專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種^f鼓生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的方法。
(二)
背景技術(shù)：
1, 3-二羥基丙酮(1, 3-Dihydroxyacetone )又稱為二羥基丙酮，(以下 筒稱DHA),是最單的酮糖，帶有甜味的白色粉末狀結(jié)晶，易溶于水、乙 醇、丙酮和乙醚等有機溶劑。這種化學(xué)物質(zhì)的分子量為90.08。
DHA用途廣泛，市場容量大，DHA生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法與生物法。 生物法生產(chǎn)DHA與化學(xué)法相比具有許多優(yōu)點專一性強、底物利用率高、 轉(zhuǎn)化率高等特點。
用微生物法轉(zhuǎn)化甘油為二羥基丙酮的研究己有很多專利和文獻報道， 所用的用于產(chǎn)生甘油脫氫酶的微生物主要是葡糖桿菌屬(G/MC朋oZw"er)
(US 5770411 )和醋桿菌屬Ucetok7"w) (US 4076589)微生物，尤其 是氧化葡糖桿菌(G7wcwzoZ)acter ox;^/a"s )和弱氧化醋桿菌"ceZ)otefer Swk x;^ara)的報道居多，此外還研究過芽孢桿菌屬(Sac/〃M)的枯草 桿菌(Sac/〃w s由/to FERM P-10524 ) ( JP 2286089 )、單孢絲菌屬
(M/crawomwpora ) ( JP 62210994),假單胞菌屬(i^ewdomo"as )、沙雷 氏菌屬(5Wr^/a)、克霉伯氏菌屬(K/eZwW/a)、歐文藝節(jié)目氏菌屬
()、曲霉屬(^sperg7'〃ws )、青霉屬(尸ew/c/〃/ww )、才艮霉屬(i /n!zo;ms)
(US 4576913 )、畢赤酵母(P/c/^)等等。
生物催化甘油生產(chǎn)DHA的反應(yīng)機理就是，利用微生物產(chǎn)生的甘油脫氬酶通過催化甘油2位的羥基氧化成羰基反應(yīng)，生成DHA。
第2位OH
甘油脫氬酶是屬于氧化還原酶類，催化甘油氧化反應(yīng)生成DHA的反 應(yīng)需要輔酶(NAD+/NADH)參與。輔酶再生循環(huán)是氧化還原酶類生物催 化反應(yīng)的關(guān)4建。輔酶再生循環(huán)就是把輔酶從氧化態(tài)再生為還原態(tài)，或者反 之，從而使一定狀態(tài)的輔酶(氧化態(tài)與還原態(tài))保持在一定的催化劑量水 平。輔酶再生有化學(xué)、光化學(xué)、酶學(xué)和電化學(xué)等再生體系，在工業(yè)化生產(chǎn) 其中尤以酶法輔酶再生為主。輔酶再生體系在應(yīng)用過程中可以以游離酶的 狀態(tài)，或者以固定化酶、細(xì)胞內(nèi)酶等多種方式進行再生。微生物細(xì)胞內(nèi)自 身擁有十分完整的輔酶再生體系，通過微生物的各種代謝與呼吸鏈傳遞等 手段實現(xiàn)輔酶再生循環(huán)。因此利用整體細(xì)胞生物催化反應(yīng)，微生物細(xì)胞自 身的輔酶循環(huán)與平衡系統(tǒng)能有效解決輔酶再生問題，利用整體細(xì)胞進化催 化反應(yīng)時候，不需要添加輔酶，可以通過菌體培養(yǎng)，能恢復(fù)菌體細(xì)胞催化 活力。跟游離酶生物催化反應(yīng)相比，利用整體細(xì)胞進行生物催化反應(yīng)，具 有一定的優(yōu)點(l)減少了酶的分離、純化過程；(2)許多生物催化與生 物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程要在胞內(nèi)多酶體系中進行,極難在非細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)下得以重 現(xiàn)；(3 )完整細(xì)胞可在其代謝過程中產(chǎn)生各種輔酶，能保持輔酶再生循環(huán)， 使各種催化反應(yīng)得以順利進行。
國內(nèi)外報道生物法生產(chǎn)DHA方法主要有固定化細(xì)胞生物催化生產(chǎn) DHA,膜生物反應(yīng)器連續(xù)發(fā)酵法制取DHA,半連續(xù)二階段重復(fù)補料分批發(fā)酵法生產(chǎn)DHA等。未見文獻報道用氣攪拌式生物反應(yīng)器生產(chǎn)DHA,也 未見有關(guān)輔酶再生技術(shù)在DHA生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種高效、節(jié)能、才喿作簡單方便的二羥基丙酮生 產(chǎn)新工藝。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，所述方法包括
(1) 將氧化葡糖桿菌CCTCCNo: M 208069接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在 28 32°C 、通風(fēng)量0.3-1.5 vvm條件下培養(yǎng)24~32h，得到發(fā)酵液； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下甘露醇40-100 g/L,酵母提 取粉2 20g/L,蛋白胨l 20g/L， NaH2PO4'2H2O0.5~2g/L,溶 劑為水，pH4.0 7.0;氧化葡糖桿菌(G7腳"oteter 0x7d畫) ZJB-605,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢. 武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo: M 208069，保藏日 期2008年05月09曰。
(2) 在以步驟(1)發(fā)酵液中含酶細(xì)胞作為催化劑、以甘油為底物的 反應(yīng)體系中(可直接使用發(fā)酵液添加底物進行反應(yīng)，也可將發(fā) 酵液分離獲得濕菌體細(xì)胞作為催化劑加入甘油水溶液中進行反 應(yīng))，于氣攪拌式生物反應(yīng)器中，在溫度28~32°C 、通風(fēng)量0.3-3.0 vvm、 pH4.0 7.0條件下進行生物催化反應(yīng)，底物甘油初始濃度 為5 g/L~30 g/L，于反應(yīng)過程中流加甘油4吏甘油總濃度為 200-300g/L,總反應(yīng)時間為24h 96h,得到反應(yīng)液；過濾使含 催化劑的濾餅與濾液分離；(3) 含催化劑的濾餅繼續(xù)加入底物甘油的水溶液按照步驟(2)方法 重復(fù)進行多批次生物催化反應(yīng)后，對催化劑進行復(fù)活操作將 步驟(2 )含催化劑的濾餅置于足量的液體培養(yǎng)基中，在28~32°C 通風(fēng)量0.3 1.5 vvm條件下，培養(yǎng)20 28h;使含酶細(xì)胞復(fù)活，所 述液體培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油30 mL/L,酵母提取粉 5g/L,溶劑為水；
