專利名稱：懸浮細(xì)胞蝕斑滴定口蹄疫病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及--'種口蹄疫病毒(FMDV)毒價測定方法，具體地講，涉及一種口蹄疫病毒 懸浮細(xì)胞蝕斑測毒方法。
背景技術(shù)：
目前，口蹄疫病毒毒價的測定方法普遍采用細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)和乳鼠半數(shù)致死 量(LD50)這兩種方法。LD50方法需要用到活體動物，活體動物的個體差異將會給檢測結(jié) 果帶來很大的影響。TCID50方法需要提前制備單層細(xì)胞，而且需要在實(shí)驗(yàn)過程中添加血清， 這使得檢測的進(jìn)程受到細(xì)胞生長狀態(tài)的限制，同時檢測結(jié)果也會受到所添加血清的影響。
另外，懸浮細(xì)胞蝕斑測定也是病毒毒價的一種有效測定方法。病毒感染細(xì)胞后，通過固 體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能山最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。經(jīng)過幾個增殖周期，便形成 一個局限性病變細(xì)胞區(qū)，此即病毒蝕斑。從理論上講， 一個蝕斑是由最初感染細(xì)胞的一個病 毒顆粒形成的，因而可通過病毒顆粒計數(shù)測定毒價。通常用瓊脂等固相介質(zhì)防止釋放的病毒 在介質(zhì)中流動，以便將蝕斑控制在適宜的范圍內(nèi)。為便于肉眼觀察，常用中性紅等染料染色。 因病變細(xì)胞不吸收中性紅，病變細(xì)胞區(qū)便呈現(xiàn)無色蝕斑。病毒懸液的滴度可以以每毫升蝕斑 形成單位(PFU/ml)來表示。在實(shí)際操作中，需要配制合適的介質(zhì)，有效地控制接種條件和 反應(yīng)條件才能獲得可靠的測定結(jié)果。目前，還沒有準(zhǔn)確有效的口蹄疫病毒蝕斑測毒方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)化口蹄疫病毒毒價測定方法，以克服現(xiàn)有的口蹄疫 病毒毒價測定方法受到活體動物個體差異等因素影響而帶來的檢測誤差較大的問題。
本發(fā)明提供的口蹄疫病毒毒價測定方法為口蹄疫病毒懸浮細(xì)胞蝕斑測毒方法，包括以下
歩驟
(1) 將瓊脂糖生理鹽水溶液與無血清培養(yǎng)基按照0.9 1.1: 1的體積比混勻，得到瓊脂溶液，
其中，瓊脂糖生理鹽水溶液含有.9 2.1重量％的瓊脂糖和0.85 0.9重量％的鹽；
(2) 將所述瓊脂溶液加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，晃動細(xì)胞培養(yǎng)板，使所述瓊脂溶液鋪滿細(xì)胞培養(yǎng) 板底層，得底層瓊脂培養(yǎng)板，置于平坦的位置，冷卻、凝固；
(3) BHK-21懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，800 1000rpm離心3 5分鐘，得到濃縮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng) 基稀釋濃縮細(xì)胞得到細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為0.6乂107 1.0乂107個/毫升；(4) 106 107倍稀釋待測定的「I蹄疫毒液，得到梯度濃度門蹄疫毒液；
(5) 分別將9 11體積份的各梯度濃度l」蹄疫毒液和9--11體積份的對照液都與39^41體積 份的所述細(xì)胞懸液和48~52休積份的瓊脂糖生理鹽水混合，得到含有各梯度濃度n蹄疫病毒 的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液，其中，瓊脂糖生理鹽水溶液含有1.9~2.1重量％的 瓊脂糖和0.85~0.9重景％的鹽；
(6) 分別將所述含有各梯度濃度U蹄疫病毒的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液加 入到步驟(2)得到的底層瓊脂培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于C02培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24 48小時，得到蝕斑計數(shù)板；
(7) 向蝕斑計數(shù)板內(nèi)加入0.02 0.03重量°/。的中性紅染色液，作用10 30分鐘后，移去中性 紅染色液，對著燈光觀察蝕斑計數(shù)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；
(8) 含有對照用的上層瓊脂溶液的培養(yǎng)孔無蝕斑出現(xiàn)的蝕斑計數(shù)板為有效板，根據(jù)有效板 的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、接種的待測定的口蹄疫病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的口蹄 疫病毒液的毒價。
無血清培養(yǎng)基較佳為BBSM培養(yǎng)基。例如為清大天一公司生產(chǎn)的BBSM培養(yǎng)基，按其說 明書配制。
瓊脂糖生理鹽水溶液中的鹽可以為氯化鈉。 所述細(xì)胞培養(yǎng)板可以為六孔板。
較佳地，C02培養(yǎng)箱的C02體積含量為4 6。/。，溫度為35 37t:。 較佳地，歩驟(8)中，待測定的口蹄疫病毒液的毒
價的計算公式為毒價- 最適稀釋倍數(shù)各孔蝕斑數(shù)的算術(shù)平均數(shù)X最適稀釋倍數(shù) ，
接種毒液量
