
20護(hù)率為89.35%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為85.03%。
所述的在適宜條件下培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為酪蛋白胨10g/L,肉湯提 取物10g/L，酵母提取物5g/L,葡萄糖20g/L，吐溫-80 lg/L， K2HP042g/L, 醋酸鈉5g/L，杼檬酸二銨2g/L，MgS04'7H20 0.2g/L, MnS04'H20 0.05g/L， pH 6.2-6.5，也可以是其他乳酸菌培養(yǎng)基。以上液體培養(yǎng)基經(jīng)12廣C滅菌 15 min,冷卻備用；培養(yǎng)溫度35°C ，每間隔2 ~ 3h進(jìn)行120rpm攪拌10min， 培養(yǎng)18~72小時(shí)，得到該菌的發(fā)酵液。
實(shí)施例29
按照實(shí)施例26的方法培養(yǎng)植物乳桿菌(丄.p/a"tor"m) 1.242 (CGMCC)。 將該發(fā)酵液3500rpm離心12min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗 滌，8000rpm離心8min，棄上清，留菌體，菌泥2.0倍體積加入保護(hù)劑I (水蘇糖2.5%、谷氨酸納0.4%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉10%)，混勻， 37.8。C水洛平衡45min，液氮速凍40s，冷凍干燥20h，立即復(fù)水，37.0°C 水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為 81.30%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù) 率為70.28%。
實(shí)施例30
按照實(shí)施例26的方法培養(yǎng)戊糖片球菌(尸^fococcw / e"toy"cew力 10196 (CICC)。將該發(fā)酵液4000rpm離心13min,棄上清，留菌體，取 一定量生理鹽水洗滌，12000rpm離心4min，棄上清，留菌體，菌泥2.0 倍體積加入保護(hù)劑I (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.0%、脫脂 奶粉10%)，混勻，37.8。C水浴平衡45min,液氮速凍80s,冷凍干燥24h， 立即復(fù)水，37.0'C水洛30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到 保護(hù)劑的保護(hù)率為82.76%。常溫保存3月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率， 得到保護(hù)劑的保護(hù)率為73.19%。實(shí)施例31
在適宜條件下培養(yǎng)糞腸球菌C&^racocc^s/^cafc)1.125。將該發(fā)酵液 4000rpm離心15min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，5000rpm 離心8min,棄上清，留菌體，菌泥2.0倍體積加入保護(hù)劑J(水蘇糖3.0。/。、 谷氨酸鈉0.2%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉10%),混勻，37.8。C水洛平衡 45min，液氮速凍30s，冷凍干燥22h,立即復(fù)水，37.5。C水洛30min，混 句，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為78.26%。常溫 保存6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為65.03%。
所述的在適宜條件下培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為酵母浸膏7.5克，蛋白胨 7.5克，葡萄糖10克，磷酸二氫鉀2克，番茄汁100亳升，吐溫80 0.5亳 升，水900毫升，pH7.0,也可以是其他乳酸菌培養(yǎng)基。以上液體培養(yǎng)基 經(jīng)12rC滅菌15 min,冷卻備用；培養(yǎng)溫度35。C ,每間隔2 ~ 3h進(jìn)行120rpm 攪拌10min,培養(yǎng)18-72小時(shí)，得到該菌的發(fā)酵液。
實(shí)施例32
按照實(shí)施例26的方法培養(yǎng)屎腸球菌(五"&racoccw /aec/wm) 1.2334 (CGMCC)。將該發(fā)酵液11000rpm離心6min，棄上清，留菌體，取一定 量生理鹽水洗滌，5500rpm離心8min,棄上清，留菌體，菌泥2.5倍體積 加入保護(hù)劑J(水蘇糖3.0%、谷氨酸鈉0.2%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉10% ), 混勾，37.8。C水洛平衡45min，液氮速凍30s,冷凍干燥24h，立即復(fù)水， 37.5。C水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保 護(hù)率為90.55%。低溫保存12月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為83.65%。
實(shí)施例33
按照實(shí)施例26的方法培養(yǎng)乳酸片球菌(尸W/ococcMS acW/a"z'c/) 1.4 (CGMCC)。將該發(fā)酵液12000rpm離心5min,棄上清，留菌體，取一定 量生理鹽水洗滌，11000rpm離心5min，棄上清，留菌體，菌泥2.5倍體 積加入保護(hù)劑I (水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉10%),混勻，37.8。C水浴平衡45min,液氮速凍80s,冷凍干燥24h，立即 復(fù)水，37.5匸水洛30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為89.13%。低溫保存8月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得 到保護(hù)劑的保護(hù)率為84.37%。
