專利名稱：一種無假陽性t載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明內(nèi)容屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種T載體及制備。
背景技術(shù)：
1、 質(zhì)粒載體
分子克隆技術(shù)是基因工程技術(shù)的基礎(chǔ)。分子克隆技術(shù)用于將一段目的基因(DNA片段) 插入一個(gè)DNA載體中以長期保存和大量制備該目的基因供進(jìn)行后續(xù)研究。最常用的分子克 隆載體是質(zhì)粒載體 一個(gè)能在細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制、傳代的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。 一個(gè)用 于分子克隆的質(zhì)粒載體至少要包含如下3個(gè)功能單元質(zhì)粒自主復(fù)制必須的基因元件，1-2 個(gè)抗生素抗性基因，供插入目的DNA片段用的酶切位點(diǎn)?，F(xiàn)代正篩選質(zhì)粒載體還包括一個(gè) 用于正篩選陽性克隆的篩選標(biāo)記基因(如利用a互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白斑篩選的P半乳糖苷酶a 片段基因)。
2、 T-A克隆技術(shù)和T載體
PCR技術(shù)產(chǎn)生以后已經(jīng)成為最常用的獲取目的基因的技術(shù)，最初克隆PCR片段的方法是 通過PCR引物在擴(kuò)增的DNA片段兩端引入與克隆載體匹配的酶切位點(diǎn)，然后酶切PCR產(chǎn)物， 通過連接酶將其插入同樣酶切的克隆載體中。后來又發(fā)展出能更快捷克隆PCR片段的T-A克
隆技術(shù)。
T-A克隆技術(shù)的原理是PCR反應(yīng)中普通T呵酶能在擴(kuò)增的DNA片段的3'端添加一個(gè)突 出的dA，因此如果線性化的載體的3'端具有一個(gè)突出的dT，則與PCR片段形成互補(bǔ)的粘性 末端，二者就能夠高效連接從而獲得包含目的PCR片段的重組質(zhì)粒，這一技術(shù)即為T-A克隆 技術(shù)。目前常用的T載體制備方法有兩種
(l)平末端加T法在普通克隆載體(即前T載體，如pUC18)的陽性克隆正篩選標(biāo)記基 因(如pUC18中的LacZ基因)編碼區(qū)內(nèi)部通過平末端內(nèi)切酶(如pUC18中的Sma I)將前 T載體酶切線性化，再利用r叫酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性在只有dTTP存在的條件下在線性化后的 平末端載體分子的3，端加上l個(gè)dT，制備成T載體。
(2)雙位點(diǎn)酶切直接制備法在陽性篩選標(biāo)記基因內(nèi)引入兩個(gè)串聯(lián)的、切開后能在線性化 載體的兩個(gè)3'端突出一個(gè)dT的同一內(nèi)切酶位點(diǎn)(如XcmI)即構(gòu)成前T載體，這種前T載體只需用相應(yīng)內(nèi)切酶切丌前T載體，純化回收載體片段即可制備T載體。
T載體是T-A克隆技術(shù)的核心，現(xiàn)在有很多試劑生產(chǎn)商制造、銷售商品化的T載體。與
需要酶切后再連接的傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)相比，T-A克隆技術(shù)極大地簡化了克隆目的基因的過
程，而且方便目的基因的序列測定和通過酶切進(jìn)行亞克隆(以便進(jìn)行目的基因的表達(dá))，現(xiàn)在
己經(jīng)成為分子克隆的常規(guī)技術(shù)。 3、現(xiàn)有T載體的技術(shù)機(jī)制缺陷
T-A克隆技術(shù)提供了將PCR片段高效連接插入載體的捷徑，但是現(xiàn)有T載體由于設(shè)計(jì)上 的技術(shù)機(jī)制缺陷，其應(yīng)用于T-A克隆時(shí)在陽性克隆篩選環(huán)節(jié)仍然存在較大的問題，即假陽性 問題，并因此給使用者的克隆實(shí)驗(yàn)帶來很大的困難。
