專利名稱：：鑒定致病性念珠菌的專用探針與基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鑒定致病性念珠菌的專用探針與基因芯片。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著高效廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，抗腫瘤治療的深入開展，器官移植和外科其它介入性治療的長足發(fā)展，由各種原因引起的侵襲性真菌感染的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，而且嚴(yán)重危及患者的生命。例如念珠菌血癥已躍居院內(nèi)致死性血行感染的第一位，念珠菌所致的深部感染的防治已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)實踐中十分重要的課題，已經(jīng)引起廣大醫(yī)務(wù)工作者的廣泛重視。引起念珠菌感染的病原菌除了最常見的白念珠菌外，由克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌等引起的感染也逐漸增多，這些新近出現(xiàn)的病原性念珠菌對傳統(tǒng)的抗真菌藥物氟康唑多不敏感，例如克柔念珠菌和光滑念珠菌對氟康唑天然耐藥，近平滑念珠菌對棘白球素類藥物天然耐藥。傳統(tǒng)用于念珠菌感染的檢査手段主要包括真菌鏡檢、培養(yǎng)、鑒定以及抗真菌藥物敏感性測定等，但是這些方法往往需時長，大約需要3-4周；而且檢測的陽性率低，如血培養(yǎng)的陽性率大約只有50%。這些特點(diǎn)使得快速、敏感、特異地檢測常見致病性念珠菌并對其進(jìn)行種水平的鑒定，成為臨床上迫切需要解決的重要問題；這一問題的解決，對于正確的診斷、合理選擇敏感的藥物并制定治療方案具有十分重要的意義。分子生物學(xué)相關(guān)的從臨床標(biāo)本中直接檢測真菌的技術(shù)和方法正在不斷發(fā)展中，最為活躍的PCR技術(shù)較真菌培養(yǎng)等方法當(dāng)然具有快速、敏感等特點(diǎn)，該技術(shù)可以擴(kuò)增血清、血漿、全血、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液和膿液等標(biāo)本中的真菌成份。但是，目前所用PCR方法仍然不能快速、特異地檢測臨床標(biāo)本中的念珠菌并進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定，從而幫助臨床醫(yī)生選擇合理的抗真菌藥物。導(dǎo)流雜交技術(shù)(Flow-throughhybridization,US專利號6020187和5741647)是將探針固定在質(zhì)基體上，檢測樣品流經(jīng)置于導(dǎo)流雜交裝置的質(zhì)基體時，靶序列與探針雜交形成復(fù)合體，然后通過顯色來檢測雜交復(fù)合體從而反映出被檢測樣品中的核酸靶分子；這項技術(shù)較傳統(tǒng)的雜交方法具有特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)；如果能夠?qū)⑦@項技術(shù)與高通量低密度基因芯片技術(shù)和靈敏性高的PCR技術(shù)結(jié)合起來，則可以在檢測臨床標(biāo)本中的常見致病性念珠菌，以及進(jìn)行念珠菌菌種鑒定時發(fā)揮快速、特異的積極作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鑒定致病性念珠菌的專用探針與基因芯片。本發(fā)明提供了一種鑒定致病性念珠菌的專用探針，由如下24個DNA片段中的至少一個組成核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列12的12個DNA片段和核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列12的反向互補(bǔ)序列的12個DNA片段。以上24個DNA片段，均是根據(jù)不同種的念珠菌的保守序列設(shè)計的，其中每個DNA片段，或每兩個DNA片段、每三個DNA片段、每四個DNA片段，，直至全部DNA片段的組合，均可用于鑒定致病性念珠菌。本發(fā)明還保護(hù)用于鑒定致病性念珠菌的DNA芯片，含有以上任一所述的專用探針。本發(fā)明同時保護(hù)鑒定致病性念珠菌的裝置，包括以上任一所述的專用探針或以上任一所述的DNA芯片。所述裝置還可包括序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對。為了便于檢測待測DNA與所述探針的雜交結(jié)果，所述引物對上可標(biāo)記有生物素。以上任一所述的專用探針、以上任一所述的DNA芯片或以上任一所述的裝置均可應(yīng)用于鑒定致病性念珠菌。以上所述專用探針、所述DNA芯片、所述裝置或所述應(yīng)用中，所述致病性念珠菌具體可為白念珠菌(C朋G^/aa7力ic朋s)、光滑念珠菌(Ca/2&Va^/aZ^a")、克柔念珠菌(Ca/2o^WaA/use力、近平滑念珠菌(Ca/c^/apara;w7os^s)、都柏林念珠菌(Ca/jo^.o^G^7!'/ie"57.50、熱帶念珠菌(CaM/o^tr柳'ca7j'51)等。本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定致病性念珠菌的方法，是將待測念珠菌的rDNA的ITS區(qū)分別與以上任一所述的專用探針中的每個DNA片段雜交，根據(jù)雜交結(jié)果鑒定待測念珠菌。所述待測念珠菌的rDNA的ITS區(qū)具體可為以待測念珠菌的總DNA為模板，用序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA。所述方法中，所述致病性念珠菌具體可為白念珠菌(C朋&Vaa7Z^'c朋s)、光滑念珠菌(C朋o^/a《7aZ^a")、克柔念珠菌(Ca/7rf2WaA2Y/se力、近平滑念珠菌(C3/rf2'0^pars;577as7'50、都柏林念珠菌(Ca/o7ofeG^iWi/7i朋5^50、熱帶念珠菌(C朋a7fl^tro/w'csh's)等。念珠菌的方法，其特征在于所述致病性念珠菌具體可為白念珠菌(C朋&Was7&'c朋s)、光滑念珠菌(C朋oWa《7*3t3)、克柔念珠菌(C朋c/油itmse力、近平滑念珠菌(Ca/d/油/ara/75"/7057'5")、都柏林念珠菌(6^/70^0^oW7i/2ie/75^51)、熱帶念珠菌(Cs/o7fifetropicW^);所述方法包括如下步驟以待測樣本的總DNA為模板用序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)DNA;將目標(biāo)DNA分別與序列表的序列1至序列表的序列12所示DNA片段進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果評判如下如果序列l(wèi)(CA1)和/或序列2(CA2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有白念珠菌(C朋o^/aa7&'ca/AS);如果序列3(CD1)和/或序列4(CD2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有都柏林念珠菌(C朋^VsoW;h'/2J'e/75^s);如果序列5(CG1)和/或序列6(CG2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有光滑念珠菌(C朋力Va^ZaZ^a&);如果序列7(CK1)和/或序列8(CK2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有克柔念珠菌(CsT2&Wa^T/se力；如果序列9(CT1)和/或序列10(CT2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有熱帶念珠菌(C朋&Wsfrc^'cs力's);如果序列l(wèi)l(CP1)和/或序列12(CP2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有近平滑念珠菌(CMo^/aparapwVasis)。如果僅有一種念珠菌相應(yīng)的探針的雜交結(jié)果為陽性，則待測樣本僅含有該一種念珠菌，如果幾種不同念珠菌相應(yīng)的探針的雜交結(jié)果均為陽性，則待測樣本中含有該幾種念珠菌。本發(fā)明利用PCR法檢測真菌最常用的靶序列之一-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)(Internaltranscriptionalspace,ITS)，這是一個多拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列，其28s、5.8s和18srDNA在種間具有保守性，故可以用于設(shè)計通用引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；而ITS1和ITS2區(qū)具有可變性，因此可以進(jìn)行種特異性探針的選擇。本發(fā)明中將種特異性探針包被在低密度基因芯片膜上，然后將上述PCR產(chǎn)物通過基于導(dǎo)流雜交技術(shù)的檢測平臺，與低密度基因芯片膜上的種特異性探針進(jìn)行導(dǎo)流雜交并顯色，從而最終實現(xiàn)臨床標(biāo)本中常見致病性念珠菌的快速檢測及其準(zhǔn)確的菌種鑒定。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店或生物試劑公司購買得到的。以下實施例中所用的DNA片段如下致病性念珠菌核酸rDNA的ITS區(qū)中的種特異性探針CA1(C朋o7^3a^j'c朋s):5，-AACATTGCTTGCGGCGGTAGCGTCTACCACGTATA-3，；35bp;序列表的序列l(wèi)。CA2(C朋&Vaa7&.ca/^):5，-CGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCT-3，；24bp;序列表的序列2。CD1(C朋A'o^^Wi/^e77^s):5，-TGATAGTGGTATAAGGCGGAGATGC-3，；25bp;序列表的序列3。CD2(C朋心o^f/〃Z^眾ie/7W's):5，-TTGCTAAGGCGGTCTCTGGCGTCGC-3，；25bp;序列表的序列4。CG1(C朋o7o^《7aZ^raZ^):5'-CGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGC-3';30bp;序列表的序列5。CG2(C3/^iVa《7aZw3&):5，-AGTGAGTGATACTCTCGTTTTTGAGTTAACTTGAAAT-3，；37bp;序列表的序列6。CK1(C朋心ofeA/us"):5'-CTTGGCGGCCGAGAGCGAGTGTTGCG-3，；26bp;序列表的序列7。CK2(C朋Wo^Ar〃se/):5，-GGACGACGTGTAAAGAGCGTCGGAGCT-3，；27bp;序列表的序列8。CT1Z^roAZ'cah's):5，-AACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAAT-3，；30bp;序列表的序列9。CT2(C朋^z'fl^tro/^cah's):5，-GAATTTAACGTGGAAACTTATTTTA-3，；25bp;序列表的序列10。CP1(C朋(/j'cfeparaASj7osis):5，-ACTGCATTTTTTCTTACA-3，；18bp;序列表的序列l(wèi)l。