專(zhuān)利名稱(chēng)：一種飼用β-甘露聚糖酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種由黑曲霉 "W^^7/M"&W)新菌株發(fā)酵生產(chǎn)的飼用甘露聚糖酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)豬、雞的主要日糧是玉米/豆粕型日糧，盡管單胃動(dòng)物對(duì)玉米的消化率
較高，但對(duì)豆粕的能量利用率僅為50% 60%，主要原因是豆粕中含有1.3%的 3-甘露聚糖，它對(duì)動(dòng)物，包括對(duì)人有強(qiáng)大的抗?fàn)I養(yǎng)作用，影響能量代謝與蛋白 質(zhì)合成。P -甘露聚糖酶能將廣泛存在于豆類(lèi)籽實(shí)中的甘露聚糖等多糖降解為甘 露寡糖等低聚糖，不僅消除了甘露聚糖對(duì)單胃動(dòng)物各種營(yíng)養(yǎng)素的抗?fàn)I養(yǎng)作用， 同時(shí)生成的甘露低聚糖在動(dòng)物腸道中起著重要的調(diào)節(jié)作用。大量研究表明，甘 露寡糖可通過(guò)減少動(dòng)物腸道病原菌，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，提高腸粘膜的完整性而最 終提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，由此已被認(rèn)為是最有希望的抗生素替代品之一。0-甘 露聚糖酶不僅具有一般非淀粉多糖(NSP)酶類(lèi)的作用，還是一種多功能促生長(zhǎng) 劑，可促進(jìn)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子IGF-I的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，提高痩肉率。 因此可以認(rèn)為，e-甘露聚糖酶是一種超脫了傳統(tǒng)酶制劑的作用，具有提高能量、 促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的新型飼用酶制劑，已引起越來(lái)越廣泛的關(guān)注。
對(duì)P-甘露聚糖酶的研究最初是集中在以地衣芽孢、枯草芽孢桿菌、嗜堿芽 孢桿齒等菌株產(chǎn)生的中性或堿性e-甘露聚糖酶上，并主要應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、 造紙、采油等領(lǐng)域內(nèi)，后才逐歩有了關(guān)于將P-甘露聚糖酶應(yīng)用于詞料業(yè)的報(bào)道。 國(guó)內(nèi)雖對(duì)酸性0-甘露聚糖酶的營(yíng)養(yǎng)功能及在動(dòng)物飼料中應(yīng)用效果研究的報(bào)道較多，而對(duì)有關(guān)酸性e-甘露聚糖酶生產(chǎn)的報(bào)道則較少。其中，在有關(guān)應(yīng)用不同菌 株所產(chǎn)酸性e-甘露聚糖酶的性質(zhì)方面也有較大差別例如，朱劼等分離的黑曲
霉WM20-11所產(chǎn)的酸性e-甘露聚糖酶其最適pH為3.5， 37 "C保溫2h在pH 2.5 6.0范圍內(nèi)剩余酶活力均在80%以上，其最適作用溫度為7(TC，且酶在50 。C 、 60 。C保溫30min時(shí)，仍能保持90 %左右的活力；皮雄娥等分離的黑曲霉 AS6034所產(chǎn)的酸性P-甘露聚糖酶在pH3.2左右時(shí)酶活力達(dá)到最大，該酶液在 pH3. 8左右較為穩(wěn)定，保溫2h后殘留酶活力超過(guò)80% ，但pH4.0 5. 0時(shí) 酶活力迅速下降，尤其是pH為8.0時(shí)酶活力僅為10%左右；李劍芳等分離的 黑曲霉LW-1最適pH和最適反應(yīng)溫度分別為3.5和70°C，在pH5.0 8.0時(shí)酶活 穩(wěn)定，殘余酶活在85%以上，在溫度低于6(TC時(shí)酶活較穩(wěn)定；張輝分離的青霉 QM-1所產(chǎn)的P -甘露聚糖酶最適反應(yīng)pH為5.8，但pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性未知； 韋躍華等將從里氏木霉基因組中獲得的內(nèi)切-甘露聚糖酶全長(zhǎng)基因去除內(nèi)含子 后，插入到巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，獲得重組質(zhì)粒pM242;電擊法 轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，獲得的重組酶最適pH和最適反應(yīng)溫度分別為5.0和 80°C，在pH5.0 6.0時(shí)酶活穩(wěn)定，在pH5.4時(shí)70。C保溫30min酶活維持50。/o以 上。