(4) 取步驟(3)復(fù)活后的含酶細(xì)胞另取甘油重復(fù)步驟(2)、 (3)的 操作，合并多個批次的反應(yīng)液的濾液，經(jīng)分離純化得到所述二 羥基丙酮。
通常，所述含酶細(xì)胞需經(jīng)固定化后獲得固定化細(xì)胞，再作為催化劑使用。
所述固定化細(xì)胞可重復(fù)使用3~5個批次，在連續(xù)進行3~4批反應(yīng)過 后，要對固定化細(xì)胞活力恢復(fù)，細(xì)胞內(nèi)輔酶會再生，重新達到平衡，滿足 進行固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)的要求。所述固定化細(xì)胞復(fù)活方法如下將 固定化細(xì)胞加入至液體培養(yǎng)基，在28 32。C通風(fēng)量0.3-1.5 vvm條件下， 培養(yǎng)20 28h;所述液體培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油30 mL/L，酵母提 取粉5g/L,溶劑為水。經(jīng)過細(xì)胞復(fù)活處理后的整體細(xì)胞的催化活力將會 恢復(fù)，然后進行3 5個批次的生物催化反應(yīng)操作，然后再進行細(xì)胞復(fù)活 操作，這樣可以循環(huán)3 5次。
本發(fā)明利用微生物產(chǎn)生的甘油脫氫酶通過催化甘油2位的羥基氧化 成羰基反應(yīng)，生成DHA。甘油脫氫酶是屬于氧化還原酶類，催化甘油氧 化反應(yīng)生成DHA的反應(yīng)需要輔酶(NAD+/NADH)參與。本發(fā)明利用微 生物胞內(nèi)甘油脫氫酶(整體細(xì)胞)作為生物催化劑，利用微生物細(xì)胞體內(nèi)自身的輔酶再生平衡系統(tǒng)，來實現(xiàn)輔酶的再生循環(huán)。在整體細(xì)胞進行催化
甘油生產(chǎn)DHA時候，由于輔酶再生循環(huán)等問題，整體細(xì)胞的催化活力會 下降，通過對整體細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞的催化活力得到恢復(fù)，可以實現(xiàn)整體 細(xì)胞多批次重復(fù)利用，提高生產(chǎn)效率，大大降低生產(chǎn)成本。
具體的，所述方法如下
(1) 氧化葡糖桿菌CCTCCNo: M 208069接種至斜面培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng) 至長出單菌落，作為斜面種子；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成如下 葡萄糖20g/L，酵母提取粉5g/L，瓊脂20g/L,溶劑為水，pH7.0;
(2) 將斜面種子接種至液體種子培養(yǎng)基，30°C、 100~200rpm振蕩培養(yǎng) 24~60h，得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油 10~50mL/L，酵母提取粉2 20g/L,蛋白胨l 20g/L, NaH2P04'2H20 0.5~2g/L,溶劑為水，pH4.0 7.0;
(3) 種子液以1~5%體積比接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度30。C、轉(zhuǎn)速 250 rpm、通風(fēng)量0.3-1.5 vvm、 pH 4.0~7.0條件下培養(yǎng)24~32h,得 到菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下甘露醇40 100g/L， 酵母提取粉2~20 g/L,蛋白胨卜20 g/L, NaH2P04'2H20 0.5~2 g/L， 溶劑為水，pH4.0 7.0;
(4) 將步驟(3)所述菌懸液，與4%海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻，將 混合液滴在1.0% CaCl2溶液中，靜置12小時，制備得到固定化細(xì) 胞，菌懸液、海藻酸鈉溶液CaCl2溶液體積用量之比為1: 1: 10;
(5 )將固定化細(xì)胞裝入氣攪拌式生物反應(yīng)器中，加入5 g/L ~ 30 g/L甘油 水溶液，于溫度30°C 、通風(fēng)量0.3~3.0 vvm、 pH 4.0~7.0條件下進行 生物催化反應(yīng)，反應(yīng)過程中流加甘油至反應(yīng)體系中甘油總濃度為200~300 g/L，總反應(yīng)時間為24h 96h;
(6) 反應(yīng)結(jié)束后，放出反應(yīng)液，往反應(yīng)器中加入甘油水溶液，按照步驟
(5)的操作進行下一批次生物催化反應(yīng)，總計進行3 5個批次的 生物催化反應(yīng)；
(7) 對固定化細(xì)胞進行細(xì)胞復(fù)活往反應(yīng)器中加入足量液體培養(yǎng)基，在 28 32。C通風(fēng)量0.3-1.5 vvm條件下，培養(yǎng)20~28h;所述液體培養(yǎng)基 終濃度組成如下甘油30mL/L,酵母提取粉5g/L，溶劑為水；
(8) 放出液體培養(yǎng)基，重復(fù)進行步驟(5) ~ (7)的操作1~3次，合并 各批次反應(yīng)液，經(jīng)分離純化得到所述二羥基丙酮。
或者，所述方法如下
(1) 氧化葡糖桿菌CCTCCNo: M 208069接種至斜面培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng) 至長出單菌落，作為斜面種子；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成如下 葡萄糖20g/L，酵母提取粉5g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH7.0;
(2) 將斜面種子接種至液體種子培養(yǎng)基，30°C、 100 200rpm振蕩培養(yǎng) 24 60h，得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油 10~50mL/L,酵母提取粉2 20g/L,蛋白胨l~20g/L， NaH2P04'2H20 0.5~2g/L，溶劑為水，pH4.0 7.0;
