專利名稱：纖維素酶組合物以及單一成分的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是纖維素酶組合物以及其中單一成分的制備方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶為復(fù)合酶，廣泛應(yīng)用于釀酒、食品、詞料、紡織、造紙、制藥、環(huán)保、石油開 采等工業(yè)。纖維素酶來源非常廣泛，昆蟲、微生物(細(xì)菌、放線菌和真菌等)和一些動(dòng)物都 能產(chǎn)生纖維素酶。真菌和細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶是人們研究的主要對(duì)象。在纖維素酶研究領(lǐng)域， 其中幾個(gè)著名的菌禾中是7Wc/wJewz" we^z'禾卩CW/w/o/wowas浙77zermo6訴cfo/twc"，其中前 者為真菌，后兩個(gè)為放線菌。早期的纖維素酶研究以真菌為主，直到20世紀(jì)80年代，放線 菌產(chǎn)生的纖維素酶才開始進(jìn)入人們的視線。纖維素酶在工業(yè)領(lǐng)域中的主要應(yīng)用方面主要包括: 將纖維素降解成糖類生產(chǎn)生物乙醇，織物處理如"石洗(stone washing)"和"生物拋光 (biopolishing)"，以及用于洗滌劑組合物中。本領(lǐng)域中雖然己經(jīng)有一些纖維素酶組合物應(yīng) 用與實(shí)際生產(chǎn)中，但目前仍需要具有各種特性范圍的新纖維素酶，它們或者用于洗滌劑組合 物的成分，或者處理紙漿和纖維素乙醇等方面。申請(qǐng)人從鹽環(huán)境中分離到的一株耐鹽放線菌， 從其發(fā)酵液中已發(fā)現(xiàn)的纖維素酶具耐熱和耐堿性，在以上提到的領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。
中國專利申請(qǐng)?zhí)?00610002014. 2公開了一種"微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法"， 是將產(chǎn)生纖維素酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；將低溫馴化后的纖 維素酶產(chǎn)生菌在10 16'C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在10 16。C培養(yǎng)72 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶結(jié)束；發(fā)酵液在4，000 8，000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，可以將粗 酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。中國專利申請(qǐng) 號(hào)200510070368.6公開了一種"利用酵母菌生產(chǎn)纖維素酶的方法"，是在培養(yǎng)基中加入酵 母菌種進(jìn)行培養(yǎng)，然后經(jīng)離心分離得到的上清液即為酶液，將酶液經(jīng)沉淀分離可得粗酶，粗 酶分離純化，即得產(chǎn)品纖維素酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種由微生物菌種發(fā)酵液產(chǎn)生、分離、純化制備纖維素酶組合物 的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述纖維素酶組合物中一種單一成分的制備方法。本發(fā)明所述的纖維素酶組合物的制備方法由以下步驟組成-
一、 粗酶液的制備將7T mw^訴cfo /w/oto/erara YIM 90462T以體積百分比為5 — 10%的 接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，在37 45'C的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生 長(zhǎng)期的菌液以體積百分比5_10%的接種量轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 45'C培養(yǎng)至穩(wěn) 定期初期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；
二、 用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6;
三、 濃縮后的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50°/。飽和度， 離心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCI緩沖液中，得到的酶液即纖維素酶組合 物。其酶活可達(dá)165.25U/ml.
本發(fā)明步驟一所述的T7 enwo6(/^a /^/o,o/erara YIM 90462T是耐鹽高溫雙歧菌(刊登于 rAer附o6訴cfar / fl/Wo/erara sp. nov.， isolated from a salt mine sample, and emended description of the genus ter附o6zy c/a Yang etal./"/J5^/5w/MZcraZ7/o/.2008; 58: 1821-1825)。所述的液體種 子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均可以采用現(xiàn)有培養(yǎng)基，但在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中應(yīng)含有質(zhì)量體積百分 比為0.1—2% (w/v)的AVICEL、質(zhì)量體積百分比為1一5% (w/v)的NaCl，這樣既可以保 證酶的產(chǎn)生，又能有效地減少發(fā)酵過程中的雜菌污染。
所述的指數(shù)生長(zhǎng)期為2-3天，所述的穩(wěn)定期初期為5-7天，當(dāng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期時(shí)即為 產(chǎn)酶高峰期。該時(shí)期的酶活性為15.1U/ml。
上述步驟一至三所制得的是纖維素酶組合物，其中主要為纖維素酶組分，其中也含有纖 維素酶以外的組分，但并不影響本組分作為纖維素酶組合物的應(yīng)用。
對(duì)本纖維素酶組合物再進(jìn)行進(jìn)一步的分離、提純，可以制得其中的一種單一成分—— S'DS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。具體步驟為上述步驟一至三，再加入以下步驟
四、 將步驟三得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的Butyl-Sepharose預(yù)裝柱，將透過峰按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過8-10 個(gè)層析柱體積，保留有羧甲基纖維素酶活性的透過峰酶液部分 '
五、 將步驟四得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的pentyl-Sepharose預(yù)裝柱，用無硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集所有洗脫峰 組分；
六、 將步驟五得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的 Q-Sepharose預(yù)裝柱，用含NaCl pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，首先使洗脫液電導(dǎo)達(dá)封 30mS/cm，將洗脫峰按保留時(shí)直至緩沖液流過5-10個(gè)層析柱體積，然后使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到
