專利名稱：：一種耐氧性雙歧桿菌的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于食品科學
技術領域：
，主要涉及一種耐氧性的雙歧桿菌菌抹。
背景技術：
：自1899年Tissier首次從嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離出雙歧桿菌以來，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌作為一種活性菌在功能性制品中具有很好的健康作用。這些作用主要包括抑制腸道病原菌的生長、抑制致癌因子及其活性、治療腹瀉與〗更秘、刺激免疫功能和降低血清膽固醇水平等。由于這些特殊的生理功能和保健作用，雙歧桿菌被廣泛應用到藥品和乳制品中。然而，要使雙歧桿菌發(fā)揮其保健功能，日攝入量應當不小于108CFU，因此產品中的活菌數(shù)在貨架期內必須達到10tFU/克或毫升。一些對市售酸奶制品的調查研究表明，許多產品的活菌數(shù)量低于1(^CFU/克或毫升。影響雙歧桿菌在酸奶制品中的存活率的因素有多種，包括菌種、pH值、儲存條件、發(fā)酵產物(乳酸和醋酸)及溶解氧等。由于雙》支桿菌屬專性厭氧菌，在制造及儲存過程中與溶解氧的接觸是影響其存活和穩(wěn)定性的一個重要因子。與需氧菌不同的是，雙歧桿菌缺乏將溶解氧轉化為水分子的系統(tǒng)，電子傳遞鏈的缺乏致使氧氣不能完全還原過氧化氬。另外，雙歧桿菌體內缺乏能分解過氧化氫的酶，與氧氣的接觸導致了一些代謝產物如02—、OH—、11202在細胞內的累積，大量的這些產物最終導致了細胞的死亡。為了解決這樣的問題，人們對能夠提高保存時存活率的各種添加劑比如說抗壞血酸、乳糖醇、木糖醇等的使用進行研究，但這些添加劑的使用會帶來制造成本上升，嗜好性降低等問題。人們也通過研究能夠阻斷氧氣與雙歧桿菌發(fā)酵物接觸的包裝材料來提高保存時的存活率，但是，到目前為止，還未提出完全的不透氧容器，而一些低透氧的容器價格昂貴，且廢棄物處理復雜，其利用也在多方面收到限制。國外的一些研究者發(fā)現(xiàn)，對于氧氣的耐受性，在很大程度上取決于菌抹，部分雙歧桿菌具有一定的氧耐受性。因此，改善雙歧桿菌在發(fā)酵乳或者乳飲料中的存活性根本的解決方法在于找出即使在好氧條件下也能具有高存活性的雙歧菌抹。TalwalkarA.和KailasapathyK等(Metabolicandbiochemicalresponsesofprobioticbacteriatooxygen,JournalofDairyScience,2003)在研究中發(fā)現(xiàn)某些雙歧桿菌在非嚴格厭氧環(huán)境下能獲得很好的生長。Meile等(Bifidobacteriumlactissp.nov.，amoderatelyoxygentolerantspeciesisolatedfromfermentedmilk，SystemAppliedMicrobiology,1997)從發(fā)酵奶制品中分離到一林氧耐受性強的乳酸雙歧桿菌。ShinjiKawasaki等(ResponseofmicroaerophilicBifidobacteriumboumandBifidobacteriumthermophilumtooxygen,Appliedenvironmentmicrobiology,2006)所選育的兩抹雙歧桿菌在20%氧氣濃度下能夠4艮好的生長。目前工業(yè)所用的雙ot支桿菌大部分對氧氣比4交^:感，這對其產品在儲存過程中保持較高的活菌有較大影響。
發(fā)明內容針對目前雙歧桿菌制品中活菌數(shù)普遍偏低的現(xiàn)象，本發(fā)明提供一種能夠耐受一定程度氧氣的雙歧桿菌。一種耐氧雙歧桿菌，該雙歧桿菌保藏名稱為動物雙歧桿菌乳酸亞種(5折cfo6acteWww<3m>wafc/acto)Qq08，保藏單位中國孩么生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏日期2009年1月4日，保藏號CGMCCNo.2844。該雙歧桿菌為動物雙歧桿菌，在TPY培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)24h后，呈現(xiàn)乳白色，光滑，圓形菌落。革蘭氏染色陽性，菌體多為為桿狀，少數(shù)存在分叉，透射電鏡下很容易找到雙歧桿菌典型的Y及H型。