CP2(C朋AVapara/7w7o^s):5，-CACTCATTGGTACAAACTCCAAAACT-3，；26bp;序列表的序列12。將上述探針分別包被在基因芯片膜(硝酸纖維素膜)上。擴(kuò)增念珠菌的rDNA的ITS區(qū)的引物對(引物上標(biāo)記有生物素)Forward(序列表的序列13):5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3，；Reverse(序列表的序列14):5，-CGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCG-3，。以下實施例中所用的念珠菌樣本分別購自ATCC，每個菌種樣本的編號如下白念珠菌(C朋&Vaa"ic朋s):ATCC24433;都柏林念珠菌(C朋AV3d〃iWi/^e/^is):ATCCMY646;光滑念珠菌(C朋J油《7aZraZ^):ATCC2001;克柔念珠菌(C朋AVav^wse力ATCC6258;熱帶念珠菌(C3/7力Vafro/w'caJi's):ATCC750;近平滑念珠菌(C朋fl^a/扁戸7。&):ATCC22019。實施例1、致病性念珠菌檢測及菌種快速鑒定將含有已知不同菌種的念珠菌的樣本按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA，然后用上述引物對(序列表的序列13和序列14)進(jìn)行PCR反應(yīng)，之后將PCR產(chǎn)物與標(biāo)記有不同探針(分別為序列1至序列12所示探針)的硝酸纖維素膜通過醫(yī)用核酸分子雜交儀進(jìn)行導(dǎo)流雜交反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果判斷被檢測樣本中的念珠菌種，所需時間為6小時。結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例2、致病性念珠菌混合菌的檢測及菌種的快速鑒定將含有已知的致病性念珠菌混合菌的樣本按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA，然后用上述引物對(序列表的序列13和序列14)進(jìn)行PCR反應(yīng)，之后將PCR產(chǎn)物與標(biāo)記有不同探針(分別為序列1至序列12所示探針)的硝酸纖維素膜通過醫(yī)用核酸分子雜交儀進(jìn)行導(dǎo)流雜交反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果可以判斷被檢測樣本中所存在的混合的念珠菌種，所需時間為6小時。結(jié)果見表2。表2常見致病性念珠菌的鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表<110〉劉偉江濤〈120〉鑒定致病性念珠菌的專用探針與基因芯片<130>CGGNARY92518<160>14〈210〉1<211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>1aacattgcttgcggcggtagcgtctaccacgtata35〈210>2〈211〉24〈212>DNA〈213>人工序列〈220><223〉<400>2cggtagtggtaaggcgggatcgct24<210>3〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉3tgatagtggtataaggcggagatgc25〈210〉4<211〉25<212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉<400>4ttgctaaggcggtctctggcgtcgc25<210>5〈211>30〈212〉廳〈213〉人工序列<220〉<223><400>5cgagcgcaagcttctctattaatctgctgc30〈210>6〈211〉37<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223><400〉6agtgeigtgatactctcgtttttgagttaacttgaaat37<210>7〈211〉26<212>DNA<213〉人工序列<220><223>〈400>7cttggcggccgagagcgagtgttgcg26<210>8〈211〉27<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223><400〉8ggacgacgtgtaaagagcgtcggagct27〈210>9〈211〉30<212〉DNA<213>人工序列<220><223>〈400>9aacgcttattttgctagtggccaccacaat30〈210〉10〈211〉25〈212〉腿〈213>人工序列<220><223〉〈400〉10gaatttaacgtggaaacttatttta25〈210〉11〈211〉18<212〉腿<213>人工序列<220〉〈223〉<400〉11actgcattttttcttaca18〈210>12〈211〉26<212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223><400〉12cactcattggtacaaactccaaaact26〈210〉13<211〉27<212〉DNA〈213>人工序列<220〉<223>〈400〉13tccgtaggtgaacctgcggaaggatca27<210〉14<211〉27<212〉腿<213>人工序列<220><223><400〉14cgcttattgatatgcttaagttcagcg2權(quán)利要求1、鑒定致病性念珠菌的專用探針，由如下24個DNA片段中的至少一個組成核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列12的12個DNA片段和核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列12的反向互補(bǔ)序列的12個DNA片段。