(3) 種子液以1~5%體積比接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度3(TC、轉(zhuǎn)速 250 rpm、通風(fēng)量0.3-1.5 vvm、 pH 4.0~7.0條件下培養(yǎng)24~32h，得 到菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下甘露醇40 100g/L, 酵母提取粉2 20 g/L,蛋白胨1 ~20 g/L ， NaH2P04-2H20 0.5~2 g/L, 溶劑為水，pH4.0 7.0;
(4) 將步驟(3)得到的菌懸液移入氣攪拌式生物反應(yīng)器，連續(xù)加入甘油，甘油總的流加量為使甘油在反應(yīng)體系中總濃度達到200 300 g/L,于溫度30。C、通風(fēng)量0.3-3 wm、 pH 4.0 ~7.0條件下進行生物 催化反應(yīng)，總反應(yīng)時間為24 h ~ 96 h;
(5) 反應(yīng)結(jié)束后，放出反應(yīng)液進行固液分離，得到的上清液用于分離純 化二羥基丙酮，菌體重新裝入氣攪拌式生物反應(yīng)器，往反應(yīng)器中加 入甘油水溶液，按照步驟(4)的操作進行下一批次生物催化反應(yīng)， 總計進行3~5個批次的生物催化反應(yīng)；
(6) 對游離細(xì)胞進行細(xì)胞復(fù)活反應(yīng)后的菌體細(xì)胞加入液體培養(yǎng)基中， 在28 32。C通風(fēng)量0.3 1.5 wm條件下，培養(yǎng)20 28h;所述液體培 養(yǎng)基終濃度組成如下甘油30mL/L,酵母4是取粉5g/L,溶劑為水；
(7) 經(jīng)復(fù)活后的菌體細(xì)胞再重復(fù)步驟(4) (6)的操作1 3次，合并 各個批次的上清液，經(jīng)分離純化得到所述二羥基丙酮。
所述氣攪拌式生物反應(yīng)器可為下列之一鼓泡塔生物反應(yīng)器，外循環(huán) 式氣升式生物反應(yīng)器，內(nèi)循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器。
所述分離純化可按本領(lǐng)域常規(guī)適用于二羥基丙酮的分離純化步驟進 行，如過濾、離心、沉淀、結(jié)晶、重結(jié)晶、濃縮、干燥、冷凍干燥、吸 附、離子交換、層析等等。本發(fā)明中所述分離純化方法如下將反應(yīng)液或 上清液濃縮得到濃縮液，濃縮液上層析柱，采用體積比95: 5的乙酸乙酯 -乙醇混合溶劑為流動相，4吏用石油醚濕法裝柱，層析柱高徑比10 40: 1, 洗脫流速lmL/min 10mL/min,加樣體積為柱床體積的3°/。 10%;收集含 DHA段樣品，進行真空濃縮，于體積比95: 5的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲 得二羥基丙酮結(jié)晶。
本發(fā)明中，DHA的分析方法可采用氣相色譜與薄層層析方法進行DHA薄層層析方法實驗采用G型硅膠板(20mmxl0mm),展開劑 氯仿-曱醇-蒸餾水混合溶劑(體積比為80:19:1 ),顯色劑組成為磷鉬酸 3g，曱醇45mL,蒸餾水45mL和濃硫酸10mL。具體操作步驟將點樣 后的硅膠薄板以基準(zhǔn)線向下放置在裝有展開劑的層析缸中展開10 ~ 15min,直至展開劑擴散至距離薄板頂端1 2cm處。取出薄板，吹干， 碘缸中熏蒸2 5min，顯色，放入烘箱中，在110。C下烘烤10min左右， 即可呈現(xiàn)DHA斑點，采用CAMMA的薄層掃描儀測定DHA含量。
DHA氣相色i普分析方法所用的儀器瓦里安varian cp-3800氣相色 譜儀，帶氫火焰離子化檢測器；PY-2020iD型裂解器(Frontier Laboratories Ltd. Japan )。所用試劑TMAH ( 25%水溶液)，DHA (色譜純)，甘油、 無水曱醇(分析純)，蒸餾水。色譜條件Ultra ALLOY-5不銹鋼毛細(xì)管 柱(30mx0.25 mmx0.25 );汽化溫度400。C;檢測器溫度280°C;柱 溫50。C開始以rC/min升至60°C,再以10°C/min升至280°C;分流比 30:1;載氣，氮氣；柱流量lmL/min。加樣0.2(iL發(fā)酵上清夜和0.4[iL TMAH ( 25%水溶液)。
本發(fā)明利用整體細(xì)胞作為生物催化劑，結(jié)合整體細(xì)胞輔酶再生技術(shù)， 在氣攪拌式生物反應(yīng)器中生產(chǎn)DHA;具有操作簡單方便、節(jié)能、生產(chǎn)效 率高等特點，可適合于工業(yè)化大規(guī)4莫生產(chǎn)。
(四)


圖1為鼓泡塔生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖2為內(nèi)循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖3為外循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍
并不僅限于此 實施例1:
斜面培養(yǎng)基配方葡萄糖20g/L ，酵母提取粉5 g/L,瓊脂20g/L, 用自來水配制，用l.Omol/L的HC1或者1.0mol/L NaOH溶液將pH調(diào)到 7.0，加熱溶解瓊脂，12rC滅菌20min后，擺置成斜面，冷卻后得到斜面 培養(yǎng)基備用。
搖瓶液體種子培養(yǎng)基的配方甘油10 mL/L,酵母提取粉2g/L,蛋 白胨1 g/L， NaH2P04'2H20 0.5 g/L，溶劑為水，用1.0mol/L的HC1調(diào)pH 到4.0。
將保藏在4。C冰箱中斜面菌抹氧化葡糖桿菌CCTCC No: M 208069取 出，接種到新配制的斜面培養(yǎng)基中，3(TC下，培養(yǎng)24h,將作為斜面種子 備用。
取600mL搖瓶液體種子培養(yǎng)基，裝到12個500mL三角瓶中裝入， 每個搖瓶裝50mL, 121。C滅菌20min，將斜面種子接種至500mL三角瓶， 30°C、 200rpm振蕩培養(yǎng)24h,得到種子液，待用。
發(fā)酵培養(yǎng)基的配方甘露醇40g/L,酵母提取粉2g/L,蛋白胨1 g/L, NaH2P04.2H20 0.5g/L,溶劑為水，用1.Omol/L的HC1調(diào)pH到4.0。
按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方制備發(fā)酵培養(yǎng)基10 L,裝入15L發(fā)酵罐，121°C 滅菌20min后。接入種子液500 mL,進行菌體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下溫 度30。C，轉(zhuǎn)速250rpm,通風(fēng)量為0.3wm，培養(yǎng)過程中采用1.Omol/L的 HC1或者1.0mol/LNaOH控制pH為4.0，培養(yǎng)24h。將上述含有菌體的培養(yǎng)液與4% (w/w)海藻酸鈉水溶液以等體積比