本發(fā)明的雙歧桿菌是從新疆發(fā)酵乳、西藏干酪及健康人體糞便的菌抹中分離出的雙歧桿菌再經耐氧性初篩和復篩得到的。培養(yǎng)方法為TPY培養(yǎng)基，2%的接種量，37°C，非嚴格厭氧培養(yǎng)。TPY培養(yǎng)基胰酶解酪朊10g;植質蛋白胨5g;酵母浸膏2.5g;葡萄糖15g;土溫801ml;K2HP042g;MgCl2.6H200.5g;CaCl20.15g;ZnCl2.7H200.25g,FeClJ鼓量，半胱氨酸0.5g;pH6.5;H201000mL。短期保藏方式為采用脫脂乳培養(yǎng)基，37°C,將該雙歧桿菌按照2%的接種量接種后培養(yǎng)至凝固后置4。C冰箱保藏，每個月轉接一次。脫脂乳培養(yǎng)基脫脂乳9.5g，酵母提取物0.5g,葡萄糖2g,半胱氨酸0.05g,自然pH，H20100mL。本發(fā)明的雙歧桿菌在TPY液體培養(yǎng)基中，通氣的情況下生長良好，應用于藥品和乳制品時，該雙歧桿菌對貯存條件要求低，有較高存活率。圖1是16-23SITS區(qū)序列分析圖2是本發(fā)明的雙歧桿菌在厭氧、微需氧、需氧條件培養(yǎng)下OD6oo值的變化曲線。具體實施方式菌抹的篩選從分離自新疆發(fā)酵乳、西藏干酪及健康人體糞便的菌抹中篩選。分離方法取樣后做適當稀釋，涂布平板，厭氧，37。C培養(yǎng)48h后，挑取單個菌落，做革蘭氏染色鏡檢，對符合雙歧桿菌典型形態(tài)特征的菌落保存于脫脂乳培養(yǎng)基中。篩選所用培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法TPY液體胰酶解酪朊10g;植質蛋白胨5g;酵母浸膏2.5g;葡萄糖15g;土溫80lml;K2HP042g;MgCl2.6H200.5g;CaCl20.15g;ZnCl2.7H200.25g,FeCl3微量，半胱氨酸0.5g;pH6.5;H201000mL。種子培養(yǎng)條件厭氧，37°C，24h。初篩條件微需氧培養(yǎng)，250mL三角瓶，裝液量100ml,搖床轉速100rpm，37°C,24h。復篩條件需氧培養(yǎng)，250ml玻璃瓶，100ml裝液量，搖床轉速150rpm，200rpm，37°C，24h。耐氧性雙歧桿菌的篩選方法雙歧桿菌的耐氧性用RBGR值來考察。將活化好的菌株按照1%的接種量接入裝有100mLTPY液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，微需氧及需氧培養(yǎng)用八層紗布封口；厭氧培養(yǎng)條件的構建配置好的TPY培養(yǎng)基力口熱至沸騰，加熱過程中持續(xù)通入高純氮氣，5min后放入涼水浴中冷卻，并持續(xù)通入氮氣，冷卻后用橡皮塞將瓶口封好，加入0.01。/。次曱基藍^f故為指示劑，液體變藍，說明尚有氧氣殘留。RBGR值的確定將接種后的三角瓶置于搖床，37°C,培養(yǎng)24h后取出測定OD600,RBGR值為需氧條件下測得的OD6oo值與嚴格厭氧條件下測得的OD,值的比值。RBGR值越大，說明該菌的耐氧性越好。(1)耐氧性雙歧桿菌初步篩選將分離到的雙歧桿菌，在100rpm的轉速下，測定不同菌株的RBGR值(結果見表l)。表l不同菌抹耐氧性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可以得到RBGR值高于0.7的菌抹有7株，其中B.longum.9631生長不好，所以保留另外6抹RBGR值較高的雙歧桿菌菌抹進行復篩。(2)耐氧性雙歧桿菌復篩將初篩得到的6抹菌在氧氣濃度逐漸增大的情況下，測定RBGR值'結果見表2。表2耐氧性雙歧桿菌復篩結果菌抹B鄰p.943B.spp.9415B鄰p.959B鄰p.9518B鄰p.9519B.spp.9639A,，37。C,24h磨rpm0.952±0.0156a0.829±0.0085c0.945±0.0198a0.930±0.0042a200rpm0.7335±0細320.6965±0.0049ab0.481±0.0226b150rpm0.725±0.0693s0.707±0.24750.5985±0.0163abab0.7435±0.0035d0.7115±0.0120.8785±0.0049b0,4485士0.00211ab0.457±0.0085t0.4305±0.15060.683±0.01840.708±0.0665由表2可知，B鄰p.943在三種不同的搖床轉速下，均具有較高的RBGR值，因此，該菌具有最好的耐氧性。