現(xiàn)有T載體大多是利用a互補(bǔ)原理的藍(lán)白斑篩選技術(shù)來篩選陽性克隆的載體上有p半 乳糖苷酶的a片段(LacZ)表達(dá)盒，PCR片段的插入位點(diǎn)就設(shè)計(jì)在a片段的編碼區(qū)內(nèi)部(靠 近N端)。因此當(dāng)目的片段插入T載體后，a片段的讀碼框被打斷，因而不能正確表達(dá)(插入 失活)，含有重組載體的陽性轉(zhuǎn)化子在含有誘導(dǎo)劑IPTG和顯色底物X-gal的篩選培養(yǎng)基上生 長的菌落為白色；反之，含非重組載體(即前T載體)的陰性轉(zhuǎn)化子會(huì)由于a片段的表達(dá)在上 述篩選培養(yǎng)基上長成藍(lán)色菌落。因此，利用這一正篩選技術(shù)，只需要將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在篩選培養(yǎng) 基上培養(yǎng)就可通過菌落顏色篩選出陽性克隆。
然而現(xiàn)有T載體在實(shí)際應(yīng)用時(shí)長出的白色菌落中有一部分并不含有插入片段(即所謂假 陽性克隆)。那么這些假陽性克隆是如何產(chǎn)生的呢？
1) 平末端加T制備的T載體
這種T載體是在前T載體的陽性克隆篩選標(biāo)記基因內(nèi)的平末端酶切位點(diǎn)將其酶切線性化 后在兩個(gè)3'端額外添加了一個(gè)dT，因此，如果在T-A克隆中線性化T載體分子自連(又稱 誤連，mis-ligation，即非互補(bǔ)粘性末端的連接)，其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后這個(gè)不互補(bǔ)的dT—dT 堿基對(duì)會(huì)經(jīng)宿主細(xì)胞修復(fù)為互補(bǔ)的dT—dA堿基對(duì)，于是是a片段的編碼區(qū)內(nèi)在此處多出了 l個(gè)bp，這毫無疑問將使其后面的讀碼框(ORF)完全改變(稱為移碼，frame shift),其后 果是a片段不能正確表達(dá)，轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后不能完成a互補(bǔ)，與有PCR片段插入的陽性克 隆一樣呈現(xiàn)為白色菌落，成為假陽性克隆。
2) 雙位點(diǎn)酶切直接制備的T載體
這種方法制備的T載體經(jīng)過前T載體中兩個(gè)酶切位點(diǎn)及其間隔序列的精確設(shè)計(jì)可以避免 T載體因自連后陽性篩選基因移碼而產(chǎn)生假陽性克隆。但是，這種方法制備T載體時(shí)，前T 載體酶切后還會(huì)產(chǎn)生一個(gè)位于兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的小片段，如果回收的T載體(大片段)中
4這個(gè)小片段去除不徹底，在T-A克隆中該小片段在就會(huì)重新連接入載體大片段(因?yàn)樗鼈兙?有互補(bǔ)的粘性末端)，而且可以以正反兩種方向重新連接，以反方向重新連接的載體中陽性克 隆篩選基因的的ORF的改變就可能破壞其功能從而形成假陽性克隆。實(shí)際生產(chǎn)中要100%去 除該小片段是很困難的，因此使用這種T載體時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽性克隆。
兩個(gè)3'端都具有1個(gè)突出的dT的線性化T載體分子的自連是較困難的，因?yàn)樗鼈兊膬蓚€(gè) 粘性末端是非互補(bǔ)的，但這種T載體分子自連在實(shí)際中確實(shí)會(huì)發(fā)生并導(dǎo)致假陽性克隆的產(chǎn)生。 當(dāng)然這種自連的效率不高，這也與實(shí)際情況相符市售的現(xiàn)有各種T載體使用中假陽性克隆 率通常在20%左右。雖然20%的假陽性率看似不高，但使用者需要的必須是含有目的片段的 真陽性克隆!所以人們使用傳統(tǒng)T載體時(shí)不得不在藍(lán)白斑篩選后對(duì)白色菌落再次進(jìn)行篩選(如 菌落PCR篩選)以獲得真正的陽性克隆，顯然這既增加了實(shí)驗(yàn)操作步驟又增加了實(shí)驗(yàn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種無假陽性T載體。
