專利名稱：一種固定的膽堿酯酶及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種酶產(chǎn)品及其加工和應(yīng)用，具體為一種用水溶性材料 固定的膽堿酯酶及其制備，以及在農(nóng)藥殘留快速檢測或者膽堿酯酶抑制劑的篩選的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膽堿酯酶是人和動物體內(nèi)的重要酶，它包括乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。有機磷、氨 基甲酸酯類農(nóng)藥或毒劑能夠抑制膽堿酯酶的活性。許多生物毒素或者活性成份也抑制膽堿酯 酶活性，能夠應(yīng)用于老年癡呆癥和許多神經(jīng)性疾病的治療。利用膽堿酯酶的抑制作用能夠檢 測食品或環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，也可以用于神經(jīng)性疾病的藥物篩選。
但是膽堿酯酶在體外不容易保存，通常需要冷凍保存，使用前需要溶解分裝，使用很不 方便。各種物理或者化學方法被用于膽堿酯酶的固定，但這些方法往往造成酶活性的損失。 通常的酶固定總是將酶固定在固體材料的內(nèi)部或者表面，酶的反應(yīng)是非均相反應(yīng)，催化效率 低，而且也不便于檢測。此外，常規(guī)酶固定技術(shù)希望通過固定使得酶可以多次使用，固定膽 堿酯酶用于農(nóng)藥檢測卻不適合多次使用，因為待測農(nóng)藥會抑制酶的活性，使得固定化酶只能 一次性使用，即使可以采用某些藥物使膽堿酯酶部分回復(fù)活性，但操作繁瑣，成本高，重現(xiàn) 性也不好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對膽堿酯酶穩(wěn)定性差，固定后酶活性降低，使用時不能進行均相反應(yīng)等問題， 提供一種固定的膽堿酯酶，以及其制備方法。
本發(fā)明的一種固定的膽堿酯酶，其固定膽堿酯酶所用的載體是能夠干燥成膜并在水溶液 中迅速溶解的水溶性材料；所述水溶性材料為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯樹膠；也 包括上述水溶性材料與脂質(zhì)體形成的復(fù)合材料。
本發(fā)明一種固定的膽堿酯酶的制備包括以下步驟
(1) 從動物的離體組織或者體液中提取膽堿酯酶，或直接采用商業(yè)化乙酰膽堿酯酶或丁 酰膽堿酯酶為原料，用保護劑稀釋為所需跨度的膽堿酯酶稀釋液，所用保護劑選用1 10 mg/mL的牛血白蛋白磷酸鹽緩沖液；
(2) 將權(quán)利要求1中所述水溶性材料按照1% 50%的重量體積百分比溶于水，獲水溶 性材料溶液；(3) 將膽堿酯酶稀釋液與水溶性材料溶液按1:4 4:1的體積比混合均勻，獲膽堿酯酶 水溶性材料溶液；
(4) 用滴加或浸泡的方法直接將膽堿酯酶水溶性材料溶液附著到固體材料上，干燥成薄 膜，或滴加到模具中干燥成酶顆粒；所述固體材料為塑料。
步驟(1)所述保護劑中含有重量體積百分比0.1%~1%的硫柳汞。
所述脂質(zhì)體是磷脂或者磷脂與以下物質(zhì)中的一種或多種的混合物膽固醇、十八胺、磷 脂酸和油酸；所述磷脂為卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、豆磷脂二棕櫚酰磷脂、鞘磷 脂或二硬脂酰磷脂酰膽堿。
所述在水溶液中迅速溶解的水溶液是指水，或水與乙醇、丙酮、異辛烷或環(huán)己垸形成的 有機溶劑或這些有機溶劑兩種以上混合的水溶液。
本發(fā)明所述一種固定的膽堿酯酶的應(yīng)用特點是使用時將所述一種固定的膽堿酯酶投入 待測溶液中，直接用于農(nóng)藥和神經(jīng)毒劑的檢測或者用于膽堿酯酶抑制劑的篩選。
