專利名稱：高溫木聚糖酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
木聚糖是一種半纖維素，從含量上說(shuō)是第二大的天然多糖。木聚糖類半纖維素是一類可 再生而又亟待開(kāi)發(fā)利用的碳水化合物，經(jīng)生物降解后所產(chǎn)生的木糖和少量其它單糖，可以用 作基本碳源生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品，包括有機(jī)酸、氨基酸、單細(xì)胞蛋白、糖醇、工業(yè)酶類、溶劑 或燃料醇。木聚糖酶系主要包括兩種酶， 一種是卩-l,4-木聚糖酶，另一種是(3-木聚糖酶，二 者共同作用可將木聚糖降解成單糖。木聚糖酶在生物轉(zhuǎn)化、食品、醫(yī)藥、能源、造紙、飼料 工業(yè)中具有重要作用。能產(chǎn)生木聚糖酶的微生物有很多種真菌、細(xì)菌、放線菌均可產(chǎn)生木 聚糖酶等。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，產(chǎn)生木聚糖酶的放線菌主要有Sfr印(om;;ces /Mcfara、 7T2^"附oZ)i/^/a^sca等；細(xì)菌主要有5acz7/ws sw6"7h、 i^eMifoffKJwas^/7wwascew"等。產(chǎn)木聚糖酶 真菌主要有j4spe^7'〃"51 m.ge尸、Aspergi//t 、 y4j/ erg,7/ws/ /zoera/c^y 、 7>ic/zoctema ree鄉(xiāng)'、
不同種(屬)的所微生物產(chǎn)生的木聚糖酶理化性質(zhì)各不相同，分子量在9500_243000道 爾頓、等電點(diǎn)在3.6-10.3都有分布。酶活最適溫度一般在50'C左右，最適pH值跟其微生物 來(lái)源的不同而不同，多數(shù)為pH 4.0-6.0，產(chǎn)堿性木聚糖酶的微生物較少。
不同種(屬)的微生物產(chǎn)木聚糖酶的能力差異也很大。以分批液體發(fā)酵中每毫升培養(yǎng)液 所產(chǎn)生的木聚糖酶活做比較。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中，Samain E等人報(bào)道的Bacillus sp.XE產(chǎn)木聚 糖酶最高活力為380IU/ml (1997， Journal of Biotechnology 58， 71-78); Dhillon A等人報(bào)道 的Bacillus circulans AB 16最高產(chǎn)酶活力為55IU/ml ( 2000， Process Biochemistry, 35, 849-856); kohli U等人報(bào)道的Thermoactinomyces thalphilus subgroup C.的最高酶活為 42IU/ml (2001, Enzyme and Microbial Technology 28, 606-610 )。國(guó)內(nèi)報(bào)道中，曲音波等人報(bào) 道的由BacilluspumilusA30產(chǎn)生木聚糖酶活力最高，為431IU/ml(2000，中國(guó)生物化學(xué)與分子 生物學(xué)報(bào))。
不同微生物產(chǎn)木聚糖酶的溫度耐受性差異很大。因?yàn)槟蜔峄蚰透邷啬揪厶敲冈诠I(yè)應(yīng)用 中有很多優(yōu)點(diǎn)，所以近年來(lái)關(guān)于這方面的專利文獻(xiàn)報(bào)道較多。如CN1143387公開(kāi)了一種熱穩(wěn) 定性木聚糖酶，介紹的木聚糖酶在80。C以上有活性。CN00814240.8公開(kāi)了改進(jìn)Gll家族木 聚糖酶的熱穩(wěn)定性的方法，并且擴(kuò)展了其pH穩(wěn)定性范圍。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朚O710065854.8 公開(kāi)了一種"基因重組畢赤酵母生產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的方法"，是從黑曲霉"^erg///^ m-gmww'gw strain N402)中分離出木聚糖酶基因，在真核表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母中高效表達(dá)。使 用了黑曲霉爿^^g/〃M Wgenw7J/ger strain N402木聚糖酶基因，采用了畢赤酵母表達(dá)載體PGAPZ alphaA和宿主菌株巴斯德畢赤氏酵母CPZcWa; asto^)SMD1168、 GS115,所構(gòu)建的基 因工程酵母具有生產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的能力，所構(gòu)建的基因工程酵母除具有宿主菌株 SMD1168和GS115的形態(tài)、遺傳和生理生化特征外，還包含黑曲霉A/^g///^ m'gmw"/gw strain N402木聚糖酶基因，具有生產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的能力。
工業(yè)上，木聚糖酶已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于紙漿的漂白。在漂白過(guò)程中，需要具有耐高溫、耐 堿以及分子量低的木聚糖酶。雖然，可以產(chǎn)生木聚糖酶的微生物很多，但由于絕大多數(shù)微生 物的木聚糖酶為中低溫或偏酸性，在工業(yè)應(yīng)用上受到了很大限制。因而，對(duì)具有這些性質(zhì)的 木聚糖酶的開(kāi)發(fā)與研究就顯得十分必要了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種由微生物菌種發(fā)酵液產(chǎn)生、分離、純化制備高溫木聚糖酶的 方法。
本發(fā)明所述的高溫木聚糖酶的制備方法由以下步驟組成