1、 本發(fā)明設(shè)計(jì)的T載體具有下述區(qū)別于現(xiàn)有T載體的技術(shù)特征，并以此避免其用于T-A 克隆時(shí)因載體自連導(dǎo)致的陽性克隆篩選基因移碼而產(chǎn)生假陽性克隆所述T載體供插入PCR 片段的位點(diǎn)(即線性化T載體的兩個(gè)末端)位于陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子與其上游 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)之間。而現(xiàn)有T載體供插入PCR片段的位點(diǎn)均位于陽性克隆篩選 標(biāo)記基因編碼區(qū)內(nèi)部(即陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子下游)。
本發(fā)明的理論基礎(chǔ)是原核基因表達(dá)的效率與目的基因起始密碼子到其上游的RBS之間 的距離D (單位為bp)高度相關(guān)。雖然不同的原核啟動(dòng)子之間的D不盡相同，但通常D在8 土3bp范圍內(nèi)時(shí)目的基因才能高效表達(dá)，超過這個(gè)距離則表達(dá)效率急劇下降，當(dāng)D超過20bp 后則目的基因完全不表達(dá)。需要克隆的PCR片段最短也在50 bp以上(因?yàn)橥ǔ蓚€(gè)PCR引 物加起來的長度就有50 bp 了 )，因此PCR片段插入這一位點(diǎn)將使重組載體的D遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過20 bp。根據(jù)上述理論，這必將導(dǎo)致陽性克隆篩選標(biāo)記基因無法表達(dá)從而與陰性克隆(不含插入 片段的克隆)區(qū)別開來，達(dá)到篩選的目的。
同時(shí)，插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)在RBS與篩選標(biāo)記基因的起始密碼子之間時(shí)，當(dāng)T載體發(fā)生自連時(shí)， 只是使自連后載體的D增加1個(gè)bp，還在8士3bp范圍以內(nèi)，對(duì)篩選標(biāo)記基因的表達(dá)沒有任 何影響，更不會(huì)影響篩選標(biāo)記基因的的ORF，因此其轉(zhuǎn)化子將呈現(xiàn)為陰性克隆而不是假陽性 克隆。
2、 本發(fā)明通過設(shè)計(jì)所述T載體的前T載體而實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)一在通用克隆載體(如pUC18)的陽性克隆篩選標(biāo)記基因(如pUC18中的LacZ) 起始密碼子與其上游的RBS之間通過定點(diǎn)突變引入一個(gè)單一的平末端酶切位點(diǎn)(如EcoRV) 即構(gòu)成所需前T載體。用相應(yīng)內(nèi)切酶(如EcoRV)在該位點(diǎn)切開前T載體，然后用7i^DNA 聚合酶在只有dTTP為底物的條件下在線性化DNA的兩個(gè)3'端添加一個(gè)dT，即可制備本發(fā) 明所述無假陽性T載體。
設(shè)計(jì)二設(shè)計(jì)、合成一段含有兩個(gè)串聯(lián)的、有一定間隔的Xcm I內(nèi)切酶位點(diǎn)的DNA片 段，該片段的序列滿足下述設(shè)計(jì)要求上游Xcm I位點(diǎn)序列中的第八個(gè)核苷酸設(shè)計(jì)為T，且 在這個(gè)T的上游、盡量接近這個(gè)T設(shè)計(jì)一個(gè)RBS序歹U;下游Xcm I位點(diǎn)序列中的第八個(gè)核苷 酸設(shè)計(jì)為A，且在這個(gè)A的上游、盡量接近這個(gè)A (可以包含這個(gè)A)設(shè)計(jì)一個(gè)RBS序列； 上游Xcm I位點(diǎn)序列的后八個(gè)核苷酸序列是下游Xcm I位點(diǎn)序列的前八個(gè)核苷酸序列的反向 互補(bǔ)序列。將這一合成片段引入通用克隆載體(如pUC18)的陽性克隆篩選標(biāo)記基因(如pUC18 中的LacZ)起始密碼子與其上游的啟動(dòng)子之間、且下游XcmI位點(diǎn)序列中的重建的RBS與 陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子之間的距離不超過11個(gè)bp即可構(gòu)成所述前T載體。用Xcm 1在這兩個(gè)位點(diǎn)切開前T載體，純化回收線性化的載體大片段即可制備本發(fā)明所述無假陽性T 載體。