采用水溶性材料固定膽堿酯酶，固定膽堿酯酶后干燥成膜，使用時投入溶液中立即溶解 釋放其中的酶分子，在均相中行使催化功能，具有更好的催化效率和抑制靈敏度，應(yīng)用在農(nóng) 藥殘留快速檢測或者膽堿酯酶抑制劑的篩選。
本發(fā)明一種固定的膽堿酯酶的優(yōu)點是
使用時將含酶的水溶膜或塊體投入到可能含有有機磷或者氨基甲酸酯農(nóng)藥的溶液中，加 入酶底物溶液，肉眼觀察或者采用儀器定量。由于水溶性材料在水中快速溶解，釋放出其中 的膽堿酯酶，使得抑制和催化過程都在均相中進行，酶活性增大，抑制靈敏度提高。
由于酶被分散固定在酶膜內(nèi)，使用時不需要稱量、溶解、分裝等步驟。直接將酶膜投入 到檢測液中，使用非常方便。此外，酶膜可以采用真空包裝，直接室溫保存，或者4"C冰箱 冷藏。
具體實施方式
實施例1: (一)乙酰膽堿酯酶固定
(1) 配置10mMpH8磷酸鹽緩沖液j(PBS)。
(2) 將購買的商業(yè)化純乙酰膽堿酯酶用含有1 10 mg/mL的牛血白蛋白磷酸鹽緩沖液 稀釋，濃度為1U/mL。
(3) 稱量聚乙烯吡咯烷酮，溶于水，按重量體積百分比配置1 10%的聚乙烯吡咯垸酮溶液。
(4) 按照l:l體積比混合酶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液，充分混勻。
(5) 吸取60pl滴加到塑料片上干燥成膜。
(二)乙酰膽堿酯酶一聚乙烯吡咯垸酮水溶性酶膜用于有機磷毒劑的檢測
稱取待測蔬菜樣本，按照2ml/g比例用10mMpH8緩沖液振搖50次提取殘留農(nóng)藥。 在離心管內(nèi)放入酶膜，滴加50nl提取液，抑制10分鐘，加入50pl2mg/ml2，6二氯靛酚乙 酸酯溶液(溶劑為含5"/。丙酮的PBS溶液)反應(yīng)5分鐘，通過觀察顏色的變化可以判斷抑制 的程度。藍色越深，說明抑制程度低，有機磷或氨基甲酸酯農(nóng)藥少；藍色越淺，說明抑制程 度高，蔬菜農(nóng)藥殘留量大。
實施例2:
(一) 空白脂質(zhì)體的制備
(1) 配置10mMpH8磷酸鹽緩沖液(PBS)。
(2) 稱取0.^磷脂和0.38膽固醇于501111小燒杯中，加無水乙醇l 2ml，置于65~70
-c水浴中，攪拌使溶解，旋轉(zhuǎn)該小燒杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用氮氣吹干。
(3) 另取PBS30ml于小燒杯中，同置于65 70'C水浴中，保溫，待用。
(4) 取預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液30ml，加至含有磷脂和膽固醇脂質(zhì)膜的小燒杯中，65~70 。C水浴中攪拌水化10min。隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫，攪拌30 60min，如果 溶液體積減少，可補加水至30ml，混勻，即得。
(二) 丁酰膽堿酯酶一脂質(zhì)體膜的固定
(1)將購買的商業(yè)化純丁酰膽堿酯酶用含有1 10 mg/mL的牛血白蛋白磷酸鹽緩沖液 稀釋，濃度為lU/mL,再加入0.01%~1%的硫柳汞。
(2) 將所得脂質(zhì)體溶液50倍稀釋，并和丁酰膽堿酯酶等體積混合。
(3) 稱量聚乙烯醇，溶于水，配置每升含聚乙烯醇200克的20%的溶液。
(4) 按照1:4體積比混合酶液和聚乙烯醇溶液，充分混勻，吸取80 ^滴加到塑料片上 干燥成膜。
(三) 丁酰膽堿酯酶一聚乙烯醇水溶性酶膜用于有機磷毒劑的檢測
稱取待測蔬菜樣本，按照2 ml/g比例用10 mM pH 8緩沖液振搖50次提取殘留農(nóng)藥。 在離心管內(nèi)放入酶膜，滴加50^提取液，抑制10分鐘，加入50 pl2mg/nil靛酚乙酸酯溶液(溶劑為含體積比5Vn丙酮的PBS溶液)反應(yīng)5分鐘，通過觀察顏色的變化可以判斷抑制 的程度。藍色越深，說明抑制程度低，有機磷或氨基甲酸酯農(nóng)藥少；藍色越淺，說明抑制程 度高，蔬菜農(nóng)藥殘留量大。