一、粗酶液的制備將7T^mo6i/Wfl/za/oto/era似YIM90462T以5-10%的體積百分比的接 種量接入液體種子培養(yǎng)基中，在37 45。C的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生長(zhǎng) 期的菌液以5-10%的體積百分比的接種量轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 45"C培養(yǎng)至穩(wěn)定 期初期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過(guò)濾，得粗酶液；
三、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來(lái)的1/6;
三、 濃縮后的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50%飽和度， 離心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液中；
四、 將步驟(三)所得液離心取上清液，力n到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的Butyl-Sepharose層析柱，將透過(guò)峰按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過(guò)8-10 個(gè)層析柱體積，保留有木聚糖酶活性的透過(guò)峰酶液部分；
五、 將步驟(四)所得液離心取上清液，力B到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的Phenyl-Sepharose層析柱，用無(wú)硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集所有洗脫 峰組分；
六、 將步驟(五)所得液離心取上清液，加到pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的Q-Sepharose 層析柱，用含NaClpH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，首先使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到30mS/cm，將洗脫 峰按保留時(shí)間的先后收集，直至緩沖液流過(guò)5-10個(gè)層析柱體積，保留有木聚糖酶活性的部分， 即為本發(fā)明產(chǎn)品。
本發(fā)明步驟一所述的r/^mo6l/Wfl/2fl/oto/eraraYIM90462T是耐鹽高溫雙歧菌(刊登于 77^nwo6zyWa /za/o/o/enmy sp. nov" isolated from a salt mine sample, and emended description of the genus/zmwo6訴^ Yang etal.i^/砂W￡vo/M/craWo/.2008; 58: 1821-1825)。所述的液體種 子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基均可以采用現(xiàn)有培養(yǎng)基，但在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中應(yīng)含有質(zhì)量體積
4百分比為0.1—2% (w/v)的AVICEL，只有這樣才能保證本發(fā)明所述酶的產(chǎn)生。所述的指數(shù) 生長(zhǎng)期為2-3天，所述的穩(wěn)定期初期為5-7天，當(dāng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期時(shí)即為產(chǎn)酶高峰期。每 毫升發(fā)酵液活性可達(dá)7U。
上述步驟四、六中所涉及的木聚糖酶活性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)M丄Bailey， P. Biely, K. Poutanen, Journal of Biotechnology 23 (1992) 257-270。具體方法為準(zhǔn)確稱取0.50g的樺木木聚糖 溶解于50ml不同pH6.0檸檬酸-磷酸二氫鈉緩緩沖液中。取上述底物溶液80nl裝于Eppendorf 管中，加入2(^1合適的稀釋酶液，以滅活的酶液為對(duì)照。70'C反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，迅速 加入DNS測(cè)定還原糖濃度。DNS法測(cè)定還原糖濃度參考文獻(xiàn)Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. ANALYTICAL CHEMISTRY. 1959。
本發(fā)明所述的由耐鹽高溫雙歧菌制備得到的高溫木聚糖酶的優(yōu)點(diǎn)是在70-8(TC下具有較 高的酶活力，在造紙、生物轉(zhuǎn)化行業(yè)有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值；全部分離純化過(guò)程中均用一種 緩沖液(pH8.0 50mMTris-HCl)，且分離純化過(guò)程簡(jiǎn)單易行。
本發(fā)明所述的高溫木聚糖酶，具有以下酶學(xué)性質(zhì)
1、 耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶最適酶活溫度為80。C，純化收率在9%以上，每升發(fā) 酵液經(jīng)純化可獲得1159U純酶。
2、 耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)生的高溫木聚糖酶在4 7(TC之間活力較為穩(wěn)定，達(dá)573.3U/ml， 在7(TC保溫2小時(shí)，還可保持80%以上的酶活力，達(dá)458.6 U/ml;當(dāng)溫度超過(guò)75'C時(shí)，酶活 力下降很快，在75"保溫120min會(huì)導(dǎo)致酶活力下降近80。/Q，達(dá)114.6 U/ml;值得注意的是， 木聚糖酶在90。C保溫40min，酶活仍可以保存原來(lái)的30%,達(dá)171.99 U/ml，表明耐鹽高溫雙 歧菌產(chǎn)木聚糖酶屬于典型的高溫木聚糖酶。
