專利名稱：基于組織工程方法構(gòu)建新型高效生物催化劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種“基于組織工程方法構(gòu)建新型高效生物催化劑”的新技術(shù)。
背景技術(shù)：
組織工程的概念早在1933年由Biscgelie首次提出，但在60年后的1993年才 由Langer andVacanti在《science》雜志上發(fā)表論文給予明確定義組織工程是多學科交 叉的研究領(lǐng)域，它應用生命科學和工程學原理開發(fā)恢復，保持或改善組織功能的生物替代 品。自此，組織工程才成功地擴展開來，并激勵著科學家和臨床醫(yī)師。它是以解決哺乳動物 組織資源短缺、成本高，以及移植手術(shù)可能出現(xiàn)并發(fā)癥而提出的一項新技術(shù)。15年來，組織 工程已發(fā)展成一門新興學科，其研究涵蓋人體各個組織和器官。它的核心就是體外構(gòu)建細 胞-支架3D (three-dimensional)空間復合體結(jié)構(gòu)的組織工程細胞。如組織工程軟骨、組 織工程皮膚、組織工程干細胞等各種生物替代品用于臨床前植入或修復研究，并最終用于 臨床修復，更換或再生細胞，組織或器官，恢復受損功能。組織工程必需具備三個主要條件支架材料；種子細胞；細胞增殖的體外培養(yǎng)條 件。天然材料如絲素蛋白、膠原、海藻酸、殼聚糖，有機聚合物或共聚物以及無機材料 等已廣泛用于支架材料，并與各種組織或細胞，如骨或骨髓基質(zhì)干細胞，內(nèi)皮細胞，共培養(yǎng) 的成熟內(nèi)皮細胞和初級成骨細胞等，經(jīng)3D培養(yǎng)后分別形成相應的組織工程細胞用于臨床 前實驗研究。PVA能形成良好的凝膠，常用于細胞包埋固定化。其應用中常用的有PVA冷凍法， PVA化學交聯(lián)法，PVA輻射交聯(lián)法，國內(nèi)外在這些方面有大量報道。PVA化學交聯(lián)法和PVA輻 射交聯(lián)法或是容易開聯(lián)，或是對細胞有毒性而在實際應用時受到一定限制。本發(fā)明是PVA 應用的物理方法，即PVA冷凍法，凝膠成型利用PVA在0°C -40°C冷凍適當?shù)臅r間PVA鏈 間的氫鍵和微晶區(qū)形成三維網(wǎng)絡，從而形成物理交聯(lián)的PVA水凝膠，且該凝膠具有一定的 力學強度，常溫下在水中只會溶脹而不會溶解。海藻酸鈉固定化細胞因其操作簡便、細胞毒性較小等優(yōu)點而廣泛應用。但其缺點 是海藻酸鈣在磷酸緩沖液及中不穩(wěn)定，脫鈣使得結(jié)構(gòu)松散而坍塌。本發(fā)明正是利用海藻酸 鈣凝膠對磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑化學侵蝕的敏感性，通過化學侵蝕將已固定化后 含海藻酸鈣凝膠中的海藻酸鹽部分溶解，從而在原來的凝膠中形成空穴，達到致孔的目的， 以提高催化劑進行生物催化反應時原料和產(chǎn)物的傳輸效率。目前，國內(nèi)外仍用傳統(tǒng)包埋法固定化細胞。其形狀常為透鏡狀(傳質(zhì)較好，但細胞 載量低)及球狀(粒徑較大，傳質(zhì)較差，細胞載量較低)。本發(fā)明最后成型的細胞組織工程 凝膠包衣片為藥片狀。包衣前的組織工程細胞采用組織工程方法制備，其技術(shù)成熟，操作簡 便，易得，細胞載量高達80%以上，且內(nèi)部有大量通道供底物和產(chǎn)物進出，從而保證了優(yōu)異 的傳質(zhì)性能，解決了傳統(tǒng)固定化細胞中存在的細胞載量小或傳質(zhì)障礙等技術(shù)難題。用CTAB等透性化劑對微生物細胞進行透性化處理是提高細胞用于生物催化反應時細胞催化能力的有效方法。