435mS/cm，將洗脫峰按按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過5-10個(gè)層析柱體積，保 留有羧甲基纖維素酶活性的部分，即為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
本發(fā)明所制得的纖維素酶組合物的分子量經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，其在40000道爾頓 120000道爾頓之間，最適反應(yīng)溫度55 70°C，最適反應(yīng)為pH5.0 pH6.5。本發(fā)明提供的由 耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)生的電泳純中溫纖維素酶酶活反應(yīng)最適溫度55'C，最適反應(yīng)pH值6.0，而 且在堿性條件下能保持較高的活力。本發(fā)明由耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)生的纖維素酶組合物和電泳 純纖維素酶，可在造紙及飼料工業(yè)中將得到廣泛應(yīng)用，例如去污劑、紡織物處理或作為一種 動(dòng)物飼料添加劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所得到纖維素酶在高溫下仍具有較高的酶活力，在造紙，生物轉(zhuǎn)化行 業(yè)有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。全部分離純化過程中均用pH8.0的Tris-HCl緩沖液，且全部分離 純化過程簡(jiǎn)單易行。
本發(fā)明制備的電泳純中溫纖維素酶，具有以下酶學(xué)性質(zhì):
1、 耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)纖維素酶最適酶活溫度55'C。酶活力達(dá)68.5U/ml。
2、 耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)纖維素酶在4 6(TC之間活力較為穩(wěn)定，55'C保溫5小時(shí)，還保持 30% (20.5U/ml)以上的酶活力。溫度超過60'C，酶活力下降很快。在75'C保溫60min會(huì)導(dǎo) 致酶活力下降近90%。
3、 耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)纖維素酶最適pH為6.0，酶活力達(dá)68.5U/ml。 pH小于4或大于10
酶活力較低。
4、 耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶pH6.0 9.0之間酶活力穩(wěn)定，在pH6.0 9.0的緩沖液中保 溫過夜，其殘余酶活力均在80% (54.8U/ml)以上。
5、 Mn2+、 Mg2+、 Al3+、 Pb2+、 C^+和CcP對(duì)耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶有激活作用，Li+、、 Mn2+、 Na+、 Ca2+、 Fe2+、 Ba"和Fe"對(duì)酶活力沒有明顯的作用作用，Hg2+、 Cu2+、 Zn2+、 Ni2+ 對(duì)酶有顯著的抑制作用。
6、 變性劑SDS對(duì)耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)纖維素酶有明顯的抑制作用。鰲合劑EDTA和絲氨 酸蛋白酶專一抑制劑苯甲基磺酰氟化物(PMSF)對(duì)耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶沒有抑制作用， 表明了耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶對(duì)金屬離子沒有依賴性且活性中心不含有絲氨酸。


圖1為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)電泳純中溫纖維素酶的反應(yīng)溫度和相對(duì)活性的關(guān)系曲線。 圖2為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)電泳純中溫纖維素酶的反應(yīng)pH和相對(duì)活性的關(guān)系曲線。圖3為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)纖維素酶組合物的反應(yīng)溫度和相對(duì)活性的關(guān)系曲線c 圖4為耐鹽高溫雙歧菌產(chǎn)纖維素酶組合物的反應(yīng)pH和相對(duì)活性的關(guān)系曲線。 上述圖2中
醋酸-醋酸鈉緩沖液。
檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液。 Tris-HCl緩沖液。 甘氨酸--氫氧化鈉緩沖液。
醋酸-醋酸鈉緩沖液。 檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液。 Tris-HCl緩沖液。 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
表示pH3.0、 3.6、 4.8
■ 表示pH4、 5、 6、 7、 7.6
▲ 表示pH7.5、 8.5 攀表示pH9、 10
上述圖4中
表示pH3.0、 3.6、 4.8
■ 表示pH4、 5、 6、 7、 7.6
▲ 表示pH7.5、 8.5 參表示pH9、 10
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、
一、 粗酶液的制備將7Tzmwo&y 必/ a/Wo/era似YIM 90462T以10% (體積百分比)接種 量接入液體種子培養(yǎng)基中，在5(TC的條件下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生 長(zhǎng)期的菌液以10% (體積百分比)接種量轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 45'C培養(yǎng)至5-7 天至穩(wěn)定期初期即為產(chǎn)酶高峰期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；
二、 用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6;
三、 濃縮后的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50%飽和度， 離心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液中。
上述得到的液體，經(jīng)纖維素酶活力測(cè)定和SDS-PAGE電泳分析，確定為纖維素酶組合物。
四、 將步驟三得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的Butyl-Sepharose預(yù)裝柱，將透過峰按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過8-10 個(gè)層析柱體積，保留有羧甲基纖維素酶活性的透過峰酶液部分；
五、 將步驟四得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的pentyl-Sepharose預(yù)裝柱，用無硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集所有洗脫峰 組分；
六、 將歩驟五得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的 Q-Sepharose預(yù)裝柱，用含NaCl pH 8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，首先使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到 30mS/cm，將洗脫峰按保留時(shí)直至緩沖液流過5-10個(gè)層析柱體積，然后使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到35mS/cm，將洗脫峰按按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過5-10個(gè)層析柱體積，保 留有羧甲基纖維素酶活性的部分，即為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