3、 耐鹽高溫雙歧菌高溫木聚糖酶最適反應(yīng)pH為6.0，在pH小于4或大于10時(shí)，酶活 力較低。
4、 耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶在pH6.0 10.0之間酶活力穩(wěn)定，在pH6.0 10.0的 緩沖液中保溫過(guò)夜，其殘余酶活力均在80%以上，達(dá)458.6 U/ml。
5、 Mn2+、 K+、 Ba2+、 Fe^對(duì)耐鹽高溫雙歧菌高溫木聚糖酶有激活作用，Li+、 Cd2+、 Mg2+、 Zn2+、 Mn2+、 Ca2+、 Na+、 Pb2+、 Co2+、 A產(chǎn)和Fe3+對(duì)酶作用不明顯，Ni2+、 Cu2+、 Hg2+對(duì)酶有 顯著的抑制作用。
6、 變性劑SDS對(duì)耐鹽高溫雙歧菌高溫木聚糖酶有明顯的抑制作用，鰲合劑EDTA和絲 氨酸蛋白酶專一抑制劑苯甲基磺酰氟化物(PMSF)對(duì)耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶沒(méi)有抑 制作用，表明了耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶對(duì)金屬離子沒(méi)有依賴性且其活性中心不含有 絲氨酸。


圖1為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶的反應(yīng)溫度和相對(duì)活性的關(guān)系曲線。圖2為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶的反應(yīng)pH和相對(duì)活性的關(guān)系曲線。 圖3為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶的熱穩(wěn)定性曲線。 圖4為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)高溫木聚糖酶的pH穩(wěn)定性曲線。 上述圖2中
表示pH3.0、 3.6、 4.8 醋酸-醋酸鈉緩沖液。 ■ 表示pH4、 5、 6、 7、 7.6 檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液。 ▲ 表示pH7.5、 8.5 Tris-HCl緩沖液。 參表示pH9、 10 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、
一、 粗酶液的制備將r/^wo6訴&to/oto/era附Y(jié)IM90462T以接種量10%(體積百分比) 接入液體種子培養(yǎng)基中，在5(TC的條件下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生長(zhǎng) 期的菌液以接種量10% (體積百分比)轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 45。C培養(yǎng)至5-7天 至穩(wěn)定期初期即為產(chǎn)酶高峰期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過(guò)濾，得粗酶液；
二、 用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來(lái)的1/6;
三、 濃縮后的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50%飽和度， 離心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液中；
四、 將步驟(三)所得液離心取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平衡 好的Butyl-Sepharose層析柱，將透過(guò)峰按保留時(shí)間的先后每四毫升收集一管，直至緩沖液流 過(guò)10個(gè)層析柱體積，按照參考文獻(xiàn)Journal of Biotechnology 23 (1992) 257-270中的方法對(duì)所 收集的各管中的酶液進(jìn)行木聚糖酶測(cè)定，保留木聚糖酶酶液部分；
五、 將步驟(四)所得液離心取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平衡 好的Phenyl-Sepharose層析柱，用無(wú)硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集所有洗脫峰 組分；
六、 將步驟(五)所得液離心取上清液加到pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的Q-Sepharose 層析柱，用含NaClpH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，首先使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到30mS/cm，將洗脫
峰按保留時(shí)間的先后每四毫升收集一管，直至緩沖液流過(guò)10個(gè)層析柱體積，保留有木聚糖酶 活性的部分，即為本發(fā)明產(chǎn)品。
通過(guò)對(duì)本產(chǎn)品的底物特異性研究，不同的底物分別為樺木木聚糖，羧甲基纖維素，PNPG (4-Nitrophenyl p-D-glucopyranoside)和AVICEL (微晶纖維素)，發(fā)現(xiàn)其木聚糖酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于其纖維素酶活性，可以確定本產(chǎn)品是典型的木聚糖酶。
