專利名稱：一種檢測(cè)人畜共患病病毒的基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)人畜共患病病毒的基因芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人獸共患病是指脊椎動(dòng)物與人類之間自然傳播的疾病和感染疾病?，F(xiàn)在已知的 200多種動(dòng)物傳染病中，至少有170多種屬于人獸共患病。而病毒引起的人獸共患病也在 逐年增加，如禽流感、口蹄疫、非典型性肺炎、狂犬病及多種蟲媒病毒病，以及新出現(xiàn)的尼帕 腦炎、猴痘、西尼羅河熱、拉沙熱、埃博拉出血熱、馬爾堡出血熱等，這些病毒類人獸共患病 疫情傳播迅速、死亡率高。早期、快速進(jìn)行重要人獸共患病病毒高通量篩查與鑒定，可顯著 提高我國應(yīng)對(duì)該類傳染病的能力?；蛐酒夹g(shù)可以在一張芯片上集中成千上萬種探針 信息，因此可一次對(duì)大量靶標(biāo)進(jìn)行平行檢測(cè)，為未知病毒的檢測(cè)與鑒定提供了新的技術(shù)手 段。目前，基因芯片檢測(cè)技術(shù)按探針不同分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片，相比之下，寡核苷 酸芯片探針的制備更容易、檢測(cè)敏感度更高，而且更容易控制相同的點(diǎn)樣濃度及較一致的 雜交條件，不要求像cDNA那樣變性，也消除了能降低雜交效率的復(fù)性問題，在檢測(cè)重復(fù)性 上也優(yōu)于 cDNA 芯片(Yauk CL, Berndt ML, Williams A，et al. Comprehensivecomparison of six microarray technologies[J]. Nucleic Acids Res，2004，32(15) :el24 ；Shippy R，Sendera TJ, Lockner R，et al. Performance evaluation of commercial short—o ligonucleotidemicroarrays and the impact of noise in making cross-platform correlations[J]. BMC Genomics，2004，5(1) :61)。
自 1995 年基因芯片技術(shù)問世以來(Schena M，Shalon D，Davis RW, et al. Quantitativemonitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray [J]. Science 1995,270(5235) :467-470)，20 多年間，基因芯片技術(shù)發(fā)展 迅速，已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域中。在病毒類病原體的檢測(cè)方面，國外進(jìn)行了大規(guī)模 病原體篩查及鑒定和呼吸道病毒的高通量檢測(cè)等研究(Wang D，Coscoy L，Zylberberg M， et al. Microarray-based detection andgenotyping of viral pathogens[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99 (24) :15687-15692 ；Quan PL, Palaciosv G， Jabado 0J. Detection of respiratory viruses and subtype identification ofinfluenza A viruses by GreeneChipResp oligonucleotide microarray[J]. J Clin Microbiol，2007，45(8) 2359-2364)。基因芯片技術(shù)在病原體檢測(cè)方面雖然已取得了很大的進(jìn)展，但主要問題依 然體現(xiàn)在精確性、敏感性、重復(fù)性以及特異性上(Draghici S, Khatri P, Eklund AC et al. Reliability and reproducibility issues in DNA microarray measurements[J]. Trends Genet,2006,22(2) :101-109)。
雜交動(dòng)力學(xué)是影響芯片敏感性、特異性的重要因素。雜交動(dòng)力學(xué)體現(xiàn)在靶分子的 質(zhì)量、雜交和雜交后處理的時(shí)間、雜交溫度和雜交溶液方面。探針與靶核酸正確雜交與不正 確雜交在雜交動(dòng)力學(xué)上完全不同。與探針錯(cuò)配的核酸分子綁定不緊密，分離也較快。雜交溫度越高，靶核酸分子與探針更容易分離，因此芯片特異性會(huì)增高，而敏感性會(huì)降低，但雜 交溫度過高正確的雜交也會(huì)分離。比較低的雜交溫度，如低于42°C，樣品會(huì)不可逆的綁定在 芯片上。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)人畜共患病病毒的基因芯片，該芯片具有較好的 敏感性和檢測(cè)特異性。