2、用于鑒定致病性念珠菌的DNA芯片，含有權(quán)利要求l所述專用探針。3、鑒定致病性念珠菌的裝置，包括權(quán)利要求1所述專用探針或權(quán)利要求2所述DNA芯片。4、如權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于所述裝置還包括序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對。5、如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于所述引物對上標(biāo)記有生物素。6、權(quán)利要求1所述專用探針、權(quán)利要求2所述DNA芯片或權(quán)利要求3至5中任一所述裝置在鑒定致病性念珠菌中的應(yīng)用。7、如權(quán)利要求1所述的專用探針、如權(quán)利要求2所述的DNA芯片、如權(quán)利要求3至5中任一所述的裝置或如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述致病性念珠菌為白念珠菌(Ca/2&VaaJZ^ca/s)、光滑念珠菌(C朋o7g^《7aZ7raz^)、克柔念珠菌(C朋&Va^n/sei)、近平滑念珠菌(C朋o^'o^parapw7os^)、都柏林念珠菌(C朋g^/ao^W/_z'e"57'50或熱帶念珠菌fr卿.ca7/s)。8、一種鑒定致病性念珠菌的方法，是將待測念珠菌的rDNA的ITS區(qū)分別與權(quán)利要求l所述專用探針雜交，根據(jù)雜交結(jié)果鑒定待測念珠菌。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述待測念珠菌的rDNA的ITS區(qū)是以待測念珠菌的總DNA為模板，用序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的；所述致病性念珠菌為白念珠菌(C朋o^/as7&'cs/^)、光滑念珠菌(Cs/7&'a^^i3力ra&)、克柔念珠菌(C朋&VaA/7/se力、近平滑念珠菌(Ca/7c/icfe/ara/7577os7'50、都柏林念珠菌(Ca77fl^a^0^Wi72J'e"57'50或熱帶念珠菌10、一種檢測樣本中含有哪種或哪幾種致病性念珠菌的方法，其特征在于所述致病性念珠菌為白念珠菌(^/&Vaa7Z^c朋s)、光滑念珠菌(C朋^z'A《Zs力r"a)、克柔念珠菌(Ca/k/zVaAn/sej')、近平滑念珠菌(C朋c/2'c/aparapw7ow's)、都柏林念珠菌(6kooWaoW7i/7j'e/57's)或熱帶念珠菌(6k^zV3zLr柳'c3Ji51);所述方法包括如下步驟(1)以待測樣本的總DNA為模板，用序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)DNA;(2)將目標(biāo)DNA分別與序列表的序列1至序列表的序列12所示DNA片段進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果評判如下如果序列l(wèi)和/或序列2的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有白念珠菌s"/c朋s);如果序列3和/或序列4的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有都柏林念珠菌(C朋&Wso^W^ie/^is);如果序列5和/或序列6的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有光滑念珠菌(C朋&Va^a力ra&);如果序列7和/或序列8的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有克柔念珠菌(Ca/2力Vayt/7/se力；如果序列9和/或序列10的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有熱帶念珠菌(Cs/7&'^^ro/^ca7A);如果序列11和/或序列12的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有近平滑念珠菌(&/7心&全文摘要本發(fā)明公開了一種鑒定致病性念珠菌的專用探針與基因芯片。本發(fā)明提供的鑒定致病性念珠菌專用探針，由如下24個DNA片段中的至少一個組成核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列12的12個DNA片段和核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列12的反向互補(bǔ)序列的12個DNA片段。本發(fā)明還提供了含有所述專用探針的用于鑒定致病性念珠菌的DNA芯片。所述專用探針、DNA芯片或裝置均可應(yīng)用于鑒定致病性念珠菌。本發(fā)明中將種特異性探針包被在低密度基因芯片膜上，然后將待測念珠菌的rDNA的ITS區(qū)通過基于導(dǎo)流雜交技術(shù)的檢測平臺，與低密度基因芯片膜上的種特異性探針進(jìn)行導(dǎo)流雜交并顯色，從而最終鑒定出待測念珠菌。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)，可以在檢測臨床標(biāo)本中的常見致病性念珠菌，以及進(jìn)行念珠菌菌種鑒定時發(fā)揮快速、特異的積極作用。文檔編號C12Q1/68GK101638688SQ20091009202公開日2010年2月3日申請日期2009年9月4日優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日發(fā)明者偉劉,張維勝,濤江申請人:劉偉;江濤