實(shí)施例34
按照實(shí)施例31的方法培養(yǎng)乳酸乳球菌(丄actococc附/ac"cs ) l.2829 (CGMCC)。將該發(fā)酵液9500rpm離心7min,棄上清，留菌體，取一定 量生理鹽水洗滌，9500rpm離心4min,棄上清，留菌體，菌泥2.5倍體積 加入保護(hù)劑I(水蘇糖2.5%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉10% )， 混勻，37.8。C水浴平衡45min，液氮速凍30s,冷凍干燥24h，立即復(fù)水， 37.5。C水洛30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保 護(hù)率為87.80%。低溫保存IO月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為80.05%。
實(shí)施例35
按照實(shí)施例31的方法培養(yǎng)乳酸乳球菌(丄actococcws /acri")23609 (CICC)。將該發(fā)酵液7500rpm離心9min,棄上清，留菌體，取一定量生 理鹽水洗滌，10000rpm離心5min,棄上清，留菌體，菌泥2.5倍體積加 入保護(hù)劑K(水蘇糖3.5%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉12% )， 混勻，37.8。C水洛平衡45min，液氮速凍30s，冷凍干燥24h，立即復(fù)水， 37.5'C水洛30min,混句，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保 護(hù)率為90.88%。低溫保存12月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù) 劑的保護(hù)率為86.01%。
實(shí)施例36
在適宜條件下培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母(Ow必/a W/fe) 2.1004 (CGMCC)。 將該發(fā)酵液4500rpm離心14min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗 滌，6500rpm離心8min，棄上清，留菌體，菌泥2.5倍體積加入保護(hù)劑L(水蘇糖3.5%、谷氨酸鈉0.6%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉15%)，混勻，37.8。C水洛平衡45min,液氮速凍30s，冷凍干燥24h，立即復(fù)水，37.5°C水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為92.08%。常溫保存6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為84.19°/。。
所述的適宜培養(yǎng)條件為先按照后述的產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)基配方配制液體培養(yǎng)基，經(jīng)121。C,滅菌30分鐘，pH=5.8~6.0,冷卻到32 37。C,然后接種產(chǎn)朊假絲酵母5% ( V/V)于32。C培養(yǎng)35小時(shí)，攪速220rpm，通氣量為2.5VVM，得到產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵液；所述的產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)液為按下述比例配制的混合液120目豆粕粉0.9%、 120目魚粉0.8%、 120目玉米面0.9°/。、葡萄糖0.8%、 NaCl 0.2%、 Na2HP04 0.5%,消泡劑0.03%。也可使用其它酵母培養(yǎng)基配方。
實(shí)施例37
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)釀酒酵母(5bcc/wrrawjc&s cerev"/ae) 2.1793(CGMCC)。將該發(fā)酵液6000rpm離心8min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，9000rpm離心7min,棄上清，留菌體，菌泥3倍體積加入保護(hù)劑M(水蘇糖2.0%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖0.4%、脫脂奶粉15% )，混勾，37。C水洛平衡40min，液氮速凍80s，冷凍干燥20h，立即復(fù)水，37.8°C水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為90.33%。低溫保存9月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為81.65%。
實(shí)施例38
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)深紅酵母(/ /zodotonJa ra6ra ) 2.1515(CGMCC)。將該發(fā)酵液7500rpm離心llmin，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，4500rpm離心5min，棄上清，留菌體，菌泥3倍體積加入保護(hù)劑N (水蘇糖3.5%、谷氨酸鈉0.6%、半乳糖0.4%、脫脂奶粉6% )，混勻，37。C水洛平衡45min，液氮速凍80s，冷凍干燥18h，立即復(fù)水，37.8°C水浴30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為83.76%。常溫保存6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為76.61%。