混合，攪拌均勻后，將它滴在體積為培養(yǎng)液體積IO倍的1.0%(w/w) CaCl2 溶液中，在4。C條件靜置12h,凝結(jié)成小球狀固定化細(xì)胞顆粒。用無菌紗 布進行過濾得到固定化化細(xì)胞，再用無菌水淋洗。用無菌量筒量取約1.8L 的固定化細(xì)胞，裝入無菌的氣攪拌鼓泡塔生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器的總?cè)莘e 為2.0L,高徑比為5，裝置為玻璃制造，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。加入濃度 為5 g/L甘油水溶液，到總反應(yīng)體積達到1.9 L為止，進^f于固定化細(xì)^^生 物催化反應(yīng)，反應(yīng)條件如下通風(fēng)量為0.3vvm,溫度30。C， pH控制在 4.0,用1.0 mol/L HC1或NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值，在反應(yīng)過程中流加 甘油，流加速度為8 mL/h,流加至總甘油濃度為200g/L。反應(yīng)48h，放 出反應(yīng)液。再重復(fù)進行一批次的固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)，連續(xù)反應(yīng)3 批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)。
然后進行固定化細(xì)胞催化活力恢復(fù)，加入無菌的液體培養(yǎng)基到氣攪拌 鼓泡塔生物反應(yīng)器至總的體積為1.9L,液體培養(yǎng)基的組成如下甘油30 mL/L,酵母提取粉5g/L,其余為水。固定化細(xì)胞活力恢復(fù)的培養(yǎng)條件如 下30。C下，通風(fēng)量為0.3vvm，培養(yǎng)24h。
固定化細(xì)胞經(jīng)過活力恢復(fù)培養(yǎng)后，進行固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)，反 應(yīng)搡作同上，連續(xù)進行3批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)。然后再進行固定 化細(xì)胞催化活力恢復(fù)，這樣連續(xù)進行3個循環(huán)，共進行9批次固定化細(xì)胞 生物催化反應(yīng)生產(chǎn)DHA。將各批次的反應(yīng)液混合，用于提取DHA產(chǎn)品。
收集上述反應(yīng)液1000mL,經(jīng)過離心(10000xg, 10 min)之后，上 清液濃縮至250mL，在55。C下活性炭脫色30min,然后真空濃縮至漿狀， 加入適量無水乙醇混勻，真空濃縮去乙醇，反復(fù)加入乙醇三次，濃縮至無乙醇為止，濃縮物備用。
上述濃縮物通過裝有100-200目硅膠的吸附層析柱分離濃縮物中的 DHA和甘油，采用95:5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動相，使用石油 醚濕法裝柱，在高徑比35:1，洗脫流速2mL/min，加樣量為柱床體積5% 時，其濃縮物中甘油和DHA分離效果較好。收集含DHA段樣品，進行 真空濃縮，在95:5的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲得白色DHA結(jié)晶，冷凍干 燥后得到81.6gDHA。
實施例2:
斜面培養(yǎng)基配方葡萄糖20g/L，酵母提取粉5 g/L，瓊脂20g/L， 用自來水配制，用1.0mol/L的HC1或者1.0mol/L NaOH溶液將pH調(diào)到 7.0，加熱溶解瓊脂，121。C滅菌20min后，擺置成斜面，冷卻后得到斜面 培養(yǎng)基備用。
搖瓶液體種子培養(yǎng)基的配方甘油50mL/L,酵母提取粉20g/L,蛋 白胨20g/L, NaH2P04'2H20 2 g/L，溶劑為水，用1.0mol/L的HC1或者 1.0mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。
將保藏在4。C冰箱中斜面菌林氧化葡糖桿菌CCTCC No: M 208069取 出，接種到新配制的斜面培養(yǎng)基中，3(TC下，培養(yǎng)24h,將作為斜面種子 備用。
取600mL搖瓶液體種子培養(yǎng)基，分裝到12個500mL三角瓶中裝入， 每個500mL三角瓶中裝50mL。 121。C滅菌20min,將斜面種子接種至 500mL三角瓶，30°C、 100rpm振蕩培養(yǎng)60h，得到種子液，待用。
發(fā)酵培養(yǎng)基的配方甘露醇100g/L,酵母提取粉20g/L,蛋白胨20g/L， NaH2P04'2H20 2 g/L，溶劑為水，用1.0mol/L的HCl或者1.Omol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。
按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方制備發(fā)酵培養(yǎng)基10 L,裝入15L發(fā)酵罐，121 °C 滅菌20min后。接入種子液500mL,進行菌體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下溫 度3(TC,轉(zhuǎn)速250rpm,通風(fēng)量為1.5vvm，培養(yǎng)過程中采用1.0mol/L的 HC1或者1.0mol/L NaOH控制pH為7.0，培養(yǎng)32h。
將上述含有菌體的培養(yǎng)液與4%海藻酸鈉水溶液以等體積比混合，攪 拌均勻，然后將它滴在1.0。/oCaCl2溶液中，在4。C條件靜止12h,凝結(jié)成 小球狀固定化細(xì)胞。用無菌紗布進行過濾固定化化細(xì)胞,再用無菌水淋洗。 用無菌量筒量取約1.8L的固定化細(xì)胞，裝入無菌的內(nèi)循環(huán)式氣升式生物 反應(yīng)器中，該反應(yīng)器的總?cè)莘e為2.0 L，高徑比為5，裝置為玻璃制造， 其結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。加入濃度為30g/L的甘油溶液，到總反應(yīng)體積達到 1.9L為止，進行固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)生產(chǎn)DHA，反應(yīng)條件如下通 風(fēng)量為3.0 wm,溫度30。C, pH控制在7.0,用1.0 mol/L HC1或NaOH 調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值。在反應(yīng)進行12h后，開始流加甘油，流加速度為7 mL/h,流加至總甘油濃度為300g/L。反應(yīng)96h，排出反應(yīng)液，再重復(fù)進 行一批次的反應(yīng)，連續(xù)反應(yīng)3批次。