本發(fā)明提供的基因芯片包括病毒檢測(cè)探針，其特征在于所述病毒檢測(cè)探針由以 下的探針組成核苷酸序列分別是表2中序列1-150的150個(gè)病毒檢測(cè)探針和核苷酸序列 分別是序列1-150的反向互補(bǔ)序列的150個(gè)病毒檢測(cè)探針。
所述基因芯片上還固定有1條核苷酸序列如表2中序列151所示的陽性對(duì)照探 針。
上述基因芯片由以下探針組成核苷酸序列分別是表2中序列1-150的150個(gè)病 毒檢測(cè)探針、核苷酸序列分別是序列1-150的反向互補(bǔ)序列的150個(gè)病毒檢測(cè)探針和1條 核苷酸序列如表2中序列151所示的陽性對(duì)照探針。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述的基因芯片與待測(cè)生物樣品的核酸進(jìn)行雜交的 方法。
本發(fā)明提供的上述的基因芯片與待測(cè)生物樣品的核酸進(jìn)行雜交的方法，包括以 下步驟將待測(cè)生物樣品的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與上述的基因芯片雜交， 雜交條件是雜交液中的去離子甲酰胺濃度為25-60% (是體積百分比)，雜交的溫度是 42-61°C，雜交的時(shí)間0. 5-6小時(shí)。
上述雜交條件是如下1)或2)或3)或4):
1)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為40-60% (體積百分比)，所述雜交的溫度為 51-61°C，所述雜交的時(shí)間為1-4小時(shí)；
2)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為40-50% (體積百分比)，所述雜交的溫度為 51-54°C，所述雜交的時(shí)間為1-2小時(shí)；
3)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為50-60% (體積百分比)，所述雜交的溫度為 58-61°C，所述雜交的時(shí)間為2-4小時(shí)；
4)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為50% (體積百分比)，所述雜交的溫度為 51°C，所述雜交的時(shí)間為2小時(shí)。
上述基因芯片在雜交前用濃度為0. 25 % (質(zhì)量與總體積之比，0. 25g NaBH4/100ml)的NaBH4進(jìn)行封閉。任一上述的待測(cè)生物樣品是基孔肯亞病毒、日本乙腦病 毒、狂犬病毒或辛德畢斯病毒的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。該擴(kuò)增產(chǎn)物是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)證明芯片雜交前用0. 25% NaBH4進(jìn)行封閉，最優(yōu)雜交條件為雜交液中甲酰 胺含量50% (體積百分比)，雜交溫度51°C，雜交時(shí)間為池。此時(shí)芯片具有較好的敏感性 及檢測(cè)特異性。本實(shí)驗(yàn)從雜交溫度，時(shí)間，雜交液中甲酰胺濃度方面探索對(duì)芯片雜交結(jié)果的 影響，得出了更適合于本檢測(cè)芯片技術(shù)平臺(tái)的雜交動(dòng)力學(xué)結(jié)果。


圖1為錨定隨機(jī)引物方法擴(kuò)增日本腦炎病毒電泳圖，M:核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) DLmarker2000 ；1 日本腦炎病毒擴(kuò)增結(jié)果。
圖2為點(diǎn)樣模式圖。
圖3為芯片封閉前的雜交結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖4為芯片封閉前的雜交結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖5為0.證雜交時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖6為Ih雜交時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖7為池雜交時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖8為4h雜交時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖9為他雜交時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖10為不同雜交時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果的分析比較圖，A 不同雜交時(shí)間的信號(hào)強(qiáng)度；B 不同雜交時(shí)間的信號(hào)數(shù)量。