本發(fā)明先用PVA復合凝膠包衣細胞組織工程片，隨即用磷酸 鹽溶液等進行化學侵蝕使凝膠包衣層中部分海藻酸鈣膠溶解，從而形成微通道以促進小分 子原料和產(chǎn)物在凝膠外衣層中的傳輸；再對其進行透性化處理提高胞內(nèi)酶活性；而常見的 固定化細胞是沒有進行過透性化處理的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種把組織工程和化學技術(shù)相結(jié)合，對體外構(gòu)建的細 胞-支架3D空間復合體結(jié)構(gòu)的組織工程細胞進行包衣、打孔和透性化，制備透性化細胞組 織工程包衣片這種新型高效生物催化劑的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以蠶絲絲素蛋白或以有機聚合物、無機物等制成3D多 孔支架，以酵母細胞或其他細菌、真菌為種子細胞，經(jīng)培養(yǎng)后種植于此支架中進行組織培 養(yǎng)，培養(yǎng)過程因3D多孔支架有大量的空間，利于營養(yǎng)物質(zhì)進入，種植的細胞順利地在3D空 間立體生長、增殖與分化而形成細胞_支架3D空間復合體結(jié)構(gòu)的組織工程細胞片。此片支 架中所有孔道的大部分空間都生長增殖著細胞，但每個孔都留有少部分空間供原料或底物 順利與細胞接觸，產(chǎn)物也可順利輸出。其外部用適當比例的海藻酸鈉和PVA混合液包衣，在 適當濃度的氯化鈣溶液中形成凝膠外衣層，并經(jīng)凍融增加外衣層的機械性能，用適當濃度 的磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑進行化學侵蝕使部分海藻酸鈣凝膠溶解，從而形成微通 道以促進小分子原料和產(chǎn)物在凝膠外衣層中的傳輸。再對其進行透性化處理提高胞內(nèi)酶活 性，以制備細胞載容量高，酶活力強，擴散限制小或無限制，機械強度好而可循環(huán)使用的新 一代細胞組織工程凝膠包衣片這種高效生物催化劑，并以它替代傳統(tǒng)的固定化細胞用于合 成手性醇等重要手性藥物與醫(yī)藥化工中間體。
經(jīng)掃描電鏡拍照，倒置顯微鏡觀察，血細胞計數(shù)法計數(shù)，亞甲藍染色、孔隙率等檢 查，這種新一代高效生物催化劑中的3D支架孔隙率達90%，細胞載量達81%，支架中生長 的細胞邊緣光滑，形狀整齊，體型強壯，成活率100 %，凝膠包衣層具有致密均勻的微孔分布。利用本發(fā)明可獲得透性化組織工程細胞凝膠包衣片，細胞載容量高，通透性好、機 械強度高。在低溫下能長期保存，在生物催化反應中能長期反復使用。這將有利于這種新 型高效生物催化劑在生物催化及生物轉(zhuǎn)化工業(yè)領(lǐng)域中的廣泛應用。具體實施事例實例一取家蠶蠶繭250g去蛹后，在IOOOmL 0. 02M Na2CO3溶液中煮沸20分鐘，絲膠蛋白 充分溶解，用蒸餾水徹底沖洗提取不溶性膠狀絲素蛋白。把提取的絲素蛋白加入到500mL 9. 3MLiBr溶液中，并在攪拌下于60°C保持4小時讓絲素蛋白溶解，形成濃度約20%的絲素 蛋白與鹽的混合液。室溫下，該溶液在IOOOmL蒸餾水中透析3天以除去鹽。在，溫度_5°C 條件下，將透析液離心(轉(zhuǎn)速5000rpm) 2次，每次20分鐘，除去雜質(zhì)和絮狀物，得到 8w/
的絲素蛋白水溶液。儲藏在4°C備用。按每2ml溶液加入4克致孔劑(氯化鈉微晶)的量，在 8wt%的絲素蛋白溶液中 加入粒經(jīng)為106 212 μ m的氯化鈉微晶，混勻后分裝在直徑約IOmm的96孔板中，置于室 溫風干成膠。24小時后，將96孔板浸入蒸餾水中2天，洗凈氯化鈉即成。備用。
種子酵母細胞的培養(yǎng)放大培養(yǎng)基:MY培養(yǎng)基(葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，麥芽汁0.3%。pH 6. 8)。擴大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)一富氏培養(yǎng)一巴氏培養(yǎng)細胞接種并培養(yǎng)將支架浸泡在麥芽汁中并過夜，第二天取出支架后，再將巴氏瓶 中的酵母細胞接種到支架上，接種細胞量為2X IO6Cells/支架。在20°C水浴搖床上，輕微 振蕩Ih后，將其移入96孔培養(yǎng)板中，再置于培養(yǎng)箱中在20°C靜置培養(yǎng)4天，每日早晚翻動