所述最適稀釋倍數(shù)是指蝕斑數(shù)清晰可辨的稀釋倍數(shù)。
較佳地，所述最適稀釋倍數(shù)為蝕斑數(shù)在8 20個范圍的稀釋倍數(shù)。
該方法的檢測條件均一，可控性強(qiáng)，批間誤差小，能夠?qū)崿F(xiàn)口蹄疫病毒毒價的標(biāo)準(zhǔn)化測 定，此方法可與OIE (世界動物衛(wèi)生組織)的疫雖生產(chǎn)技術(shù)接軌，病毒培養(yǎng)時可根據(jù)感染比 進(jìn)行接毒，合理使用口蹄疫病毒，穩(wěn)定生產(chǎn)。


圖1為蝕斑眼觀狀態(tài)；
圖2為顯微鏡下觀察到的--個蝕斑的狀態(tài)；
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)--- 步說明。 該口蹄疫病毒懸浮細(xì)胞蝕斑測毒方法，包括以下&驟
(1) 將瓊脂糖生理鹽水溶液與無血清培養(yǎng)基按照1:1休積比混勻，得到瓊脂溶液，其屮， 瓊脂糖生理鹽水溶液含有2重量％的瓊脂糖和0.85重量％的NaCl，在微波爐中加熱至徹底溶 解(加熱時，注意出口的透氣性)后4(TC保溫?zé)o血清培養(yǎng)基為清大天一公司生產(chǎn)的BBSM 培養(yǎng)基，按其說明書配制；
(2) 將lml所述瓊脂溶液加至六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，晃動細(xì)胞培養(yǎng)板，使所述瓊脂溶液鋪滿 細(xì)胞培養(yǎng)板底層，得底層瓊脂培養(yǎng)板，置于平坦的位置，冷卻、凝固；
(3) BHK-21懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，900rpm離心5min后，棄上清，加入無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞
稀釋至0.6 lX]CT個/毫升；
(4) 用乳歐液分別以101、 102、 103、 104、 105、 106、 5X106、 107倍的稀釋度稀釋待測定 的口蹄疫毒液，得到梯度濃度口蹄疫毒液；
(5) 分別將106、 5X106、 107濃度口蹄疫毒液和對照液都與所述細(xì)胞懸液和瓊脂糖生理鹽 水混合，得到含有各梯度濃度口蹄疫病毒的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液，其中， 瓊脂糖牛.理鹽水溶液含有2重量°/。的瓊脂糖和0.85重量％的NaCl;各成分的用量如下
名稱體積％
2%瓊脂糖生理鹽水50
細(xì)胞懸液40
毒(對照)液10
(6) 分別將lml所述含有各梯度濃度口蹄疫病毒的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液 加入到歩驟(2)得到的底層瓊脂培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔中，凝固后用封口膜封口 ，倒置于C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)50小時，C02培養(yǎng)箱的C02體積含量為5%，溫度為36.5'C，得到蝕斑計數(shù)板；
(7) 向蝕斑計數(shù)板內(nèi)加入0.025重暈％的中'件紅染色液，作用20分鐘后，移去中性紅染色 液，對著燈光觀察蝕斑計數(shù)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；圖1和圖2分別為服觀和顯微鏡下觀察 的蝕斑狀態(tài)，圖屮用數(shù)字標(biāo)記1代表性地指示了 - 個蝕斑。
(8) 含有對照用的上層瓊脂溶液的培養(yǎng)孔無蝕斑出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)成立，根據(jù)各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、 接種的待測定的口蹄疫病毒液的ffl量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的口蹄疫病毒液的毒價。毒價(PFU/ml)=最適稀釋倍數(shù)各孔蝕斑數(shù)的算術(shù)平均數(shù)X最適稀釋倍數(shù)
接種毒液量
注最適稀釋倍數(shù)為蝕斑數(shù)在8 20個范圍的稀釋倍數(shù)。
實(shí)例圖1中A、 B、 C、 D、 E5個孔為1X1()S稀釋倍數(shù)所做的5個孔，5個孔的蝕斑數(shù) 分別是16、 11、 11、 11、 10， 5個孔的蝕斑數(shù)在8 20個范圍內(nèi)，因此1乂106為最適稀釋
倍數(shù)，如前所述，每孔的毒液量為0.1ml，根據(jù)公式計算得到 (16+11 + 11 + 11 + 10) Z5X106
PFU=
0.1
:1.18X 10。
毫升)
該方法的檢測條件均一，可控性強(qiáng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看批間誤差小于log10113 [*]，能夠 實(shí)現(xiàn)口蹄疫病毒毒價的標(biāo)準(zhǔn)化測定，此方法可與O正(世界動物衛(wèi)生組織)的疫苗生產(chǎn)技術(shù) 接軌，病毒培養(yǎng)時可根據(jù)感染比進(jìn)行接毒，合理使用口蹄疫病毒，穩(wěn)定生產(chǎn)。
P]浙間誤差的計算方法是將同一待檢毒液分裝為lml/支的小劑量，超低溫冰箱保存，分 8次檢測這一待檢毒液，8次檢測的結(jié)果取對數(shù)，并計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差后得到的數(shù)值。