綜上所述，從利用不同菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)酸性e -甘露聚糖酶的已有研究報(bào) 導(dǎo)來(lái)看，以黑曲霉為菌種所生產(chǎn)的酸性P-甘露聚糖酶其最適pH為3.5左右，這 與動(dòng)物的胃液酸度相仿是較適宜作為詞料添加劑的；但是飼料在其制備的過(guò)程 中一般都要經(jīng)過(guò)高溫的造粒過(guò)程；同時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)從腸到胃其pH值的變化是 較大的，因而對(duì)作為飼料添加劑的酶來(lái)講，對(duì)其耐熱的穩(wěn)定性與對(duì)pH的穩(wěn)定性 均有較高的要求；然而已報(bào)道的黑曲霉菌株所產(chǎn)酸性3-甘露聚糖酶對(duì)熱與pH 的穩(wěn)定性是不高的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對(duì)上述現(xiàn)有黑曲霉菌株所產(chǎn)P-甘露聚糖酶，所存在對(duì)熱 穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性不高的缺陷，篩選一種能以豐富、廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵原料， 所產(chǎn)3-甘露聚糖酶對(duì)熱和PH穩(wěn)定性較強(qiáng)的黑曲霉新菌株；本發(fā)明的另一目的 是提出利用該新菌株發(fā)酵生產(chǎn)P -甘露聚糖酶的方法。
本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)。
一種高產(chǎn)酸性e-甘露聚糖酶的黑曲霉"邵er^77hs /7j>er)菌株MA-56
的誘變、選育、鑒定及其特性
(1) 出發(fā)菌株MA的選育
發(fā)明人從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所實(shí)驗(yàn)室保藏的曲霉菌 種中，在選擇性培養(yǎng)基上經(jīng)初篩、復(fù)篩，獲得一株產(chǎn)酸性e-甘露聚糖酶活性最
高的菌株MA，并以該菌株作為進(jìn)一步誘變選育的出發(fā)菌株；
(2) 誘變菌株MA-56的選育
將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面上生長(zhǎng)成熟的出發(fā)菌株MA的新鮮孢子， 用無(wú)菌水洗下，制成孢子濃度為lxl()7 108個(gè)/ml的孢子懸浮液；分別取2 ml 孢子懸浮液于試管內(nèi)，置鈷源室按O (對(duì)照)、0.5、 1.0、 1.5kGy的處理劑量， 每處理重復(fù)10次，經(jīng)Co6G輻照處理后，吸取各處理的懸浮液，梯度稀釋?zhuān)坎?于初篩培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平板，28 — 3(TC下培養(yǎng)48 — 72 h后，挑取不 同形態(tài)的單菌落進(jìn)行固體發(fā)酵的初篩、復(fù)篩及菌株間的多重比較，最終獲得一 株產(chǎn)P -甘露聚糖酶活力高的菌株MA-56;
誘變菌株篩選方法具體如下
初篩將誘變后挑取的菌株斜面分別用30ml無(wú)菌水沖洗制成孢子懸浮液，吸取2 ml接入篩選培養(yǎng)基，每支菌種做一個(gè)重復(fù)，28 。C恒溫培養(yǎng)48 h，進(jìn)行 初篩；以未經(jīng)C,處理的出發(fā)菌株MA作為對(duì)照，計(jì)算各誘變菌株產(chǎn)P -甘露聚糖 酶活比對(duì)照提高的百分?jǐn)?shù)，從中選出酶活性顯著高于對(duì)照的菌作為進(jìn)一步進(jìn)行 復(fù)篩的菌株；
復(fù)篩將初篩得到的菌株，按照完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每株菌三重復(fù)，再次 接入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩；同樣，將未經(jīng)Co6。處理的出發(fā)菌株MA作為對(duì)照，將 其中發(fā)酵酶活極顯著提高的菌株MA-56進(jìn)行保藏；
初篩、復(fù)篩的培養(yǎng)基為在300ml錐形瓶中，裝入麩皮8 g、豆粕2 g、 魔芋粉0. 4 g、玉米漿粉0. 2 g、 (NH4)2S04 0. 2 g、 H20 10 ml ， pH自然，0. IMPa 滅菌30 min。
(3)黑曲霉(Aspe/^7'""s MA-56的生物學(xué)特性
所得P-甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株MA-56,經(jīng)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生 物研究所酶工程研究室鑒定為一株黑曲霉菌種J^e/^7'W^ w>er。
① 形態(tài)學(xué)特征所得酶菌種的孢子為褐黑色，分生孢子頭球形至輻射形， 直徑150-450 pm;分生孢子梗生于基質(zhì)，孢梗莖1000-3000x12-20 um，黃色或 黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近球形，直徑40 — 70um，全部表面可育；產(chǎn)孢結(jié) 構(gòu)雙層，?；?0-20x4. 5-7. 0 P m ，瓶梗6-10x2. 5-3. 5 u m;分生孢子球形或近 球形，直徑3-4.5 (-5) um，褐色，壁粗糙；
② 培養(yǎng)學(xué)特性菌落在査氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，25°C 7天直徑40-50mm， 質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，褐黑色，無(wú)滲出液，菌落反面略 帶黃色。