一次。組織工程細胞凝膠包衣片的制備取PVA、海藻酸鈉加熱配置成濃度分別為10. 0%和1. 5%的混合液200ml。初步膠化定型將制得的混合液滴于96孔板中的細胞片表面，隨后此板放入包衣 機中開冷風吹30分鐘至表面膠化；翻轉(zhuǎn)96孔板中的細胞片，在其表面再滴上上述混合液后 放入包衣機中開冷風吹30分鐘至表面膠化。二次膠化將初步凝膠包衣片從96孔板中取出，于0. 2mol/L CaCl2溶液中攪拌20 分鐘。然后用蒸餾水洗凈片表面的CaCl2。凍融二次膠化的凝膠包衣片經(jīng)(-20°C ) 1個循環(huán)(12小時)凍融5次，增加PVA 外衣層的機械強度。凝膠層打孔把凍融后的凝膠包衣片放入IOOml 0. IM磷酸鹽溶液中振蕩40分鐘 進行化學侵蝕，使部分海藻酸鈣凝膠溶解，從而形成微通道以促進小分子原料和產(chǎn)物在凝 膠外衣層中的傳輸。透性化組織工程細胞凝膠包衣片的制備將組織工程細胞凝膠包衣片轉(zhuǎn)入0. IM磷酸鈉(NaPi) pH7. 0的緩沖液中，膨化后， 溶液換成0.05M磷酸鈉緩沖液。取出膨化后的組織工程細胞凝膠包衣片，再浸入IOOml 0. 1 % CTAB, 0. IM NaPi (pH7. 0)緩沖溶液于24°C保持30分鐘，過濾并用重蒸水洗凈，收集得 透性化細胞組織工程凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑。用于催化合成手性醇。實例二將聚乳酸IOOg溶解于200ml氯仿溶液中，加入粒徑為206 310 μ m氯化鈉微晶 160g并混合均勻，按照每孔Iml裝于直徑約IOmm的96孔板中，風干揮去氯仿成膠。24小 時后，將96孔板浸入蒸餾水中2天，洗凈氯化鈉即成。備用。以短小芽孢桿菌為種子細胞。菌株在含有LB瓊脂培養(yǎng)基的平板上生長5天。之 后接種到已在M9培養(yǎng)基中浸泡過夜的支架上，接種細胞量為IX IO6Cells/支架/孔。置 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。取一定量的PVA和海藻酸鈉加熱至完全溶解，制成含15. 0% PVA和2. 0%海藻酸 鈉的混合液200ml。冷至室溫。將制得的混合液滴于96孔板中的細胞片表面，隨后此板放 入包衣機中開冷風吹20分鐘至表面膠化；翻轉(zhuǎn)96孔板中的細胞片，在其表面再滴上上述混 合液后放入包衣機中開冷風吹20分鐘至表面膠化。將初步凝膠包衣片從96孔板中取出，于0. 5mol/L CaCl2溶液中攪拌20分鐘。然 后用蒸餾水洗凈片表面的CaCl2。在_30°C凍融5次，每次12小時，增加PVA外衣層的機械強度。
把凍融后的凝膠包衣片放入100ml pH7. 0磷酸鹽溶液中振蕩40分鐘進行化學侵 蝕，使部分海藻酸鈣凝膠溶解，從而形成微通道。將已形成微通道的組織工程細胞凝膠包衣片浸入IOOml 0. 2 % CTAB, 0. IM磷酸鈉 (NaPi) pH7. 0緩沖溶液于24°C保持30分鐘，過濾并用重蒸水洗凈，收集得透性化細胞組織 工程凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑。 用于催化合成手性醇。
權(quán)利要求
基于組織工程方法構(gòu)建新型高效生物催化劑，其主要步驟為a)三維多孔支架的制備用適當溶劑將組織工程支架材料和適量致孔劑微晶(水溶性無機鹽)制成均勻的混合物，加入到多孔培養(yǎng)板中，風干成膠后，用去離子水浸出微晶制成直徑5～10mm、厚度3～6mm的三維多孔支架。b)細胞接種于三維多孔支架培養(yǎng)先將上述支架浸泡于一定濃度培養(yǎng)基或麥芽汁中并過夜。將種子細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)后按一定量接種到支架上，置于1～50℃水浴搖床輕微振蕩1～200分鐘后，將其移入多孔培養(yǎng)板中，再置于培養(yǎng)箱中在4℃～40℃培養(yǎng)1～10天，制得組織工程細胞片。c)對組織工程細胞片進行凝膠包衣取一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉加熱至完全溶解，制成PVA和海藻酸鈉的混合液。冷至室溫。將制得的混合液滴于多孔板中的組織工程細胞片表面，放入包衣機中冷風吹5～120分鐘至表面膠化；翻轉(zhuǎn)組織工程細胞片后，再在其表面再滴上上述混合液，放入包衣機中開冷風吹5～120分鐘至表面膠化。將凝膠包衣片從多孔板中取出，放入一定濃度CaCl2溶液中攪拌3～180分鐘。