然后進行固定化細(xì)胞催化活力恢復(fù),加入無菌的液體培養(yǎng)基到內(nèi)循環(huán) 式氣升式生物反應(yīng)器至總體積為1.9L，液體培養(yǎng)基的組成如下甘油30 mL/L，酵母提取粉5g/L,其余為水。固定化細(xì)胞活力恢復(fù)的培養(yǎng)條件如 下30。C下，通風(fēng)量為1.5vvm，培養(yǎng)24h。
固定化細(xì)胞經(jīng)過活力恢復(fù)培養(yǎng)后，進行固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)，反 應(yīng)操作同上，連續(xù)進行3批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)。然后再進行固定化細(xì)胞催化活力恢復(fù)，這樣連續(xù)進行5個循環(huán)，共進行15批次固定化細(xì) 胞生物催化反應(yīng)生產(chǎn)DHA。將各批次的反應(yīng)液混合，用于提取DHA產(chǎn)
口
收集上述發(fā)酵液1000mL,按實例1步驟進行分離純化，得到130.4 g DHA。
實施例3:
斜面培養(yǎng)基配方葡萄糖20g/L,酵母提取粉5g/L,瓊脂20g/L， 用自來水配制，用1.0mol/L的HC1或者1.0mol/L NaOH溶液將pH調(diào)到 7.0，加熱溶解瓊脂，12rC滅菌20min后，擺置成斜面，冷卻后得到斜面 培養(yǎng)基備用。
搖瓶液體種子培養(yǎng)基的配方甘油20mL/L，酵母提取粉10g/L，蛋 白胨8 g/L, NaH2P04'2H20 0.8 g/L,溶劑為水，用1.0mol/L的HC1或者 1.0mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。
將保藏在4。C冰箱中斜面菌林氧化葡糖桿菌CCTCCNo: M208069取 出，接種到新配制的斜面培養(yǎng)基中，30"C下，培養(yǎng)24h，將作為斜面種子 備用。
取600mL搖瓶液體種子培養(yǎng)基，分裝到12個500mL三角瓶中裝入， 每個500mL三角瓶中裝50mL。 121。C滅菌20min,將斜面種子接種至 500mL三角瓶，30°C、 120rpm振蕩培養(yǎng)30h,得到種子液，待用。
發(fā)酵培養(yǎng)基的配方甘露醇60 g/L,酵母提取粉10 g/L,蛋白胨10 g/L, NaH2P04.2H20 1 g/L,溶劑為水，用1.Omol/L的HC1或者1.0mol/LNaOH 調(diào)節(jié)pH至6.0。
18按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方制備發(fā)酵培養(yǎng)基10 L,裝入15L發(fā)酵罐，121°C 滅菌20min后。接入種子液500mL，進行菌體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下溫 度30。C,轉(zhuǎn)速250rpm,通風(fēng)量為l.Ovvm,培養(yǎng)過程中采用1.Omol/L的 HC1或者1 .Omol/L NaOH控制pH為6.5,培養(yǎng)28h;
將上述的菌懸液1.9L裝入無菌的內(nèi)循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器中，該 反應(yīng)器的總?cè)莘e為2.0 L,高徑比為5,加入約10mL甘油，，良應(yīng)初始甘油 濃度為5g/L。進行游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)，反應(yīng)條件如下通風(fēng)量為3.0 vvm，溫度30°C, pH控制在7.0，用1.0 mol/L HC1或NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液 的pH值，在反應(yīng)開始流加甘油，流加速度為10mL/h,流加量為總甘油 濃度為250 g/L。反應(yīng)87h后進行固液分離，固液分離的方法為將含有菌 體細(xì)胞的反應(yīng)液在10000r/min條件下，離心10min。上清液用于提取DHA 產(chǎn)品，將菌體重新裝入內(nèi)循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器，進行游離細(xì)胞催化反 應(yīng)生產(chǎn)DHA,反應(yīng)條件同上一批次，連續(xù)反應(yīng)3批次。
然后進行游離細(xì)胞催化活力恢復(fù)，將菌體細(xì)胞和1.9L無菌的液體培 養(yǎng)基加入到氣攪拌生物反應(yīng)器，液體培養(yǎng)基的組成如下甘油30mL/L, 酵母提取粉5g/L,其余為水。游離細(xì)胞活力恢復(fù)的培養(yǎng)條件如下30°C 下,通風(fēng)量為1.5vvm, 培養(yǎng)24h。
游離細(xì)胞經(jīng)過活力恢復(fù)培養(yǎng)后，再進行游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)，反應(yīng) 操作同上，連續(xù)進行3批次游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)。然后再進行游離細(xì)胞 催化活力恢復(fù)，這樣連續(xù)進行5個循環(huán)，共進行15批次游離細(xì)胞生物催 化反應(yīng)生產(chǎn)DHA。將各批次的反應(yīng)液混合，用于提取DHA產(chǎn)品。
收集上述發(fā)酵液1000mL,按實例1步驟進行分離純化，得到150.3 g DHA。實施例4:
斜面培養(yǎng)基配方葡萄糖20g/L ,酵母提取粉5 g/L,瓊脂20 g/L , 用自來水配制，用1.0mol/L的HC1或者1.0mol/L NaOH溶液將pH調(diào)到 7.0，加熱溶解瓊脂，12rC滅菌20min后，擺置成斜面，冷卻后得到斜面 培養(yǎng)基備用。
搖瓶液體種子培養(yǎng)基的配方甘油30mL/L,酵母提取粉10g/L，蛋 白胨8 g/L， NaH2P04'2H20 1.2 g/L,溶劑為水，用1.Omol/L的HC1或者 1.0mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5.0。