實施例3:
(一) 蚯蚓中膽堿酯酶的提取
(1) 配置10mMpH8磷酸鹽緩沖液(PBS)。
(2) 新鮮蚯蚓離體組織加入等質(zhì)量PBS勻漿2分鐘，10000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，取上
清液用做膽堿酯酶。
(二) 膽堿酯酶固定
(1)稱量阿拉伯膠，溶于PBS，配置每升含阿拉伯膠400 500克的阿拉伯膠水溶液。
(4)按照4:1體積比混合酶液和阿拉伯膠溶液，充分混勻，吸取200 nl滴加到塑料模具 中干燥成酶顆粒。
(三) 膽堿酯酶水溶性酶顆粒用于氨基甲酸酯農(nóng)藥的檢測
稱取待測蔬菜樣本，按照2 ml/g比例用10 mM pH 8緩沖液振搖50次提取殘留農(nóng)藥， 取880nl提取液，加入酶顆粒，抑制10分鐘，依次加入100nI2.1mM 5， 5'-二硫代-雙-硝 基苯甲酸(DTNB)和100 pl 5mM碘化硫代乙酰膽堿，37'C下反應(yīng)，通過測量410nm處吸光度 的變化速度對氨基甲酸酯農(nóng)藥定量。
權(quán)利要求
1、一種固定的膽堿酯酶，其特征在于其固定膽堿酯酶所用的載體是能夠干燥成膜并在水溶液中迅速溶解的水溶性材料；所述水溶性材料為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯樹膠；也包括上述水溶性材料與脂質(zhì)體形成的復(fù)合材料。
2、 如權(quán)利要求l所述一種固定的膽堿酯酶的制備，其特征在于以下步驟-(1) 從動物的離體組織或者體液中提取膽堿酯酶，或直接采用商業(yè)化乙酰膽堿酯酶或丁 酰膽堿酯酶為原料，用保護劑稀釋為所需濃度的膽堿酯酶稀釋液，所用保護劑選用1 10 mg/mL的牛血白蛋白磷酸鹽緩沖液；(2) 將權(quán)利要求1中所述水溶性材料按照1% 50%的重量體積百分比溶于水，獲水溶 性材料溶液；(3) 將膽堿酯酶稀釋液與水溶性材料溶液按1:4 4:1的體積比混合均勻，獲膽堿酯酶 水溶性材料溶液；(4) 用滴加或浸泡的方法直接將膽堿酯酶水溶性材料溶液附著到固體材料上，干燥成薄 膜，或滴加到模具中干燥成酶顆粒；所述固體材料為塑料。
3、 如權(quán)利要求2所述一種固定的膽堿酯酶的制備，其特征在于步驟(1)所述保護劑 中含有重量體積百分比0.1%~1%的硫柳汞。
4、 如權(quán)利要求1所述一種固定的膽堿酯酶，其特征在于所述在水溶液中迅速溶解的水 溶液是指水，或水與乙醇、丙酮、異辛烷或環(huán)己烷形成的有機溶劑或這些有機溶劑兩種以上 混合的水溶液。
5、 如權(quán)利要求l所述一種固定的膽堿酯酶的應(yīng)用，其特征在于使用時將所述一種固定 的膽堿酯酶投入待測溶液中，直接用于農(nóng)藥和神經(jīng)毒劑的檢測或者用于膽堿酯酶抑制劑的篩 選。
全文摘要
一種固定的膽堿酯酶及其制備和應(yīng)用，其固定所用的載體是能夠干燥成膜并在水溶液中迅速溶解的水溶性材料，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯樹膠；也包括上述水溶性材料與脂質(zhì)體形成的復(fù)合材料。也包括上述水溶性材料與脂質(zhì)體形成的復(fù)合材料。選用1～10mg/mL的牛血白蛋白磷酸鹽緩沖液做保護劑；采用水溶性材料固定膽堿酯酶，用滴加或浸泡的方法直接將膽堿酯酶水溶性材料溶液附著到固體材料上，干燥成薄膜，或滴加到模具中干燥成酶顆粒，使用時投入溶液中立即溶解釋放其中的酶分子，在均相中行使催化功能，具有更好的催化效率和抑制靈敏度，可以應(yīng)用在農(nóng)藥殘留快速檢測或者膽堿酯酶抑制劑的篩選。
文檔編號C12N11/00GK101586100SQ20091009867
公開日2009年11月25日 申請日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者繆煜清, 馬倩倩 申請人:浙江師范大學