同一病毒液重復(fù)檢測8次，檢測結(jié)果用對數(shù)表示分別為8.523、 8.3013、 8.426、 8.15、 8.21、 8.15、 8.31、 8.18，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13，即為loglOQ13。
權(quán)利要求
1、懸浮細(xì)胞蝕斑滴定口蹄疫病毒的方法，包括以下步驟(1)將瓊脂糖生理鹽水溶液與無血清培養(yǎng)基按照0.9～1.1∶1的體積比混勻，得到瓊脂溶液，其中，瓊脂糖生理鹽水溶液含有1.9～2.1重量％的瓊脂糖和0.85～0.9重量％的鹽；(2)將所述瓊脂溶液加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，晃動細(xì)胞培養(yǎng)板，使所述瓊脂溶液鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)板底層，得底層瓊脂培養(yǎng)板，置于平坦的位置，冷卻、凝固；(3)BHK-21懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，800～1000rpm離心5～8分鐘，得到濃縮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋濃縮細(xì)胞得到細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為0.6×107～1.0×107個/毫升；(4)106～107倍稀釋待測定的口蹄疫毒液，得到梯度濃度口蹄疫毒液；(5)分別將9～11體積份的各梯度濃度口蹄疫毒液和9～11體積份的對照液都與39～41體積份的所述細(xì)胞懸液和48～52體積份的瓊脂糖生理鹽水混合，得到含有各梯度濃度口蹄疫病毒的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液，其中，瓊脂糖生理鹽水溶液含有1.9～2.1重量％的瓊脂糖和0.85～0.9重量％的鹽；(6)分別將所述含有各梯度濃度口蹄疫病毒的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液加入到步驟(2)得到的底層瓊脂培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時，得到蝕斑計數(shù)板；(7)向蝕斑計數(shù)板內(nèi)加入0.02～0.03重量％的中性紅染色液，作用10～30分鐘后，移去中性紅染色液，對著燈光觀察蝕斑計數(shù)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；(8)含有對照用的上層瓊脂溶液的培養(yǎng)孔無蝕斑出現(xiàn)的蝕斑計數(shù)板為有效板，根據(jù)有效板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、接種的待測定的口蹄疫病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的口蹄疫病毒液的毒價。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，
5、 、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法 為4~6%，溫度為36 37°C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，價的計算公式為毒價=最適稀釋倍數(shù)各孔蝕斑數(shù)的算術(shù)平均數(shù)X最適稀釋倍數(shù) ，接種毒液量所述最適稀釋倍數(shù)是指蝕斑數(shù)清晰可辨的稀釋倍數(shù)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述最適稀釋倍數(shù)為蝕斑數(shù)在8 20個范 圍的稀釋倍數(shù)。其特征在于，無血清培養(yǎng)基為BBSM培養(yǎng)基。 其特征在于，瓊脂糖生理鹽水溶液中的鹽為氯化鈉。 其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)板為六孔板。 其特征在于，歩驟(6)中，C02培養(yǎng)箱的C02體積含量其特征在于，歩驟(8)中，待測定的口蹄疫病毒液的毒
全文摘要
本發(fā)明提供了懸浮細(xì)胞蝕斑滴定口蹄疫病毒的方法，包括以下步驟(1)將瓊脂糖生理鹽水溶液與無血清培養(yǎng)基混勻得到瓊脂溶液；(2)將所述瓊脂溶液加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，得底層瓊脂培養(yǎng)板；(3)制得細(xì)胞懸液；(4)稀釋待測定的口蹄疫毒液，得到梯度濃度口蹄疫毒液；(5)得到含有各梯度濃度口蹄疫病毒的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液；(6)分別將所述含有各梯度濃度口蹄疫病毒的上層瓊脂溶液和對照用的上層瓊脂溶液加入到底層瓊脂培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到蝕斑計數(shù)板；(7)中性紅染色，對著燈光觀察蝕斑計數(shù)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；(8)計算毒價。該方法的檢測條件均一，可控性強(qiáng)，批間誤差小。
文檔編號C12Q1/70GK101660006SQ200910092780
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者劉艷霞, 盧永干, 周勁松, 王偉峰 申請人:金宇保靈生物藥品有限公司