洗凈表面的CaCl2。反復凍融，增加包衣層機械強度。制得組織工程細胞凝膠包衣片。d)凝膠包衣層脫鈣致孔把組織工程細胞凝膠包衣片放在一定濃度磷酸鹽或檸檬酸或EDTA溶液中振蕩一定時間，使凝膠層中的海藻酸鈣溶解形成微孔通道，便于物質(zhì)傳輸。e)透性化將上述形成微孔通道后的組織工程細胞凝膠包衣片，放在十六烷基三甲基溴化銨溶液(CTAB)或甲苯或乙醇混合溶劑中，在4～40℃處理2～120分鐘，使細胞透性化，增加凝膠包衣片中細胞的酶活性。制得透性化組織工程細胞凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑。液體環(huán)境所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；所述海藻酸鈉濃度在0.01％～6％(W/V)；所述CaCl2溶液濃度在0.1％～20％(W/V)；所述的磷酸鹽或檸檬酸或EDTA濃度為0.01～1mol/L；透性化處理所用CTAB或甲苯或乙醇混合溶劑溶液為0.01％到8％；透性化時間為1～60分鐘。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a)中所述的組織工程支架材料為天然 材料如絲素蛋白、膠原蛋白、明膠、海藻酸(鹽)、殼聚糖、瓊脂糖等，人工合成材料如脂肪族 聚酯、聚酸酐、聚乳酸等共聚物以及無機材料如羥基磷灰石等；所用溶劑為水、酸溶液、堿溶 液、有機溶劑；致孔劑微晶采用粒徑50 1000微米氯化鈉等水溶性無機鹽，其用量為組 織工程支架材料無機鹽=1 1 1 10。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b)中所述細胞為酵母或其它真菌細 胞，或細菌和基因工程改造過的微生物細胞等，質(zhì)量分數(shù)2% 80%。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟c)中所述的凍融條件為-80°C 0°C， 1 10次，每次1 24小時。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟d)中在磷酸鹽或檸檬酸或EDTA溶液 中振蕩，凝膠層打孔1 80分鐘。利用凝膠層海藻酸鈣對磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑 化學侵蝕的敏感性，通過化學侵蝕將細胞支架片上凝膠中的藻酸鹽部分溶解，從而形成空 穴，以提高在用生物催化劑催化劑進行生物催化反應時原料和產(chǎn)物的傳輸效率。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟e)中，用CTAB、甲苯或乙醇混合溶劑 進行透性化處理，從而提高細胞內(nèi)的酶活性。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用后的支架，經(jīng)過去掉包衣層，洗凈細胞 后，可以再經(jīng)過要求1中所述的步驟從b)、c)、d)到e)所述處理，重復應用。
全文摘要
通過結(jié)合組織工程與化學技術(shù)，制備新型高效生物催化劑的新方法。該法選用微生物為種子細胞擴大培養(yǎng)后接種于支架材料上再經(jīng)組織培養(yǎng)，制成細胞-支架三維空間復合體結(jié)構(gòu)的組織工程細胞片，其細胞載量達80％以上，且支架中仍有足夠通道供底物或產(chǎn)物進出；此片經(jīng)聚乙烯醇/海藻酸鈉包衣、在氯化鈣溶液中成型、凍融成凝膠包衣片；包衣層中的海藻酸鈣膠在磷酸鹽中部分溶解形成微通道利于小分子傳遞；然后透性化處理提高凝膠包衣片中細胞胞內(nèi)酶活性。從而構(gòu)建細胞載量高、催化效力強、擴散限制小、機械強度好的透性化組織工程細胞凝膠包衣片這種新型高效生物催化劑，并以此替代傳統(tǒng)固定化細胞用于生物催化制備手性醇等重要手性藥物與醫(yī)藥化工中間體。
文檔編號C12N11/04GK101824407SQ20091010331
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者于明安, 侯毅, 黎剛 申請人:重慶醫(yī)科大學