底物特異性試驗(yàn)中，纖維素酶活性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)Methods for Measuring CellulaseActivities. T. M. WOOD et al. METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 160。木聚糖酶活性參考文 獻(xiàn)Journal of Biotechnology 23 (1992) 257-270。
在步驟一中的所述的種子培養(yǎng)基的組成
IOX大量鹽溶液 100ml 50X微量量鹽溶液 20ml Peptone 5g 加水定容至1L。
上面提到的IOX大量鹽溶液配方為
NaCl 15g (NH4)2S04 31g Na2HP04 91 g 加水定容至1L。
上面提到的纟OX微量量鹽溶液配方為
EDTA 0.5g MgS04 2.00g ZnS04 0.08g FeS04 0.2g MnS04 0.15g
CaCl2 0.2g 加水定容至200ml。
在步驟一中的所說(shuō)的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 Peptone 10g Yeast 5g NaCl 10g
AVICEL (微晶纖維素sigma公司)l一20g 加水定容至1L。
權(quán)利要求
1、一種高溫木聚糖酶的制備方法，其特征在于由以下步驟組成一、粗酶液的制備將Thermobifida halotolerans YIM 90462T以5-10％的體積百分比的接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，在37～45℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液以5-10％的體積百分比的接種量轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37～45℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過(guò)濾，得粗酶液；二、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來(lái)的1/6；三、濃縮后的酶液加硫酸銨至30％飽和度，離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，離心取沉淀，溶解在pH8.0、0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液中；四、將步驟(三)所得液離心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平衡好的Butyl-Sepharose層析柱，將透過(guò)峰按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過(guò)8-10個(gè)層析柱體積，保留有木聚糖酶活性的透過(guò)峰酶液部分；五、將步驟(四)所得液離心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平衡好的Phenyl-Sepharose層析柱，用無(wú)硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集所有洗脫峰組分；六、將步驟(五)所得液離心取上清液，加到pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的Q-Sepharose層析柱，用含NaClpH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，首先使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到30mS/cm，將洗脫峰按保留時(shí)間的先后收集，直至緩沖液流過(guò)5-10個(gè)層析柱體積，保留有木聚糖酶活性的部分，即為本發(fā)明產(chǎn)品。
2、 如權(quán)利要求1所述的高溫木聚糖酶的制備方法，其特征在于在步驟(一)所述的液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中含有質(zhì)量體積百分比為0.1—2%的AVICEL。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本高溫木聚糖酶的制備方法由以下步驟組成一、粗酶液的制備將Thermobifida halotolerans YIM 90462^T以體積百分比5-10％的接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，以體積百分比5-10％的轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，得粗酶液；二、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來(lái)的1/6；三、濃縮后的酶液加硫酸銨至50％飽和度，離心取沉淀，溶解在緩沖液中；四、將所得液離心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平衡好的Butyl-Sepharose層析柱；五、將所得液離心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平衡好的Phenyl-Sepharose層析柱，用無(wú)硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫；六、加到pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的Q-Sepharose層析柱，將洗脫峰按保留時(shí)間的先后收集，保留有木聚糖酶活性的部分。最終獲得酶活活力為573U/ml，純化收率為9％。
文檔編號(hào)C12N9/24GK101525607SQ200910094340
公開(kāi)日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者唐蜀昆, 姜成林, 徐麗華, 李文均, 胡松楠, 趙立興, 魏云林 申請(qǐng)人:云南大學(xué)