黑曲霉(Aspei^j'"iAs 菌株MA-56,于2008年10月24日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員
會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 2722。
一種飼用P-甘露聚糖酶，該飼用P-甘露聚糖酶可以黑曲霉"印e/^j7^/s 77J>e》菌株MA-56 CGMCC No. 2722為生產(chǎn)菌種，接種于由麩皮、豆粕和魔芋 粉按重量份60 90: 10 40: 1~6比例配制成的固體培養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)酵、培養(yǎng)、 烘干、檢測(cè)后獲得。
一種詞用3 -甘露聚糖酶的制備方法，該方法按以下步驟進(jìn)行
(1) 黑曲霉(Aspe7^7^AS77&er)菌株MA-56各級(jí)培養(yǎng)基的配制包括，
① 斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200 g/1，蔗糖20g/1，瓊脂20g/1，自然 pH，經(jīng)0.1Mpa滅菌20min;
② 固體種子培養(yǎng)基300 ml三角瓶中裝入由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量 份80: 19: 1比例配制而成的培養(yǎng)基10g，按與固形物重量l: l比例加入自來(lái) 水，攪拌均勻，經(jīng)0.1Mpa滅菌30min;
③ 固體生產(chǎn)培養(yǎng)基先將麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份60 90: 10 40: 1 6比例配制成固體培養(yǎng)基；再將該固體培養(yǎng)基與水按重量1: 0.9 1.3的比例加 水并攪拌均勻，裝入布袋中，經(jīng)0.1Mpa滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤(pán)中， 發(fā)酵物料厚度為2~3 cm;
(2) 斜面種子制備將黑曲霉菌株MA-56劃線接種在步驟(1)①斜面種 子培養(yǎng)基上，于28'C下恒溫培養(yǎng)5d后，放置4。C冰箱內(nèi)保存，備用；
(3) 固體種子制備將步驟(2)斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為 1"07~108個(gè)/1111的孢子懸浮液后，吸取2ml接入步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中， 于28。C下恒溫培養(yǎng)3 d，再與無(wú)菌蒸餾水按重量h IOO比例攪拌混合后，用雙層紗布在無(wú)菌條件下過(guò)濾，得到濃度為1><107 108個(gè)/1111固體種子孢子懸浮液， 備用；
(4) 發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)同體種子孢子懸浮液與步驟(1)③固體生產(chǎn) 培養(yǎng)基按重量份15~30 : 100比例混合均勻后，置28°C曲房中發(fā)酵培養(yǎng)56 h得 飼用P-甘露聚糖酶酶曲；
(5) 酶曲的后處理、質(zhì)量檢測(cè)及包裝將步驟(4)酶曲置40。C鼓風(fēng)條件 下烘干10h、粉碎、過(guò)80目篩，得酶干曲；將經(jīng)飼用P-甘露聚糖酶活力檢測(cè)達(dá) 到lX10S :L3X10SU/g的酶干曲包裝、封口即成產(chǎn)品。
本發(fā)明的有益效果是
(1) 利用廉價(jià)的麩皮、豆粕等農(nóng)副產(chǎn)品為主原料，配制成由麩皮、豆粕和
魔芋粉按重量份60 90: 10 40: 1 6比例制成的高效發(fā)酵培養(yǎng)基，.且整個(gè)生產(chǎn) 過(guò)程中無(wú)需添加其它價(jià)格昂貴的試劑，使生產(chǎn)成本較低；同時(shí)，固體發(fā)酵生產(chǎn) 出來(lái)的酶干曲制劑可作為詞料添加劑直接添加使用，更進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。
(2) 黑曲霉MA-56所生產(chǎn)的P -甘露聚糖酶具有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定 性，在7(TC時(shí)保溫lh，仍能保持85 %左右的酶活，在pH3.0 9. 0的環(huán)境下 保持2h，其酶活仍能保持90 %以上，是所報(bào)道的酸性3-甘露聚糖酶中熱穩(wěn)定 性和pH穩(wěn)定性最好的(見(jiàn)實(shí)施例5)。


圖1黑曲霉MA-56 P -甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度 圖2黑曲霉MA-56e-甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性 圖3 pH對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響
具體實(shí)施方式