實(shí)施例39
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)中國(guó)紅酵母(i /^^fon^ w'"e"w》)2.1391(CGMCC)。將該發(fā)酵液8000rpm離心13min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，5000rpm離心8min，棄上清，留菌體，菌泥3倍體積加入保護(hù)劑O(水蘇糖3.0%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12% ),混勻，37。C水洛平衡40min,液氮速凍80s,冷凍干燥20h,立即復(fù)水，37.8°C水浴30min，混勾，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為90.35%。常溫保存6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為85.36%。
實(shí)施例40
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)中國(guó)紅酵母(i /wdoton^ w'"era^ ) ll^l(CGMCC)。將該發(fā)酵液4000rpm離心10min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，5000rpm離心8min,棄上清，留菌體，菌泥3倍體積加入保護(hù)劑P(水蘇糖3.0%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖1.0%、脫脂奶粉10%),混勻，37。C水浴平衡40min,液氮速凍80s，冷凍干燥20h，立即復(fù)水，37.8°C水洛30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為91.30%。常溫保存6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為86.43%。
實(shí)施例40
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)中國(guó)紅酵母(i /zocfoton//fl W"e"^ ) 2.1391(CGMCC)。將該發(fā)酵液4000rpm離心10min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，6000rpm離心7min，棄上清，留菌體，菌泥3倍體積加入保護(hù)劑Q(水蘇糖5.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.5%、脫脂奶粉12.5%),
25混勻，37。C水浴平衡40min,液氮速凍80s,冷凍干燥20h,立即復(fù)水，37°C水洛30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為88.55%。常溫保存6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為83.64%。
實(shí)施例41
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)中國(guó)紅酵母(i /2ocfotonJ" s/"ms" ) 2.l391(CGMCC)。將該發(fā)酵液2000rpm離心15min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，12000rpm離心3min,棄上清，留菌體，菌泥3.5倍體積加入保護(hù)劑Q (水蘇糖3.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.5%、脫脂奶粉12.5%),混勻，20。C水浴平衡70min，液氮速凍15s, 18""C預(yù)冷lh,冷凍干燥20h，立即復(fù)水，37。C水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為87.30%。 6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為82.14°/。。
實(shí)施例42
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)中國(guó)紅酵母(i /zc^otora/a w'"m^ ) 11391(CGMCC)。將該發(fā)酵液12000rpm離心5min，棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，8000rpm離心5min，棄上清，留菌體，菌泥0.5倍體積加入保護(hù)劑K(水蘇糖3.5%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉12% ),混勻，37.8。C水洛平衡20min,液氮速凍15s,冷凍干燥30h，立即復(fù)水，38.5。C水浴20min，混句，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為88.35%。低溫保存12月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為80.37°/。。
實(shí)施例43
