專利名稱：O157:h7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及0157: H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速^r測試劑盒及枱， 測方法。
(二)
背景技術(shù)：
新發(fā)現(xiàn)和重新抬頭的病原微生物是當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)面臨的新課題，腸出 血性大腸菌0157: H7就是其中的一種。0157: H7是腸出血性大腸艾希 菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli， EHEC )最主要的血清型，于1982 年首次在美國發(fā)現(xiàn)，為新發(fā)病原菌。其致病性強(qiáng)，感染劑量極低，食入不 足10個細(xì)菌即可引起疾病。該菌主要引起出血性腸炎(HC)、溶血性尿 毒綜合癥(HCS)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP),病死率高達(dá)30% 以上，是全球關(guān)注的世界性公共衛(wèi)生問題。我國自1988年在江蘇徐州檢 出首抹EHEC0157: H7后，各地加強(qiáng)了對腸道門診、畜禽及肉制品等的 食品檢測，相繼從腹瀉病人、家畜、家禽及食品中多次檢出0157: H7 大腸菌。通過對近幾年我省0157分離林毒力基因檢測(PCR法)發(fā)現(xiàn)我 省主要以Stx2為主，同時攜帶Stx2和Stxl基因的菌林則比較少，這與國 內(nèi)其他省市分離出的大多數(shù)菌抹相似，但與Fagan等報(bào)道則不同，故本研 究主要選取stx2基因?yàn)榘一蜻M(jìn)行檢測。rfbE與fliC基因分別編碼0157: H7菌體抗原O抗原及鞭毛抗原H抗原，針對這兩種基因的檢測將有助于 0157: H7血清型診斷的進(jìn)一步驗(yàn)證。
目前，大多數(shù)基層實(shí)驗(yàn)室鑒定0157: H7大腸菌仍主要依賴于傳統(tǒng)培 養(yǎng)方法、生化和血清學(xué)鑒定方法，檢驗(yàn)方法繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果時間長，難以適應(yīng)快速檢測的要求。近年來，PCR法檢測0157: H7 大腸菌得到了迅速發(fā)展，主要有常規(guī)PCR、多重PCR、 Real-time PCR等， 但這些方法均需特殊的儀器，不適合在基層或小型實(shí)驗(yàn)室推廣使用。 Notomi等是2000年開發(fā)出的一種新的DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP),因其具有才喿作筒Y更易4亍、 結(jié)果判讀簡單等特點(diǎn)，可以在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用，該方法已在一些國家 地區(qū)被廣泛應(yīng)用，而國內(nèi)對此技術(shù)研究則剛剛起步，應(yīng)用LAMP技術(shù)檢 測0157: H7大腸菌目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)是Notomi等2000年開發(fā)出的一種新的DNA 環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法，即利用Bst大片段DNA聚合酶和根據(jù)不同耙序列 設(shè)計(jì)的4-6條引物，特異地識別革巴序列上的6個特定區(qū)域，在60 65。C 等溫條件下高效特異地?cái)U(kuò)增目的靶基因，終產(chǎn)物是具有與目的靶基因反 相重復(fù)序列的莖環(huán)DNA。如果再設(shè)計(jì)1-2條環(huán)引物，則可大大提高擴(kuò)增 反應(yīng)速度。該方法的一大特點(diǎn)是，可以通過反應(yīng)副產(chǎn)物一白色焦磷酸鎂沉 淀的產(chǎn)生與否判斷靶基因的存在，抑或在體系中加入熒光染色試劑，在紫 外燈下觀察，對反應(yīng)產(chǎn)物實(shí)時監(jiān)測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是根據(jù)上述原理，針對0157: H7的O抗原編碼rfbE、志 賀樣毒素stx2、 H鞭毛抗原編碼flic基因分別設(shè)計(jì)LAMP引物，提供一種 特異性強(qiáng)、靈敏度高的0157: H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速4企測試劑 盒及4企測方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
0157: H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒，主要包括特異性擴(kuò)增引物、BstDNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸混合物、PCR緩沖液， 所述特異性擴(kuò)增引物序列如下
rfbE FIP ( O抗原編碼rfbE特異性擴(kuò)增內(nèi)引物FIP ):
CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT;
rfbE BIP ( O抗原編碼rfbE特異性擴(kuò)增內(nèi)引物BIP ):
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT;
rfbE F3 ( O抗原編碼rfbE特異性擴(kuò)增外引物F3 ):
AACAGTCTTGTACAAGTCCA;
rfbE B3 ( O抗原編碼rfbE特異性擴(kuò)增外引物B3 ):
GGTGCTTTTGATATTTTTCCG;
rfbE LB ( O抗原編碼rfbE特異性擴(kuò)增環(huán)引物L(fēng)B ):
CGAAAC A AGGCC AGTTTTTTACC;