該雙歧桿菌的特征描述和鑒定結果理化鑒定及其結果描述該菌在TPY培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)24h后，呈現(xiàn)乳白色，光滑，圓形菌落。革蘭氏染色陽性，菌體多為為桿狀，少數(shù)存在分叉，透射電鏡下很容易找到雙歧桿菌典型的Y及H型。經過試-瞼測試，該菌的生理生化特征見表3。表3生理生化特試驗結果生理生化特試驗結果征征注+表示陽性；-表示陰性；+-表示不確定根據伯爵氏細菌鑒定系統(tǒng)，由此上表可以初步確定該菌為動物雙歧桿菌(說y^/o6ocfer/zw7."w/w"fe)。該菌抹的分子鑒定及其結果經16-23rRNA試驗驗證(系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1)，該菌抹與動物雙歧桿菌乳酸亞種(萬折(iok^eWww.aw7wato/ac^DSM10140T(X89513))同源性為100%，命名為動物雙歧桿菌乳酸亞種(5折do6"cten'ww.a"/wa/^+凝固++++++++++++接觸酶運動性厭氧牛奶反應D-核糖L-阿拉伯葡萄糖酸鹽木糖甘露糖果糖半乳糖蔗糖水楊苷術、普-普享、營二浙來酉分浙二一二予A爭卜」禽一二喬t瞎享#八厶帛lw、vsir千木沖J么\、普疊享米者s:、魯藻二露s海蜜甘孝subsp/ac他)Qq08。該菌較目前市場上聲稱耐氧的5折cfo6acfeWM附./acfcBbl2菌才朱具有更高的RBGR值，其耐氧程度優(yōu)于5zy^oZwcfen'ww./acfeBbl2。新微生物的命名及保藏情況命名為動物雙歧桿菌乳酸亞種Qq08(S折cfo6acten'謂.am'應fcsubsp保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，筒稱CGMCC。保藏日期2009年1月4日，保藏號CGMCCNo.2844。該雙歧桿菌的筒單培養(yǎng)條件及其生長情況該雙歧桿菌的簡單培養(yǎng)及保藏條件該雙歧桿菌的培養(yǎng)方法為TPY培養(yǎng)基，2%的接種量，37°C，非嚴格厭氧培養(yǎng)。該雙歧桿菌的短期保藏方式為采用脫脂乳培養(yǎng)基，37°C，將該雙歧桿菌按照2%的接種量接種后培養(yǎng)至凝固后置4。C冰箱保藏，每個月轉接一次。脫脂乳培養(yǎng)基脫脂乳9.5g，酵母提取物0.5g,葡萄糖2g，半胱氨酸0.05g，自然pH,H20100mL。TPY培養(yǎng)基胰酶解酪朊10g;植質蛋白胨5g;酵母浸膏2.5g;葡萄糖15g;土溫801ml;K2HP042g;MgCl2.6H200.5g;CaCl20.15g;ZnCl2.7H200.25g，F(xiàn)eCl3微量，半胱氨酸0.5g;pH6.5;H201000mL。該菌在非嚴格厭氧條件下的生長情況將該雙歧桿菌在下述三種條件下培養(yǎng)24h后，取樣測定OD6oo值，結果見圖2，由此可知，該菌在微需氧以及需氧的條件下均能獲得不同程度的生長，在嚴才各厭氧情況下的生長狀況略好于有氧氣存在的情況。一、厭氧培養(yǎng)，250mL三角瓶，裝液量100ml，37°C，嚴才各厭氧。二、微需氧培養(yǎng)，250mL三角瓶，裝液量100ml，搖床轉速100rpm，37°C。三、需氧培養(yǎng)，250ml三角瓶，100ml裝液量，搖床轉速200rpm,37°C。權利要求1、一種動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)Qq08，保藏號為CGMCCNo.2844。全文摘要本發(fā)明公開了一種耐氧性雙歧桿菌，該雙歧桿菌保藏名稱為動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)Qq08，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2009年1月4日，保藏號CGMCCNo.2844。本發(fā)明的雙歧桿菌可以在TPY液體培養(yǎng)基中，通氣的情況下生長良好，應用于藥品和乳制品時，該雙歧桿菌對貯存條件要求低，有較高存活率。文檔編號C12N1/20GK101503667SQ20091009651公開日2009年8月12日申請日期2009年3月5日優(yōu)先權日2009年3月5日發(fā)明者何國慶,李青青,暉阮,陳啟和申請人:浙江大學