按照31的方法培養(yǎng)乳酸乳球菌(Z"cto""船/oc//c5)23609 ( CICC )。將該發(fā)酵液8000rpm離心8min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，5000rpm離心7min，棄上清，留菌體，菌泥1.5倍體積加入保護(hù)劑K(水蘇糖3.5%、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉12%)，混勻，37。C水浴平衡40min，預(yù)冷凍4h，冷凍干燥16h,立即復(fù)水，37。C水浴30min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為86.75%。 6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為82.62%。
實(shí)施例44
按照實(shí)施例31的方法培養(yǎng)乳酸乳球菌(丄a"ococc^ /""/cs)23609(CICC)。將該發(fā)酵液8000rpm離心8min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，5000rpm離心7min,棄上清，留菌體，菌泥1.5倍體積加入保護(hù)劑K(水蘇糖3.5。/。、谷氨酸鈉0.4%、半乳糖1.2%、脫脂奶粉12%)，混句，37。C水洛平衡40min，預(yù)冷凍4h,冷凍干燥16h，立即復(fù)水，37°C水浴45min，混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為86.75%。 6月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為82.62%。
實(shí)施例45
按照實(shí)施例36的方法培養(yǎng)中國(guó)紅酵母(A/zoctotorw/a W"e"w、 ) 2.1391(CGMCC)。將該發(fā)酵液7000rpm離心9min,棄上清，留菌體，取一定量生理鹽水洗滌，6000rpm離心6min,棄上清，留菌體，菌泥3.5倍體積加入保護(hù)劑Q (水蘇糖3.5%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.5%、脫脂奶粉12.5%),混勻，37。C水浴平衡40min,預(yù)冷凍1.5h，液氮速凍20s，冷凍干燥20h,立即復(fù)水，37。C水洛30min,混勻，連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為89.90%。低溫保存9月后同樣的復(fù)水步驟計(jì)算存活率，得到保護(hù)劑的保護(hù)率為82.25%。
權(quán)利要求
1、水蘇糖在制備冷凍干燥菌劑中的應(yīng)用。
2、 含有水蘇糖的冷凍干燥保護(hù)劑。
3、 如權(quán)利要求2所述的冷凍干燥保護(hù)劑，其組成按重量體積百分比含有水蘇糖 0.8 ~ 5.5%谷氨酸鈉 0.1 ~ 0.6%半乳糖 0.4-1.5%脫脂奶粉6-15% 。
4、 如權(quán)利要求3所述的冷凍干燥保護(hù)劑，其特征在于，其組成按重量體積百分比含有水蘇糖 1.8-3.5%谷氨酸鈉 0.2-0.5%半乳糖 0.5-1.2%脫脂奶粉8.5-12.5% 。
5、 如權(quán)利要求3所述的冷凍干燥保護(hù)劑，其特征在于，其組成按重量體積百分比含有水蘇糖 3%谷氨酸鈉 0.3%半乳糖 1%脫脂奶粉10% 。
6、 權(quán)利要求2 5任一項(xiàng)所述冷凍干燥保護(hù)劑在微生物冷凍干燥中的應(yīng)用。
7、 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述微生物為雙歧桿菌、乳酸菌或酵母菌。
8、 一種菌劑的制備方法，包括如下步驟制備菌泥，向菌泥中加入0.5-3.5倍菌泥體積的權(quán)利要求2 5任一項(xiàng)所述的保護(hù)劑，混勻，20.0~`37.8。C水洛平衡20~70min，液氮速凍15 ~ 100s和/或在-18。C -40。C預(yù)冷 凍1 4小時(shí)，然后冷凍干燥16~30h。
9、 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述菌泥的制備方法是 將微生物發(fā)酵液2000 12000rpm離心5 15min,棄上清，留菌泥。
10、 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在乎，還包括將所述菌泥繼續(xù) 用生理鹽水洗滌，然后2000~ 12000rpm離心3 ~ 8min,棄上清得洗滌菌
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物冷凍干燥保護(hù)劑，其以水蘇糖為保護(hù)劑的主要成分之一，含有水蘇糖0.8～3.5％、谷氨酸鈉0.1～0.6％、半乳糖0.4～1.5％以及脫脂奶粉6～15％。本發(fā)明將水蘇糖應(yīng)用于菌種的冷凍干燥保護(hù)，作為凍干保護(hù)劑的成分之一，拓寬了水蘇糖的應(yīng)用。將水蘇糖與谷氨酸鈉等試劑優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，形成了很好的凍干保護(hù)劑的組合。其對(duì)短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌等多種雙歧桿菌和乳酸桿菌、乳球菌等多種乳酸菌都有很高的凍干保護(hù)率且保護(hù)效果穩(wěn)定。解決了微生態(tài)制劑研究中凍干保護(hù)劑復(fù)雜且保護(hù)效果差異大的問題，也為雙歧桿菌、乳酸菌類、酵母菌等益生菌的保藏提供了很好的保護(hù)劑的組方，有利于菌種在保藏過程中的穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N1/04GK101649293SQ20091009197
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月2日
發(fā)明者張日俊, 梁曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)