stx2 FIP (志賀樣毒素stx2特異性擴(kuò)增內(nèi)引物FIP ):
GGTTAATAACAGACACCGATGTGG誦ACAGAGATATCGACCCCT;
stx2 BIP (志賀樣毒素stx2特異性擴(kuò)增內(nèi)引物BIP ):
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT;
stx2 F3 (志賀樣毒素stx2特異性擴(kuò)增外引物F3 ):
GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG;
stx2 B3 (志賀樣毒素stx2特異性擴(kuò)增外引物B3 ):
GGCCACATATAAATTATTTTGCTC;
flic FIP ( H鞭毛抗原編碼flic基因特異性擴(kuò)增內(nèi)引物FIP ): GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT; flic BIP (H鞭毛抗原編碼flic基因特異性擴(kuò)增內(nèi)引物BIP):TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG; flic F3 (H鞭毛抗原編碼flic基因特異性擴(kuò)增外引物F3 ): GAACTGACGGTTC AGGCC;
flic B3 ( H鞭毛抗原編碼flic基因特異性擴(kuò)增外引物B3 ): AGCCATTCAGACCCAGAGT。
上述為試劑盒的組要成分，其他輔助成分可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選才奪。 其中脫氧三磷酸核苷混合物(dNTP)為dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的 混合，通常為dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物質(zhì)的量比1: 1: 1: 1的混 合物。
所述試劑盒中還可包括甜菜堿(Betaine )、 MgS04、 MnCl2和鈣黃 綠素(Calcein )。本發(fā)明方法主要參照2008年Tomita等4艮道，可在LAMP 反應(yīng)體系中加入適量MgS04、 MnCl2、鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)果在白光下通過 肉眼觀察綠色是否生成進(jìn)行判定，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)及產(chǎn)物;險測一步完成。該方法 是在Notomi等的方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)的最新方法，結(jié)果可通過在白光下 肉眼觀察是否產(chǎn)生綠色鈣錳復(fù)合物來判斷靶基因存在與否，它比以往在白 光下通過肉眼觀察有否產(chǎn)生白色焦磷S交鎂沉淀更易于判斷。
本發(fā)明還涉及0157: H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速^r測方法，所 述方法包括
(1)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物序列如下 r腿FIP:
CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT; rfbE BIP:
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT;
9r艦F3: AACAGTCTTGTACAAGTCCA; r艦B3: GGTGCTTTTGATATTTTTCCG; r艦LB: CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC; stx2 FIP:
GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT; stx2 BIP:
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT; stx2 F3: GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG; stx2 B3: GGCCACATATAAATTATTTTGCTC; flic FIP:
GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT; flic BIP:
TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG; flic F3: GAACTGACGGTTCAGGCC; flicB3: AGCCATTCAGACCCAGAGT; (2)提取待測樣品DNA，在以待測樣品DNA為模板、步驟(1)中 序歹'JrfbEFIP、 rfbEBIP、 rfbEB3、 rfbELB、 stx2FIP、 stx2BIP、 stx2 F3、 stx2 B3、 flic FIP、 flic BIP、 flic F3和flic B3為引物的 反應(yīng)體系中進(jìn)行LAMP反應(yīng)； (3 ) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行分析，若LAMP反應(yīng)結(jié)果為陽性，則
待測樣品中含有0157: H7大腸菌。 所述反應(yīng)體系中主要成分終濃度組成如下 Bst DNA聚合酶緩沖液 終濃度為1 x引物r艦FIP、 stx2FIP、 flicFIP
各1.2~2.0pM
引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flicBIP
各1.2~2.0pM
引物rfbEF3、 stx2F3、 flicF3
各O.l ~0.5一
引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3
各0.1 ~0.5nM
引物rfbE LB、
0.1 -0.5jiM
dNTP