由丁所述前T載體中這一合成片段的上述特殊設(shè)計(jì)，所制備的T載體緊鄰插入位點(diǎn)的上 游為RBS，而緊鄰插入位點(diǎn)的下游為陽性克隆篩選基因的起始密碼子。因此，目的PCR片段 插入這一位點(diǎn)將導(dǎo)致陽性克隆篩選標(biāo)記基因無法表達(dá)而形成陽性克??；而如果T載體自連， 則陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子與上游RBS的距離不超過ll bp，其轉(zhuǎn)化子將形成陰性 克隆。此外，由于兩個(gè)XcmI中包含RBS位點(diǎn)的序列的反向互補(bǔ)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)，使得酶切制備T 載體時(shí)殘留的酶切小片段無論以原方向或相反方向重新連接入T載體中，在陽性克隆篩選標(biāo) 記基因的起始密碼子上游llbp內(nèi)都具有一個(gè)RBS，陽性克隆篩選標(biāo)記基因的表達(dá)不受影響， 其轉(zhuǎn)化子總是呈現(xiàn)為陰性克隆而非假陽性克隆。
本發(fā)明設(shè)計(jì)、制備的T載體在用于克隆PCR片段時(shí)，(l)平末端加T法制備的T載體不 會(huì)因?yàn)門載體自連導(dǎo)致的陽性克隆篩選標(biāo)記基因移碼而產(chǎn)生假陽性克?。?2)雙位點(diǎn)酶切直 接制備的T載體不會(huì)因殘留的前T載體酶切小片段反向插入而產(chǎn)生假陽性克隆。本發(fā)明所述 T載體以其對(duì)插入位點(diǎn)的創(chuàng)新設(shè)計(jì)克服了現(xiàn)有T載體在應(yīng)用中產(chǎn)生假陽性克隆的技術(shù)機(jī)制缺 陷。因此，從技術(shù)機(jī)制上說(即排除其它具有共性的實(shí)驗(yàn)因素的干擾)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的T載體 應(yīng)用于T-A克隆時(shí)不會(huì)產(chǎn)生假陽性克隆。


附圖僅為載體的結(jié)構(gòu)示意圖，因此各部分并不與實(shí)際載體中相應(yīng)DNA片段的大小成比例。
圖1為本發(fā)明設(shè)計(jì)的T載體的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為現(xiàn)有T載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中3'dT表示線性化T載體的兩個(gè)末端所帶有的3'端突出的一個(gè)dT，這兩個(gè)末端供與 3'端突出一個(gè)dA的目的PCR片段通過互補(bǔ)粘性末端連接而形成閉合環(huán)狀的重組質(zhì)粒。
圖中的直線表示間隔序列；ori表示質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；R表示抗生素抗性基因；空心箭頭S 表示陽性克隆篩選標(biāo)記基因編碼區(qū)，箭頭的方向?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄、表達(dá)的方向；RBS表示陽性克隆 篩選標(biāo)記基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
圖2中的空心箭頭S被分為兩個(gè)部分，表示線性化T載體的兩個(gè)末端位于陽性克隆篩選 標(biāo)記基因編碼區(qū)內(nèi)部。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施方式一無假陽性T載體的前T載體pUC-EcoR V的構(gòu)建和T載體制備
以通用質(zhì)粒載體pUC18為出發(fā)載體，按如下步驟和方法實(shí)施
1 、 前T載體pUC-EcoR V的構(gòu)建
用市售QuikChange site-directed mutagenesis kit試齊U盒(Strategene公司產(chǎn)品)并按照 其產(chǎn)品說明書所述方法定點(diǎn)突變pUC18中LacZ基因起始密碼子和其上游的RBS之間的間隔 序列"AACAGCT"。通過設(shè)計(jì)致突變引物突變其中3個(gè)堿基，突變后的這一段間隔序列為 "SA1AI^T"(加粗的堿基指突變的堿基，下劃線所示序列為突變后產(chǎn)生的單酶切位點(diǎn)EcoR V)。突變后的質(zhì)粒即為所述前T載體pUC-EcoRV，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入DH5a中增殖和保藏。
2、 T載體的制備