將保藏在4。C冰箱中斜面菌抹氧化葡糖桿菌CCTCC No: M 208069 取出，接種到新配制的斜面培養(yǎng)基中，30。C下，培養(yǎng)24h,將作為斜面種 子備用。
取600 mL搖瓶液體種子培養(yǎng)基，分裝到12個500mL三角瓶中，每 個500mL三角瓶中裝50mL。 121"C滅菌20min,將斜面種子接種至500mL 三角瓶，30°C、 200rpm振蕩培養(yǎng)24h,得到種子液，待用。
發(fā)酵培養(yǎng)基的配方甘露醇40 g/L,酵母提取粉10 g/L,蛋白胨10 g/L， NaH2P04'2H20 1 g/L,溶劑為水，用1.Omol/L的HC1或者1.0mol/LNaOH 調(diào)節(jié)pH至6.0。
按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方制備發(fā)酵培養(yǎng)基IOL,裝入15L發(fā)酵罐，121°C 滅菌20 min 后。接入種子液500mL,進行菌體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下溫 度30。C，轉(zhuǎn)速250rpm,通風(fēng)量為1.5vvm,培養(yǎng)過程中采用1.Omol/L的 HC1或者1.0mol/LNaOH控制pH為5.0，培養(yǎng)24h。
將上述含有菌體的培養(yǎng)液1.9 L裝入無菌的鼓泡塔式生物反應(yīng)器中，該反應(yīng)器的總?cè)莘e為2.0 L,高徑比為5,加入約10mL甘油，反應(yīng)初始的 甘油濃度為5g/L。進行游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)，反應(yīng)條件如下通風(fēng)量 為2.0 vvm, 溫度30。C,在反應(yīng)開始就流加甘油，流加速度為20mL/h， 流加至總甘油濃度為220 g/L。反應(yīng)30h后進行固液分離，固液分離的方 法為將含有菌體細(xì)胞的反應(yīng)液進行在10000r/min條件下，離心10min。上 清液用于提取DHA產(chǎn)品，菌體重新裝入內(nèi)循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器，重 復(fù)進行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)條件同上一批次，連續(xù)反應(yīng)3批次。
然后進行游離細(xì)胞催化活力恢復(fù)，將菌體細(xì)胞和1.9L無菌的液體培 養(yǎng)基加入到氣攪拌生物反應(yīng)器，液體培養(yǎng)基的組成如下甘油30mL/L, 酵母^是取粉5g/L,其余為水。游離細(xì)胞活力恢復(fù)培養(yǎng)條件如下3(TC下， 通風(fēng)量為1.5vvm，培養(yǎng)24h。
游離細(xì)胞經(jīng)過活力恢復(fù)培養(yǎng)后，再進行游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)，反應(yīng) 操作同上，連續(xù)進行3批次游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)。然后再進行游離細(xì)胞 催化活力恢復(fù)，這樣連續(xù)進行5個循環(huán)，共進行15批次游離細(xì)胞生物催 化反應(yīng)生產(chǎn)DHA。將各批次的反應(yīng)液混合，用于提取DHA產(chǎn)品。
收集上述發(fā)酵液1000mL，按實例1步驟進行分離純化，冷凍干燥后 得到125.4 gDHA。
實施例5:
斜面培養(yǎng)基配方葡萄糖20g/L,酵母提取粉5 g/L,瓊脂20g/L, 用自來水配制，用1.Omol/L的HC1或者1.Omol/L NaOH溶液將pH調(diào)到 7.0，加熱溶解瓊脂，121'C滅菌20min后，擺置成斜面，冷卻后得到斜面
培養(yǎng)基備用。搖瓶液體種子培養(yǎng)基的配方甘油30mL/L,酵母提取粉10g/L,蛋 白胨8 g/L, NaH2P04'2H20 1.2 g/L,溶劑為水，用1.Omol/L的HC1或者 1.0mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5.0。
將保藏在4'C冰箱中斜面菌抹氧化葡糖桿菌CCTCC No: M 208069 取出，接種到新配制的斜面培養(yǎng)基中，3(TC下，培養(yǎng)24h，將作為斜面種 子備用。
取500mL搖瓶液體種子培養(yǎng)基，分裝到10個500mL三角瓶中裝入， 每個500mL三角瓶中裝50mL。 121。C滅菌20min,將斜面種子接種至 500mL三角瓶，30°C、 200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液，待用。
發(fā)酵培養(yǎng)基的配方甘露醇80 g/L，酵母提取粉10 g/L，蛋白胨10 g/L, NaH2P04.2H20 1 g/L,溶劑為水，用1.Omol/L的HC1或者L0mol/LNaOH 調(diào)節(jié)pH至6.0。
按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方制備發(fā)酵培養(yǎng)基10 L,實罐滅菌后，接入 400mL種子液，進行發(fā)酵，發(fā)酵條件如下溫度30。C,通風(fēng)量為1.2vvm， 轉(zhuǎn)速250 rpm,發(fā)酵過程中采用1.Omol/L的HC1或者1.0mol/LNaOH控制 pH6.0。發(fā)酵60h。
按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方制備發(fā)酵培養(yǎng)基10 L,裝入15L發(fā)酵罐，121 。C 滅菌20min后。接入種子液500mL,進行菌體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下溫 度30。C,轉(zhuǎn)速250rpm,通風(fēng)量為1.5vvm,培養(yǎng)過程中采用1.Omol/L的 HC1或者1.Omol/L NaOH控制pH為5.0，培養(yǎng)24h。
將上述的含有菌體的培養(yǎng)液9 L裝入無菌的外循環(huán)氣升式生物反應(yīng) 器中，該反應(yīng)器的總?cè)莘e為11.5L,上升管與下降管的直徑比(D/d)為 6.6,罐體高徑比(///D)為2.9,罐內(nèi)可加裝篩板，形成帶篩板的外循環(huán)氣升式生物反應(yīng)器，裝置用不銹鋼制造，通風(fēng)量、溫度可調(diào)節(jié)控制，溶氧