通過(guò)以下具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的具體說(shuō)明，但應(yīng)該理解本發(fā)明 并不受這些內(nèi)容所限止。
實(shí)施例1: ( P -甘露聚糖酶生產(chǎn)制備1 )
本例P -甘露聚糖酶按以下步驟制備 (1)黑曲霉菌株MA-56各級(jí)培養(yǎng)基的配制包括，
① 斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200 g/1，蔗糖20g/1，瓊脂20g/1，自然 pH，經(jīng)0.1Mpa滅菌20min;
② 固體種子培養(yǎng)基300 ml三角瓶中裝入由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量 份80: 19: 1比例配制而成的培養(yǎng)基10g，按與固形物重量h l比例加入自來(lái) 水，攪拌均勻，經(jīng)0.1Mpa滅菌30min;
③ 固體生產(chǎn)培養(yǎng)基先將麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份75: 23: 3比例 配制成固體培養(yǎng)基；再將該固體培養(yǎng)基與水按重量1: 1.3比例加水并攪拌均勻 裝入布袋中，經(jīng)0.1Mpa滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤(pán)中，發(fā)酵物料厚度為 2 3 cm;
(2) 斜面種子制備將黑曲霉菌株MA-56劃線接種在步驟(1)①斜面種 子培養(yǎng)基上，于28'C下恒溫培養(yǎng)5d后，放置4X:冰箱內(nèi)保存，備用；
(3) 固體種子制備將步驟(2)斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為 1><107 108個(gè)/1111的孢子懸浮液后，吸取2ml接入步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中， 于28'C下恒溫培養(yǎng)3 d，再與無(wú)菌蒸餾水按重量l: IOO比例攪拌混合后，用雙 層紗布在無(wú)菌條件下過(guò)濾，得到濃度為1><107 108個(gè)/1111固體種子孢子懸浮液， 備用；
(4) 發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)固體種子孢子懸浮液與步驟(1)③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基按重量份20 : 100比例混合均勻后，置28°C曲房中發(fā)酵培養(yǎng)56 h得飼用 e-甘露聚糖酶酶曲；
(5)酶曲的后處理與質(zhì)量檢測(cè)將步驟(4)酶曲置4(TC鼓風(fēng)條件下烘干10 h、粉碎、過(guò)80目篩，得酶干曲；將經(jīng)詞用P -甘露聚糖酶活力檢測(cè)達(dá)到1 X 105~1.3 X10SU/g的酶干曲包裝、封口即成產(chǎn)品。'
實(shí)施例2: ( P -甘露聚糖酶生產(chǎn)制備2)
本例中步驟(1)黑曲霉菌株MA-56各級(jí)培養(yǎng)基的配制③固體生產(chǎn) 培養(yǎng)基先將麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份88: 13: 1比例配制成固體培養(yǎng)基；
再將該固體培養(yǎng)基與水按重量1:1.1比例加水并攪拌均勻裝入布袋屮，經(jīng)0.1Mpa 滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤(pán)中，發(fā)酵物料厚度為2~3 cm;
步驟(4)木聚糖酶發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)固體種子孢子懸浮液與步驟(1) ③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基按重量份15 : 100比例混合均勻后，置28。C曲房中發(fā)酵培養(yǎng) 56 h得飼用P -甘露聚糖酶酶曲；
步驟(5):經(jīng)飼用e-甘露聚糖酶活力檢測(cè)達(dá)到lX105 1.3X105U/g;
其余工藝步驟均同于實(shí)施例1。
實(shí)施例3: ( P -甘露聚糖酶生產(chǎn)制備3 )
本例中步驟(1)黑曲霉菌株MA-56各級(jí)培養(yǎng)基的配制③固體生產(chǎn)培養(yǎng) 基先將麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份62: 37: 6比例配制成固體培養(yǎng)基；再
將該固體培養(yǎng)基與水按重量h 0.9比例加水并攪拌均勻裝入布袋中，經(jīng)0.1Mpa 滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤(pán)中，發(fā)酵物料厚度為2 3 cm;
步驟(4)木聚糖酶發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)固體種子孢子懸浮液與步驟(1) ③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基按重量份30 : 100比例混合均勻后，置28'C曲房中發(fā)酵培養(yǎng)56 h得飼用P -甘露聚糖酶酶曲；