圖11為48°C雜交溫度下的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖12為51°C雜交溫度下的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖13為雜交溫度下的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖14為58°C雜交溫度下的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖15為61°C雜交溫度下的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖16為不同雜交溫度檢測(cè)結(jié)果的分析比較圖，A 不同雜交時(shí)間的信號(hào)強(qiáng)度；B 不 同雜交時(shí)間的信號(hào)數(shù)量，A的縱坐標(biāo)是Cy5熒光信號(hào)強(qiáng)度；B圖的縱坐標(biāo)是陽性信號(hào)點(diǎn)數(shù)。
圖17為雜交液中25%甲酰胺濃度的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖18為雜交液中33%甲酰胺濃度的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖19為雜交液中40%甲酰胺濃度的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖20為雜交液中50%甲酰胺濃度的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖21為雜交液中60%甲酰胺濃度的檢測(cè)結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖。
圖22不同雜交液成分檢測(cè)結(jié)果的分析比較圖A 不同雜交時(shí)間的信號(hào)強(qiáng)度；B 不 同雜交時(shí)間的信號(hào)數(shù)量，A的縱坐標(biāo)是Cy5熒光信號(hào)強(qiáng)度；B圖的縱坐標(biāo)是陽性信號(hào)點(diǎn)數(shù)。
圖23辛德比斯病毒雜交分析結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖、C 雜交分析結(jié)^ ο
圖M為狂犬病毒雜交分析結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖、C 雜交分析結(jié)果。
圖25為日本腦炎病毒雜交分析結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖、C 雜交分析結(jié)果。
圖沈?yàn)榛卓蟻啿《倦s交分析結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析圖、C 雜交分析結(jié)果。
圖27為日本腦炎病毒的模擬臨床標(biāo)本雜交分析結(jié)果，A 芯片掃描圖、B 結(jié)果分析 圖、C:雜交分析結(jié)果。
圖23-27中的C圖是用Treeview軟件對(duì)各自的B圖中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到的。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
本發(fā)明所用試劑及儀器如下
AMV反轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶購自日本TaKaRa公司。引物和探針由上海生工 生物公司合成。熒光素Cy3及Cy5購自美國Amersham Pharmacia公司。氨基丙 烯-dUTP (Aminoallyl-dUTP, aa-dUTP)購自美國Sigma公司。RNA提取試劑盒，DNA純化試 劑盒，REPLI-g試劑盒均購自德國QIAGEN公司。醛基化玻片CSS-IOOSi Iylated購自美國 CEL Associates公司。Scanarray Gx Plus掃描儀及Spotarray 24生物芯片點(diǎn)樣儀均購 自美國PerkinElmer公司。
本發(fā)明中的雜交結(jié)果Gx Plus掃描儀進(jìn)行掃描，用GenePix Pro 5.0 軟件進(jìn)行分析。在所有的檢測(cè)中，病毒感染的細(xì)胞上清用Cyanine 5(0灼)熒光染料標(biāo)記， 而未感染病毒的細(xì)胞上清陰性對(duì)照用Cyanine 3 (Cy3)熒光染料標(biāo)記，取病毒熒光信號(hào)絕 對(duì)值大于1000和與細(xì)胞熒光信號(hào)強(qiáng)度比值在2. 5以上的點(diǎn)為陽性信號(hào)，用Treeview軟件 對(duì)分析數(shù)據(jù)作圖。
實(shí)施例1.基因芯片檢測(cè)人獸共患病病毒的雜交條件優(yōu)化
一、基因芯片的制備
1、寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)及結(jié)果
1)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)
25種人獸共患病病毒見表1。其中mx)la、Marburg病毒探針的設(shè)計(jì)是通過下載 Genbank上登錄的相關(guān)病毒基因組序列，利用BLAST比較獲得同一種病毒不同分離株的共 有保守序列，按探針Tm值為73°C 士5°C、單堿基重復(fù)數(shù)不能超過8個(gè)堿基和潛在發(fā)夾結(jié)構(gòu) 所在的序列長(zhǎng)度不得大于9個(gè)堿基的原則用Array Designer 4. 0軟件設(shè)計(jì)探針，探針長(zhǎng)度 為 56mer。