0.4mM~ 1.0 mM
Bst DNA聚合酶
10U/反應(yīng)
溶劑為DEPC水。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate (焦碳酸二 乙酯)處理過并經(jīng)高溫、高壓消毒的MiliQ級純水。
所述緩沖液終濃度為1 x ，是指緩沖液中各組分在反應(yīng)體系終濃度與 1 x BstDNA聚合酶緩沖液相同，即表示緩沖液中各組分在反應(yīng)液中終濃 度如下20mMTris-HCl(pH8.8)、 lOmMKCl, 10mM (NH4)2S04、 4mM MgS04 、 0.1% TritonX-100。
所述反應(yīng)體系中還包括終濃度如下的組分0.5 1.0M的甜菜堿、 2~6mM的MgS04、 0.3~0.8mM的MnCl2和10~30(iM的鈣黃綠素。 所述步驟(2) LAMP反應(yīng)條件設(shè)置為60。Clh， 80。C2min。 具體的，所述方法如下 (1)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物序列rfbE FIP、 rfbE BIP、 rfbE F3、 rfbE B3、 rfbE LB、 stx2FIP、 stx2BIP、 stx2F3、 stx2B3、 flicFIP、 flicBIP、 flicF3 和flic B3;
(2 )提取待測樣品DNA,配制LAMP反應(yīng)體系終濃度組成如下 1 OxBst DNA聚合酶緩沖液 終濃度為1 x
引物rfbE FIP、 stx2 FIP、 flic FIP 各1.6(iM引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flic BIP 各1.6pM
引物rfbEF3、 stx2F3、 flic F3 各0.2(iM
引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3 各0.2jxM
引物r艦LB 0.4 jiM
dNTP混合物 0.6mM
甜菜堿 0.8M
鈣黃綠素 25|iM
MnCl2 0,5mM
MgS04 4mM
Bst DNA聚合酶 8U/反應(yīng)
樣品DNA 適量 溶劑為DEPC水；
LAMP反應(yīng)條件設(shè)置為60。Clh, 80。C2min;
(3) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察產(chǎn)物顏色變化，呈現(xiàn)明顯綠色判定為
陽性，即樣品含有0157: H7大腸菌，呈現(xiàn)橙色判斷為陰性，呈現(xiàn)
橙綠色則通過2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳觀察條帶是否出現(xiàn)，電泳條
帶明顯者判定為陽性，不明顯者判定為陰性(或取相應(yīng)LAMP產(chǎn)物
2ul再次LAMP，觀察顏色變化)。每次試驗(yàn)均做陰陽性對照。 本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在
1. 本方法不需要使用昂貴、精密的儀器設(shè)備，僅需一金屬裂解儀/恒溫水 浴裝置；
2. 耗時短，在恒溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，l小時左右即可完成，大大縮短了該 菌的檢測周期(從菌抹核酸的提取至檢測完成僅需1.5h左右)；
3. 白光下通過肉眼目測反應(yīng)體系顏色變化即可進(jìn)行結(jié)果判斷，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)及產(chǎn)物檢測一步完成，操作簡便；
4. 該方法為快速基因檢測提供了又一新的方法手段；
5. 該方法簡易、快速、特異、敏感，其特點(diǎn)和優(yōu)勢是，它不僅適合于科 研工作，還可以作為基層檢驗(yàn)部門及小型實(shí)驗(yàn)室疾病應(yīng)急診斷等使用，如 對流行病學(xué)人員稍加培訓(xùn)，即可自行在應(yīng)急車上或開展現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查 時使用，在快速檢測方面有著較為廣泛的應(yīng)用前景。
(四)


圖1為16抹0157標(biāo)準(zhǔn)株及地方分離株rfbE基因LAMP擴(kuò)增結(jié)果； 圖2為16抹0157標(biāo)準(zhǔn)抹及地方分離抹Stx2基因LAMP擴(kuò)增結(jié)果； 圖3為16抹0157標(biāo)準(zhǔn)林及地方分離林fliC基因LAMP擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍
并不僅限于此
實(shí)施例1:
準(zhǔn)抹0157: H7、地方0157分離抹及其它腸道實(shí)驗(yàn)林)進(jìn)行;險測，將該 結(jié)果與普通PCR、定量PCR法結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證本方法特異性。實(shí) 驗(yàn)中大腸菌028ac84-1373、 LT-85-44及84-135其fliC基因LAMP結(jié)果為 陽性，結(jié)果其普通PCR與定量PCR結(jié)果也均為陽性，推測認(rèn)為這可能與 該三抹菌均攜帶編碼0157: H7鞭毛抗原H抗原的fliC基因有關(guān)。
反應(yīng)體系如下 10x緩沖液
引物rfbEFIP、 stx2FIP、 flicFIP
2.5 " 各1.6pM 1物rfbE BIP 、 stx2 BIP 、 flic BIP 各1.6pM
引物r艦F3、 stx2F3、 flic F3 各0.2jiM
引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3 各0.2|iM 引物rfbE LB 0.4 )iM
dNTP混合物(l: 1: 1: 1) 共0.6mM 甜菜堿 0.8M 鈣黃綠素 25 jiM
MnCl2 0.5mM MgS04 4mM Bst聚合酶 8U酶/反應(yīng)