步驟(5):經(jīng)飼用e-甘露聚糖酶活力檢測(cè)達(dá)到lX105~1.3X105U/g;
其余工藝步驟均同于實(shí)施例1。 實(shí)施例4: ( 3 -甘露聚糖酶活力檢測(cè))
e-甘露聚糖酶活力測(cè)定取3支試管各加入0.5 ml適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液， 與用pH5.0的O.lmol/1乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的0.5%角豆膠底物一起4CTC水浴 預(yù)熱5min;在第l、 2試管中各加入0.5ml角豆膠底物，40。C精確反應(yīng)10 min， 反應(yīng)完后在3支試管中各加入1.5 ml的DNS試劑，并在第3支試管中補(bǔ)加0.5 ml 角豆膠底物；取出并搖勻3支試管后在沸水浴中反應(yīng)5min，迅速冷卻至室溫， 用水定容至5.0ml，以第3支試管試液為對(duì)照在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定第1、 2支試 管試液的吸光度，吸光度在0.2 0.4之間為宜。酶活性定義在本測(cè)定條件下， 以每分鐘產(chǎn)生l嗎還原糖的酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。 實(shí)施例5:(對(duì)3 -甘露聚糖酶粗酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的檢測(cè))
①溫度對(duì)黑曲霉MA-56 P -甘露聚糖酶活力及穩(wěn)定性的影響
將實(shí)施例l、 2、或3制備的P-甘露聚糖酶粗酶，經(jīng)30倍蒸餾水在4(TC水 浴浸提30min后過(guò)濾，得到的濾液再次用蒸餾水進(jìn)行100倍稀釋?zhuān)cpH為5. 0 的0. lmo1/1乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的0. 5%角豆膠底物一起，在3(TC 8(TC的 不同溫度下，分別測(cè)定酶的活力，結(jié)果顯示該酶反應(yīng)隨著溫度升高而活力增加，
至7crc時(shí)達(dá)到最高峰，但超過(guò)7(rc后則活力急劇下降，表明e-甘露聚糖酶的
最適反應(yīng)溫度為70°C (見(jiàn)圖1)，這與報(bào)道的大多數(shù)e-甘露聚糖酶的最適反應(yīng) 溫度接近；研究酶的熱穩(wěn)定性時(shí)則將稀釋好的酶液分裝在不同的試管中，在65 。C 8(TC溫度的水浴中保溫不同時(shí)間，取出，立即冰水浴冷卻，然后與pH為5. 0的0. lmol/1乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的0. 5%角豆膠底物一起，4(TC精確反應(yīng)10 min，測(cè)定殘余酶活(圖2)。結(jié)果表明，該酶在7(TC時(shí)保溫lh，仍能保持85 % 左右的酶活，是所報(bào)道的酸性P -甘露聚糖酶中熱穩(wěn)定性最好的。 ②pH對(duì)黑曲霉MA-56 P -甘露聚糖酶的活力及穩(wěn)定性影響
將實(shí)施例1、 2、或3制備的P -甘露聚糖酶粗酶用30倍蒸餾水在4CTC水浴 浸提30min，過(guò)濾，將濾液分別用不同pH的緩沖液進(jìn)行100倍稀釋?zhuān)缓笈c用 相應(yīng)pH緩沖液配制的0.5。/。角豆膠底物在40 。C下反應(yīng)10min，測(cè)定酶活，研究 3 -甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH。所用緩沖液為pH 3. 0 6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬 酸緩沖液，pH 6. 5 8. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH 9. 0 1C. 0的甘 氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
將浸提得到的濾液用上述不同PH的緩沖液進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)糜?(TC水浴 環(huán)境中2 h后，用pH5. 0的0. lmol/1乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行再次10倍稀釋?zhuān)?使其最終pH均為5.0， 4CTC下測(cè)定殘余酶活，以研究酶的pH穩(wěn)定性。
最適pH和pH穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，黑曲霉MA-56 0 -甘露聚糖酶 的最適pH為pH2. 5 pH3. 5， pH大于5. 0酶活急驟下降。但該酶的pH穩(wěn)定范圍 較廣，在pH 3.0 9.0的環(huán)境下保持2h，其酶活仍能保持90 %以上。
權(quán)利要求
1、一種高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56，其菌種保藏號(hào)為CGMCC No.2722。