可自動檢測，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。加入45mL甘油。進行游離細(xì)胞生物 催化反應(yīng)，反應(yīng)條件如下通風(fēng)量為2.0 wm，溫度30。C, pH控制在6.5, 1.0mol/L的HC1或者1.0mol/L NaOH控制。反應(yīng)開始流加甘油，流加速 度為50mL/h,流加至總甘油濃度為300g/L。反應(yīng)30h后進行固液分離， 固液分離的方法為將含有菌體細(xì)胞的反應(yīng)液進行在10000r/min條件下， 離心10min。上清液用于提取DHA產(chǎn)品，菌體沉淀用0.5%甘油懸浮，重 新裝入內(nèi)循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器，重復(fù)進行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)條件同上 一批次，連續(xù)反應(yīng)3批次。
然后進行游離細(xì)胞催化活力恢復(fù)，將菌體細(xì)胞和9L無菌的液體培養(yǎng) 基加入到外循環(huán)氣升式生物反應(yīng)器，液體培養(yǎng)基的組成如下甘油30 mL/L,酵母提取粉5g/L,其余為水。游離細(xì)胞活力恢復(fù)培養(yǎng)條件如下 30。C下，通風(fēng)量為1.5vvm,培養(yǎng)24h。
游離細(xì)胞經(jīng)過活力恢復(fù)培養(yǎng)后，再進行游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)，反應(yīng) 操作同上，連續(xù)進行3批次游離細(xì)胞生物催化反應(yīng)。然后再進行游離細(xì)胞 催化活力恢復(fù)，這樣連續(xù)進行5個循環(huán)，共進行15批次游離細(xì)胞生物催 化反應(yīng)生產(chǎn)DHA。將各批次的反應(yīng)液混合，用于提取DHA產(chǎn)品。
收集上述發(fā)酵液1000mL，按實例1步驟進行分離純化，冷凍干燥后 得到200.4 gDHA。
權(quán)利要求
1.一種微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，所述方法包括(1)將氧化葡糖桿菌CCTCC NoM 208069接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在28～32℃、通風(fēng)量0.3～1.5vvm條件下培養(yǎng)24～32h，得到發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下甘露醇40～100g/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～2g/L，溶劑為水，pH4.0～7.0；(2)在以步驟(1)發(fā)酵液中含酶細(xì)胞作為催化劑、以甘油為底物的反應(yīng)體系中，于氣攪拌式生物反應(yīng)器中，在溫度28～32℃、通風(fēng)量0.3～3.0vvm、pH 4.0～7.0條件下進行生物催化反應(yīng)，底物甘油初始濃度為5g/L～30g/L，于反應(yīng)過程中流加甘油使甘油總濃度為200～300g/L，總反應(yīng)時間為24h～96h，得到反應(yīng)液；過濾使含催化劑的濾餅與濾液分離；(3)按照步驟(2)方法重復(fù)進行多批次生物催化反應(yīng)后，對催化劑進行復(fù)活操作將步驟(2)含催化劑的濾餅置于足量的液體培養(yǎng)基中，在28～32℃通風(fēng)量0.3～1.5vvm條件下，培養(yǎng)20～28h；使含酶細(xì)胞復(fù)活，所述液體培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，溶劑為水；(4)取步驟(3)復(fù)活后的含酶細(xì)胞另取甘油重復(fù)步驟(2)、(3)的操作，合并多個批次的反應(yīng)液的濾液，經(jīng)分離純化得到所述二羥基丙酮。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于以所述步驟(2)含酶細(xì)胞經(jīng)固 定化獲得的固定化細(xì)胞作為催化劑。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述固定化細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞復(fù)活方法如下將固定化細(xì)胞加入至液體培養(yǎng)基，在28 32。C通風(fēng)量0.3 1.5 vvm條件下，培養(yǎng)20 28h;所述液體培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油30 mL/L,酵母提取粉5g/L,溶劑為水。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 氧化葡糖桿菌CCTCCNo: M 208069接種至斜面培養(yǎng)基，30。C培 養(yǎng)至長出單菌落，作為斜面種子；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成 如下葡萄糖20g/L,酵母提取粉5g/L,瓊脂20g/L,溶劑為水， pH7.0;(2) 將斜面種子接種至液體種子培養(yǎng)基，30°C、 100 200rpm振蕩培養(yǎng) 24 60h,得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基終濃度組成如下甘 油10 50mL/L,酵母提取粉2~20g/L,蛋白胨l~20g/L ， NaH2PO4.2H2O0.5~2g/L,溶劑為水，pH4.0 7.0;(3) 種子液以1~5%體積比接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度30。C、轉(zhuǎn) 速250 rpm、通風(fēng)量0.3~1.5 vvm、 pH 4.0~7.0條件下培養(yǎng)24~32h, 得到菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下甘露醇40 100 g/L，酵母提取粉2~20 g/L,蛋白胨1 20 g/L， NaH2P04.2H20 0.5~2 g/L,溶劑為水，pH4.0 7.0;(4) 將步驟(3)所述菌懸液，與4%海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻， 將混合液滴在1.0% CaCl2溶液中，靜置12小時，制備得到固定 化細(xì)胞，菌懸液、海藻酸鈉溶液CaCl2溶液體積用量之比為1: 1: 10;(5 )將固定化細(xì)胞裝入氣攪拌式生物反應(yīng)器中，加入5 g/L 30 g/L甘 油水溶液，于溫度30°C 、通風(fēng)量0.3~3.0 vvm、 pH 4.0~7.0條件下 進行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)過程中流加甘油至反應(yīng)體系中甘油總濃 度為200~300g/L,總反應(yīng)時間為24h 96h;(6) 反應(yīng)結(jié)束后，放出反應(yīng)液，往反應(yīng)器中加入甘油水溶液，按照步 驟(5)的操作進行下一批次生物催化反應(yīng)，總計進行3 5個批 次的生物催化反應(yīng)；(7) 對固定化細(xì)胞進行細(xì)胞復(fù)活往反應(yīng)器中加入足量液體培養(yǎng)基， 在28 32。