上述步驟四、六中所涉及的羧甲基纖維素酶活性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)Methods for Measuring Cellulase Activities. T. M. WOOD et al. METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 160。
經(jīng)底物特異性試驗(yàn)分析和SDS-PAGE電泳分析，確定為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
在步驟一中的所述的種子培養(yǎng)基的組成
IOX大量鹽溶液 100ml
50X微量量鹽溶液 20ml
Peptone 5g
加水定容至1L。
上面提到的IOX大量鹽溶液配方為
NaCl 15g (NH4)2S04 31g Na2HP04 91 g 加水定容至1L。
上面提到的50X微量量鹽溶液配方為
EDTA 0.5g
MgS04 2.00g
ZnS04 0.08g
FeS04 0.2g
MnS04 0.15g
CaCl2 0.2g
加水定容至200ml。
在步驟一中的所說的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 Peptone 10g Yeast 5g NaCl 10-50g
AVICEL (微晶纖維素sigma公司)l一20g 加水定容至1L。
權(quán)利要求
1、一種纖維素酶組合物的制備方法，其特征在于由以下步驟組成一、粗酶液的制備將Thermobifida halotolerans YIM 90462T以體積百分比為5-10％的接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，在37～45℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液以體積百分比5-10％的接種量轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37～45℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；二、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6；三、濃縮后的酶液加硫酸銨至30％飽和度，離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，離心取沉淀，溶解在pH8.0、0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液中，得到的酶液為纖維素酶組合物。
2、 一種纖維素酶組合物單一成分的制備方法，其特征在于由以下步驟組成一、粗酶液的制備將7T^mo&拆^ /w/o/o/erara YIM 90462T以體積百分比5 — 10%的接 種量接入液體種子培養(yǎng)基中，在37 45'C的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生長(zhǎng) 期的菌液以體積百分比5 — 10%的接種量轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 45t:培養(yǎng)至穩(wěn)定 期初期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；三、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的l/6;三、 濃縮后的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50%飽和度， 離心取沉淀，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液中；四、 將步驟三得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的Butyl-Sepharose預(yù)裝柱，將透過峰按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過8-10 個(gè)層析柱體積，保留有羧甲基纖維素酶活性的透過峰酶液部分；五、 將步驟四得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液平 衡好的pentyl-Sepharose預(yù)裝柱，用無硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集所有洗脫峰 組分；六、 將步驟五得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的 Q-Sepharose預(yù)裝柱，用含NaCl pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，首先使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到 30mS/cm，將洗脫峰按保留時(shí)直至緩沖液流過5-10個(gè)層析柱體積，然后使洗脫液電導(dǎo)達(dá)到 35mS/cm，將洗脫峰按按保留時(shí)間的先后分別收集，直至緩沖液流過5-10個(gè)層析柱體積，保 留有羧甲基纖維素酶活性的部分，即為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于在步驟(一)所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中含有質(zhì)量體積百分比為0.1—2%的AVICEL，質(zhì)量體積百分比為l一5。/。的NaCl。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是纖維素酶組合物以及其中單一成分的制備方法。本纖維素酶組合物的制備方法為一、粗酶液的制備將Thermobifida halotolerans YIM 90462^T以體積百分比5-10％的接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，以體積百分比5-10％的轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，將發(fā)酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；二、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6；三、濃縮后的酶液加硫酸銨至30％飽和度，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，離心取沉淀，溶解在pH8.0、含有0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩沖液中，得到的酶液為纖維素酶組合物。對(duì)本纖維素酶組合物再進(jìn)行進(jìn)一步的分離、提純，可以制得其中的一種單一成分——SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。該電泳純纖維素酶的活力為68.5U/ml.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所得到纖維素酶在高溫下仍具有較高的酶活力，在造紙、生物轉(zhuǎn)化行業(yè)有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101525608SQ20091009434
公開日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者唐蜀昆, 姜成林, 徐麗華, 李文均, 胡松楠, 趙立興, 魏云林 申請(qǐng)人:云南大學(xué)