2、 一種飼用P-甘露聚糖酶，其特征在于該飼用P-tf露聚糖酶可以黑曲 霉(As^ergiWiAs /n>er)菌株MA-56 CGMCC No. 2722為生產(chǎn)菌種，接種于由 麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份60~90: 10-40: 1 6比例配制成的固體培養(yǎng)基中， 經(jīng)發(fā)酵、培養(yǎng)、烘干、檢測(cè)后獲得。
3、 一種制備權(quán)利要求2所述飼用e-甘露聚糖酶的方法，其特征在于按以下 步驟進(jìn)行(1) 黑曲霉"邵ei^j7^/s/7^"er)菌株MA-56各級(jí)培養(yǎng)基的配制包括，① 斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200 g/1，蔗糖20g/1，瓊脂20g/1，自然 pH，經(jīng)0.1Mpa滅菌20min;② 固體種子培養(yǎng)基300 ml三角瓶中裝入由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份80: 19: 1比例配制而成的培養(yǎng)基10g，按與固形物重量l: l比例加入自來(lái) 水，攪拌均勻，經(jīng)0.1Mpa滅菌30min;③ 固體生產(chǎn)培養(yǎng)基先將麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份60~90: 10~40: 1 6比例配制成固體培養(yǎng)基；再將該固體培養(yǎng)基與水按重量1: 0.9~1.3的比例加 水并攪拌均勻，裝入布袋中，經(jīng)0.1Mpa滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤(pán)中， 發(fā)酵物料厚度為2 3 cm;(2) 斜面種子制備將黑曲霉菌株MA-56劃線接種在歩驟(1)①斜面種 子培養(yǎng)基上，于28"C下恒溫培養(yǎng)5d后，放置《C冰箱內(nèi)保存，備用；(3) 固體種子制備將步驟(2)斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為 1><107~108個(gè)/1111的孢子懸浮液后，吸取2ml接入步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中，于28。C下恒溫培養(yǎng)3 d，再與無(wú)菌蒸餾水按重量l: 100比例攪拌混合后，用雙層紗布在無(wú)菌條件下過(guò)濾，得到濃度為lxl(T l()S個(gè)/ml固體種子孢子懸浮液， 備用；(4) 發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)固體種子孢子懸浮液與步驟(1)③固體生產(chǎn) 培養(yǎng)基按重量份15~30 : 100比例混合均勻后，置28°C曲房中發(fā)酵培養(yǎng)56 h得 飼用e-甘露聚糖酶酶曲；(5) 酶曲的后處理、質(zhì)量檢測(cè)及包裝將步驟(4)酶曲置4(TC鼓風(fēng)條件 下烘干10h、粉碎、過(guò)80目篩，得酶干曲；將經(jīng)飼用e-甘露聚糖酶活力檢測(cè)達(dá) 到lX10S 1.3Xl(^U/g的酶干曲包裝、封口即成產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種飼用β-甘露聚糖酶及其制備方法，屬于微生物發(fā)酵和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明經(jīng)誘變、篩選獲得了一種能以豐富、廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵原料，所產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶對(duì)熱和pH穩(wěn)定性較強(qiáng)的黑曲霉新菌株(Aspergillus niger)MA-56 CGMCC No.2722；并提出了以該菌株為生產(chǎn)菌種，接種于由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份60～90∶10～40∶1～6比例配制而成的固體培養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)酵、培養(yǎng)、烘干、檢測(cè)制備成飼用β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法。該酶在70℃保溫1h，仍能保持85％左右的酶活，在pH 3.0～9.0環(huán)境下2h，仍保持酶活90％以上，較適宜作為飼料添加劑。可在飼料生產(chǎn)領(lǐng)域中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101481674SQ20091009550
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者李艷麗, 永 柳, 王有良, 許少春, 許堯興 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;浙江湖州笑果生物科技有限公司