C通風(fēng)量0.3-1.5 wm條件下，培養(yǎng)20~28h;所述液體 培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油30g/L，酵母提取粉5g/L,溶劑為 水；(8) 放出液體培養(yǎng)基，重復(fù)進行步驟(5) (7)的操作1~3次，合 并各批次反應(yīng)液，經(jīng)分離純化得到所述二羥基丙酮。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 氧化葡糖桿菌CCTCCNo: M 208069接種至斜面培養(yǎng)基，3CTC培 養(yǎng)至長出單菌落，作為斜面種子；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成 如下葡萄糖20g/L,酵母提取粉5g/L,瓊脂20g/L,溶劑為水， pH7.0;(2) 將斜面種子接種至液體種子培養(yǎng)基，30°C、 100 200rpm振蕩培養(yǎng) 24 60h,得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基終濃度組成如下甘 油10 50g/L ，酵母提取粉2 20g/L ，蛋白胨l~20g/L , NaH2PO4'2H2O0.5 2g/L,溶劑為水，pH4.0 7.0;(3) 種子液以1~5%體積比接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度30。C、轉(zhuǎn) 速250 rpm、通風(fēng)量0.3-1.5 vvm、 pH 4.0~7.0條件下培養(yǎng)24~32h, 得到菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下甘露醇40-100 g/L,酵母提取粉2 20 g/L,蛋白胨1~20 g/L, NaH2P04'2H20 0.5 2 g/L,溶劑為水，pH4.0 7.0;(4) 將步驟(3)得到的菌懸液移入氣攪拌式生物反應(yīng)器，連續(xù)加入 甘油，甘油總的流加量為使甘油在反應(yīng)體系中總濃度達到200~300g/L，于溫度30。C、通風(fēng)量0.3 3 vvm、 pH4.0 7.0條件 下進行生物催化反應(yīng)，總反應(yīng)時間為24 h ~ 96 h;(5) 反應(yīng)結(jié)束后，放出反應(yīng)液進行固液分離，得到的上清液用于分離 純化二羥基丙酮，菌體重新裝入氣攪拌式生物反應(yīng)器，往反應(yīng)器 中加入甘油水溶液，按照步驟(4)的操作進行下一批次生物催 化反應(yīng)，總計進行3 5個批次的生物催化反應(yīng)；(6) 對游離細(xì)胞進行細(xì)胞復(fù)活反應(yīng)后的菌體細(xì)胞加入液體培養(yǎng)基 中，在28 32。C通風(fēng)量0.3-1.5 vvm條件下，培養(yǎng)20 28h;所述 液體培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油30mL/L,酵母提取粉5g/L, 溶劑為水；(7) 經(jīng)復(fù)活后的菌體細(xì)胞再重復(fù)步驟(4) ~ (6)的操作1 3次，合 并各個批次的上清液，經(jīng)分離純化得到所述二羥基丙酮。
6. 如權(quán)利要求1~5之一所述的方法，其特征在于所述氣攪拌式生物反應(yīng) 器為下列之一氣攪拌鼓泡塔生物反應(yīng)器，外循環(huán)式氣升式生物反應(yīng) 器，內(nèi)循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器。
7. 如權(quán)利要求1 5之一所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下 將反應(yīng)液或上清液濃縮得到濃縮液，濃縮液上層析柱，采用體積比95: 5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動相，使用石油醚濕法裝柱，層析柱 高徑比10 40: 1,洗脫流速lmL/min 10mL/min，加樣體積為柱床體 積的3% 10%;收集含DHA段樣品，進行真空濃縮，于體積比95: 5 的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲得二羥基丙酮結(jié)晶。
8. 氧化葡糖桿菌(G/wco"o&cfer o;^fara) ZJB-605，保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCC No: M 208069，保藏日期2008年05月09日。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，所述方法包括將氧化葡糖桿菌CCTCC NoM 208069接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，以發(fā)酵液中含酶細(xì)胞作為催化劑、以甘油為底物的反應(yīng)體系中進行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述二羥基丙酮；本發(fā)明利用整體細(xì)胞作為生物催化劑，結(jié)合整體細(xì)胞輔酶再生技術(shù)，在氣攪拌式生物反應(yīng)器中生產(chǎn)DHA；具有操作簡單方便、節(jié)能、生產(chǎn)效率高等特點，可適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12P7/28GK101591681SQ200910097379
公開日2009年12月2日 申請日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者胡忠策, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)