樣品菌4朱DNA 4pL DEPC水補(bǔ)足至25 |u L。
LAMP擴(kuò)增條件設(shè)置為60°C 1 h, 80°C2min。
其中16株0157標(biāo)準(zhǔn)林及地方分離抹rfbE、 Stx2、 fliC基因LAMP 擴(kuò)增結(jié)果分別見圖1、圖2和圖3;(圖中1~16菌4朱依次為882364標(biāo)準(zhǔn) 抹、W933標(biāo)準(zhǔn)抹、97隱1 (0157:H7)、 99-1 (0157:H7)、 00-2 ( 0157: H醒)、 00-4 (0157:H7)、 00-5 (0157:H7)、 05-1 (0157:H7)、 00-6 (0157:H7)、 00-7 (0157:H7)、 06-12 (0157:H7)、杭3-325 ( 0157:H-)、杭3-189 (0157:H-)、 HZl-68 (0157:H-)、杭4-257 ( Ol57: H畫)、杭3-307 (0157: H-))。
通過實(shí)驗(yàn)部分菌抹的LAMP擴(kuò)增結(jié)果，可以看出，使用本發(fā)明方法 檢測，可針對目標(biāo)菌抹進(jìn)行檢測鑒定，特異性好。 靈敏度檢測
取菌量為5xl07cfU/mL的0157:H7大腸菌，用雙蒸水進(jìn)行IO倍稀釋，
14分別從10" ~ 1(rS稀釋液中吸取100uL，經(jīng)100。C15min裂解再高速離心后， 各制成100uL的DNA模板，按照上述條件進(jìn)行LAMP敏感性試驗(yàn)。
以最低檢出稀釋度模板量計(jì)算靈敏度,本體系檢測三種靶基因的最低 檢出限均為26cfU/反應(yīng)，靈敏度高。<formula>formula see original document page 16</formula><211> 21 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223〉人工序列 <400> 4
ggtgcttttg atatttttcc g 21
<210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 5
cgaaacaagg ccagtttttt acc 23
<210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 6
ggttaataac agacaccgat gtggacagag atatcgaccc ct 42
<210> 7 <2U> 43 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 7
taaggaatca ccttgcagat aaactagtac attggcatcg tgt 43
<210> 8 <211> 24<formula>formula see original document page 18</formula><213> Unknown <220>
<223>人工序列 <400> 12
gaactgacgg ttcaggcc 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列
<400> 13
agccattcag acccagagt 19
權(quán)利要求
1. O157H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒，主要包括特異性擴(kuò)增引物、Bst DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸混合物、PCR緩沖液，其特征在于所述特異性擴(kuò)增引物序列如下rfbE FIPCTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT；rfbE BIPTAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；rfbE F3AACAGTCTTGTACAAGTCCA；rfbE B3GGTGCTTTTGATATTTTTCCG；rfbE LBCGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC；stx2 FIPGGTTAATAACAGACACCGATGTGGACAGAGATATCGACCCCT；stx2 BIPTAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；stx2 F3GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG；stx2 B3GGCCACATATAAATTATTTTGCTC；flic FIPGCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT；flic BIPTGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG；flic F3GAACTGACGGTTCAGGCC；flic B3AGCCATTCAGACCCAGAGT。
2. 如權(quán)利要要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括甜菜堿、 MgS04、 MnCl2和鈣黃綠素。