表1中的其它病毒的探針參考(Wang D, Coscoy L, Zylberberg Μ, et al. Microarray-baseddetection and genotyping of viral pathogens[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99 (24) :15687-15692)和(Chou CC, Lee TT, Chen CH, et al. Design of microarray probes for virusidentification and detection of emerging viruses at the genus level [J], BMC Bioinformatics，2006，7 :232)所設(shè)計(jì)的探針序列，根據(jù)iTm值 及探針特異性，修改為56mer的種特異性探針。在寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)上，探針越長(zhǎng)，芯片 的敏感性越好，但特異性會(huì)降低。本發(fā)明采用56mer的探針，即保證探針有足夠的長(zhǎng)度能保 證芯片的敏感性，另一方面也避免了因探針長(zhǎng)度過長(zhǎng)導(dǎo)致特異性顯著下降的問題，較好的 平衡了芯片的敏感性與特異性。
為了保證檢測(cè)探針的特異性，在應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)探針設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行探針設(shè)計(jì)之后，首先 應(yīng)用生物信息學(xué)手段和其它物種的基因組進(jìn)行同源性比對(duì)篩查，然后再經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從 理論及實(shí)驗(yàn)上降低了探針的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)和探針點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)對(duì)特異性的影響。本發(fā) 明將獲取的探針用生物信息學(xué)方法驗(yàn)證，剔除特異性差的探針，保證每條寡核苷酸探針與 其它病毒基因組的同源性小于50%。
表1芯片檢測(cè)的病毒種類序號(hào)
Virus病毒中文名稱病毒縮寫1Eastern Equine Encephalitis Virus東方馬腦炎病毒EEE2Western equine encephalitis virus西方馬腦炎病毒W(wǎng)EE3Venezuelan equine encephalitis virus委內(nèi)瑞拉馬腦炎病VEE毒4Chikungunya virus基孔肯亞病毒CHIK5Yellow fever virus黃熱病毒YFV6Lassa virus拉薩熱病毒Lassa7Rift Valley fever virus裂谷熱病毒Riva8Crimea Congo hemorrhagic fever virus新疆出血熱病毒XJHFV9Nipah virus尼帕病毒Nipah10Marburg Virus馬爾堡病毒marburg11Ebola virus愛博拉病毒ebola12Hendra virus亨德拉病毒hendra13Dengue virus登革病毒Dengue virus 1登革病毒1型DENlDengue virus 2登革病毒2型DEN2Dengue virus 3登革病毒3型DEN3Dengue virus 4登革病毒4型DEN414Japanese encephalitis virus日本乙腦病毒JEV15tick-borne encephalitis virus森林腦炎病毒TBE16Vesicular stomatitis virus水泡性口膜炎病毒VSV17Rabies virus狂犬病毒RV18Influenza A virus流感病毒A型IAVH5N1 avian influenza virus禽流感病毒H5N119Influenza B virus流感病毒B型IBV20Foot-and-mouth disease virus口蹄疫病毒FMDV21Hepatitis E virus戊肝病毒HEV22Hantan virus漢坦病毒2324Hantan virus PuumalaHantan virus SeoulHantan virus HantaanSindbis virus West Nile virus漢坦病毒 (Puumala 型) 漢坦病毒(漢城 型)漢坦病毒(漢灘 型)辛德畢斯病毒 西尼羅病毒 馬傳染性貧血病病 毒牛痘病毒HV-PUHV-SEHV-HA SINWNV. 2 EIAV25Equine infectious anemia virus26Cowpox virus牛痘病毒CV
單個(gè)病毒1型、2型、3型、4型都屬于單個(gè)病毒，為單個(gè)病毒的4個(gè)基因型。漢坦病 毒(lee型)、漢坦病毒(Puumala型)、漢坦病毒(漢城型)、漢坦病毒(漢灘型)都屬于漢 坦病毒，為漢坦病毒的不同基因型。H5W亞型禽流感病毒屬于A型流感病毒，為流感病毒A型的一個(gè)亞型。