3. 0157: H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，所述方法包括(1)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物序列如下 r腿FIP: CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT;r艦BIP: TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT; rfbEF3: AACAGTCTTGTACAAGTCCA; rfbEB3: GGTGCTTTTGATATTTTTCCG; rfbELB: CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC;stx2 FIP: GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT; stx2 BIP: TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT; stx2 F3: GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG; stx2 B3: GGCCACATATAAATTATTTTGCTC;flic FIP: GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT; flic BIP: TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG; flic F3: GAACTGACGGTTCAGGCC; flicB3: AGCCATTCAGACCCAGAGT;(2 )提取待測樣品DNA，在以待測樣品DNA為模板、步驟(1 )中序歹'J rfbE FIP、 rfbEBIP、 rfbEF3、 rfbEB3、 rfbELB、 stx2 FIP、 stx2BIP、 stx2F3、 stx2 B3、 flic FIP、 flic BIP、 flic F3和flic B3為引物的反應(yīng)體系中進(jìn)4亍 LAMP反應(yīng)；(3) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行分析，若LAMP反應(yīng)結(jié)果均為陽性，則待測樣 品中含有產(chǎn)stx2毒力基因的0157: H7大腸菌。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中主要成分終濃度組成Bst DNA聚合酶緩沖液終濃度為lx引物rfbEFIP、 stx2FIP、 flicFIP各1.2~2.0[iM引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flicBIP各1.2~2.0jaM引物rfbEF3、 stx2F3、 flicF3各O.l ~0.5拜引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3各0.1 ~0.5(iM引物rfbE LB、0.1 ~0.5|iMdNTP0.4mM ~ 1.0 mMBst DNA聚合酶5 10U/反應(yīng)溶劑為DEPC水。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中還包括終濃度如下的組分0.5 1.0M的甜菜石咸、2 6mM的MgSO4、0.3 0.8mM的MnCl2和10~30|iM的鈣黃綠素。
6. 如權(quán)利要求3 5之一所述的方法，其特征在于所述步驟(2) LAMP反應(yīng)條件設(shè)置為60。Clh, 80。C2min。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物序列rfbE FIP、 rfbE BIP、 rfbE F3、 rfbE B3、 rfbE LB、stx2 FIP、 stx2 BIP、 stx2 F3、 stx2 B3、 flic FIP、 flic BIP、 flic F3和flic B3;(2 )提取待測樣品DNA，配制LAMP反應(yīng)體系終濃度組成如下10xBst DNA聚合酶緩沖液纟冬濃度為lx引物rfbEFIP、 stx2FIP、 flicFIP各1.6(iM引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flic BIP各1.6|xM引物rfbEF3、 stx2F3、 flicF3各0.2一引物rfbEB3、 stx2B3、 flicB3引物rfbE LB0.4 一dNTP混合物0.6mM甜菜堿0駕鉤黃綠素MnCl20.5mM MgS04 4mMBst DNA聚合酶 8U /反應(yīng)樣品DNA 適量溶劑為DEPC水；LAMP反應(yīng)條件設(shè)置為60。Clh, 80。C2min;(3) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，肉目艮觀察產(chǎn)物顏色變化，呈現(xiàn)明顯綠色判定為陽性，即樣品含有0157: H7大腸菌，呈現(xiàn);險色判斷為陰性，呈現(xiàn)橙綠色則通過2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳觀察條帶是否出現(xiàn)，電泳條帶明顯者判定為陽性，不明顯者判定為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種O157:H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒。本發(fā)明針對O157:H7的O抗原編碼rfbE、志賀樣毒素stx2、H鞭毛抗原編碼flic基因分別設(shè)計(jì)LAMP引物，提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的O157:H7大腸菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在(1)不需要使用昂貴、精密的儀器設(shè)備，僅需一金屬裂解儀/恒溫水浴裝置；(2)耗時短，在恒溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，1小時左右即可完成；(3)白光下通過肉眼目測反應(yīng)體系顏色變化即可進(jìn)行結(jié)果判斷，操作簡便；(4)本發(fā)明方法簡易、快速、特異、敏感，在快速檢測方面有著較為廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101487057SQ200910096030
公開日2009年7月22日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者朱水榮 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心