2)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)結(jié)果
共設(shè)計(jì)150條如序列1-序列150所示的病毒oligo探針及與該150條互補(bǔ)的序列 探針，1條如序列151所示的雜交系統(tǒng)陽性對(duì)照探針P。所有探針長(zhǎng)度均為56mer，Tm值為 730C 士5°C。其中mx)la、Marburg病毒各2條探針，禽流感病毒(HSNl) 6條探針，漢坦病毒 (HV-LEE、HV-PU、HV-SE和HV-HA)共10條探針，其它每種病毒設(shè)計(jì)各5條探針。每條oligo 探針經(jīng)過blast比對(duì)，與其它病毒基因組的同源性小于50%。具體設(shè)計(jì)如表2所示
表2探針序列表
編號(hào)序號(hào)病毒縮寫探針序列ZoOOl序列1EEEcaccatcgcccataaagttgagttcaaacctgtaggaagagagaagtaccgccatcZo002序列2EEEtacgcgaccaggatcaactaagtattgtactgaataacatctatcaaggttctaccZo003序列3EEEttattgacaataagaaatgggtctacaactctggcaaactacctagaggagaaggcZo004序列4EEEtccgagigtggeiELggcaatcEigaaactatcggaggtctacatggacatcgcaaaaatZo005序列5EEEcatcattatggtttcctgtgttacatctgtatggcttctttgccgcactcgcaatcZoOll序列6VEEggctgccacacgaggtgataactcattattaccacagataccctatgtccaccatcZoO 12序列7VEEtggcagcagatgatgaacatgacgatgacaggagaagggcattacacgaagagtcaZoO 13序列8VEEgacatagtctagtccgccaagatgttcccgttccaaccaatgtatccgatgcagccZoO 14序列9VEEccgtattggattcggctgcctttaatgtggaatgcttcaagaaatatgcgtgcaacZoO 15序列10VEEcaacaaagtttcggaagttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccaZo021序列11WEEaacctggagatcacggtcgtctcatcggaattaacaccttcaactaacaaggagtaZo022序列12WEEttcctgttagctcaatgtcctccaggtgacagtgtaaccgtcagtatcacgagcggZo023序列13WEEaactttccaccagtttaccctacaaatccgatggcttaccgagatccaaaccctccZo024序列14WEEtggcaggcagaccaggttactccgtcaatgagggcaagttgtattcatacctggaaZo025序列15WEEgcaattacagcggagcgactcatttctggattgggcacatatctatcatcagaagtZo031序列16CHIKagccctgattgtcctatgcaactgtctgagactcttaccatgctgttgtaaaacgtZo032序列17CHIKtccgaaaggagaaactctgacggtgggattcactgacggtaggaagatcagtcactZo033序列18CHIKcgacaacataatacatggtgtcgtctccgatgaattgatggcagccagatgcgctaZo034序列19CHIKgctccagatccaacttcgagaagctcagaggacccgtcataactttgtacggcggtZo035序列20CHIKtgcagccagcccta/tcaggataacaactgagaatctaacaacctatgtcactaaacZo041序列21YFVgagcttacctggaagaacaagaacagtggaagactgccaatgaggctgtccaagacZo042序列22YFVttggagcttacctggaagaacaagaacagtggaagactgccaatgaggctgtccaaZo043序列23YFVagaggacctctttgggaagaagaacttaattccatctagtgcttcaccctggagttZo044序列24YFVccaacagagatggagactcatactactattctgagcctacaagtgaaaataatgccZo045序列25YFVgctgtcgctcttgactatccgagtggcacttcaggatctcctattgttaacaggaaZo051序列26LassatgtgttggtcaaagtcagttccagtcctgtctcattgcccaccattatgtaatggtZo052序列27LassagctgcatctacagcataactgtgactcaggttgtattgcacactgatcttacccccZo053序列28LassattgttgatcagttgtatactcatctgagcctcggctttcaatctttggatggcttgZo054序列29LassatttccatctcacaggtacaccaggttgtttgtaaacaccacaggagcatatacccaZo055序列30LassacaacatgttagagacaatcaaagtgtcaccccaaacaatggatggtattctcaagtZo061序列31RivagttttcatttgttggggaaagcacgaccatgcgagagaataagtgttttgagcagtZo062序列32RivattcctcgtcatgccccaatcccacgttatagcacatacctgatgttattattgattZo063序列33RivaaacattaatcaagtgaacagggaaataggatggatggaaggaggtcagttggttctZo064序列34RivagggtctggaagaagcctttatgtgtagggtatgagagagtggttgtgaagagagaaZo065序列35Rivagtttgcgtcacaggatcgcagagtccttccaccgagattacactcaagtatccagg
權(quán)利要求
1.一種基因芯片，包括病毒檢測(cè)探針，其特征在于所述病毒檢測(cè)探針由以下的探針 組成核苷酸序列分別是表2中序列1-150的150個(gè)病毒檢測(cè)探針和核苷酸序列分別是序列 1-150的反向互補(bǔ)序列的150個(gè)病毒檢測(cè)探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述基因芯片上還固定有1條核苷 酸序列如表2中序列151所示的陽性對(duì)照探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于所述基因芯片由以下探針組成 核苷酸序列分別是表2中序列1-150的150個(gè)病毒檢測(cè)探針、核苷酸序列分別是序列1-150 的反向互補(bǔ)序列的150個(gè)病毒檢測(cè)探針和1條核苷酸序列如表2中序列151所示的陽性對(duì) 照探針。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述的基因芯片與待測(cè)生物樣品進(jìn)行雜交的方法，包括以下 步驟將待測(cè)生物樣品與權(quán)利要求1-3任一所述的基因芯片雜交，雜交條件是雜交液中的 去離子甲酰胺濃度為25-60% (體積百分比)，雜交的溫度是42-61 °C，雜交的時(shí)間0. 5-6小 時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述雜交條件是如下1)或幻或3)或4)1)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為40-60%(體積百分比)，所述雜交的溫度為 51-61°C，所述雜交的時(shí)間為1-4小時(shí)；2)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為40-50%(體積百分比)，所述雜交的溫度為 51-54°C，所述雜交的時(shí)間為1-2小時(shí)；3)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為50-60%(體積百分比)，所述雜交的溫度為 58-61°C，所述雜交的時(shí)間為2-4小時(shí)；4)雜交液中的去離子甲酰胺濃度為50%(體積百分比)，所述雜交的溫度為51°C，所 述雜交的時(shí)間為2小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述基因芯片在雜交前用濃度為 0. 25g/100ml 的 NaBH4 進(jìn)行封閉。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于所述待測(cè)生物樣品是基孔肯亞病 毒、日本乙腦病毒、狂犬病毒或辛德畢斯病毒的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述擴(kuò)增產(chǎn)物是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)人畜共患病病毒的基因芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的基因芯片包括病毒檢測(cè)探針，其特征在于所述病毒檢測(cè)探針由以下的探針組成核苷酸序列分別是表2中序列1-150的病毒檢測(cè)探針和核苷酸序列分別是序列1-150的反向互補(bǔ)序列的病毒檢測(cè)探針。本發(fā)明的基因芯片與病毒的核酸進(jìn)行雜交的最佳雜交條件為采用0.25g/100ml NaBH4溶液封閉芯片，芯片在51℃，2h，在含50％(體積百分比)甲酰胺雜交液中雜交。在上述條件下，本發(fā)明的芯片具有較好的敏感性及檢測(cè)特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102031312SQ200910093498
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者劉洪 , 孫慶歌, 康曉平, 戶義, 李永強(qiáng), 李靖, 楊銀輝, 祝慶余 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所