(1) 用EcoR V酶切1 一2ug的pUC-EcoRV質(zhì)粒，酶切反應(yīng)按EcoR V供應(yīng)商的說 明書進(jìn)行，酶切反應(yīng)結(jié)束后取1/50反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、觀察，以 確認(rèn)pUC-EcoRV已徹底線性化，否則延長酶切反應(yīng)時(shí)間。
(2) 酶切反應(yīng)產(chǎn)物中在加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，用振蕩器充分混勻； 12000 rpm離心10分鐘，吸取上層水相入另一微量試管中；加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH5.2)，混勻后加入2.5倍體積的冰凍無水乙醇，混勻后置-20 'C1小時(shí)；4'C、 12000 rpm離心10分鐘，棄上清，用預(yù)冷的70%的乙醇lml 洗滌DNA沉淀，棄上清；待試管中殘留的乙醇揮發(fā)完后用適量TE (pH8.0) 或超純水溶解DNA。
(3) 在PCR管中加入上一步純化的線性化質(zhì)粒DNA lug， 10X Taq Polymerase Buffer (Mg2+free) 5ul， MgCl2 (2.5mM) 5ul， dTTP (100 mM) lul，超純水X ul 至反應(yīng)總體積為50ul，最后加入Taq Polymerase 1-2 U;置PCR儀中72"溫育 2小時(shí)。
(4) 按步驟(2)中的方法純化回收加T反應(yīng)后的DNA (最后溶解DNA沉淀時(shí)根 據(jù)估計(jì)的回收率確定溶液體積，使DNA濃度大約為50ng / ul)，即為可供用 于T-A克隆的無假陽性T載體pPosi-T。
3、 無假陽性性能驗(yàn)證
(1) 用50ngT載體進(jìn)行自身連接反應(yīng)，連接反應(yīng)按T4-DNA連接酶供應(yīng)商的產(chǎn)品 說明進(jìn)行(連接反應(yīng)體系體積控制在20ul以內(nèi))。
(2) 按常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)化方法用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，取復(fù)蘇后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 200ul涂布于含IPTG和X-gal的LB-Amp平板上，37'C過夜培養(yǎng)至菌落大小 為0.5-lmm,置4'C 2小時(shí)后觀察菌落顏色。排除IPTG和X-gal涂布不均的 影響，所有長出的菌落(不包括后長出的衛(wèi)星菌落)應(yīng)該為藍(lán)色(即無白色 菌落)，證明pPosi-T在進(jìn)行T-A克隆時(shí)不會(huì)因T載體自連而形成假陽性克隆。
4、 T-A克隆性能驗(yàn)證
(1) T-A克隆:用步驟2制備的pPosi-T按常規(guī)T-A克隆方法克隆一特定PCR片段
(長度在1000 bp左右為佳)。用于克隆的PCR片段末端必須帶突出的3'-dA， 且經(jīng)過凝膠電泳純化回收，連接反應(yīng)中PCR片段與pPosi-T的摩爾比為3-7: 1。按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)。
(2) 菌落PCR鑒定白色菌落的陽性率a.隨機(jī)挑取N個(gè)白色轉(zhuǎn)化子菌落分別接種 于5ml液體LB-Amp培養(yǎng)基過夜培養(yǎng);分別取各管過夜培養(yǎng)物10—20ul， 10000 rpm離心2分鐘，棄上清液，加入20ul超純水重懸細(xì)菌，10(TC煮沸10分鐘， 10000 rpm離心2分鐘，取上清液2 — 5ul為PCR反應(yīng)模版。b.用所克隆PCR 片段的特異引物對(duì)上一步制備的各樣本模版DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(最好設(shè)陰 性和陽性對(duì)照)，PCR反應(yīng)體系按Taq Polymerase供應(yīng)商的說明書組成。擴(kuò)增出目的條帶的菌落為真陽性菌落，否則為假陽性菌落。擴(kuò)增出目的條帶的菌 落數(shù)X除以鑒定的總菌落數(shù)N即為真陽性率。
(3) 可以用市售傳統(tǒng)藍(lán)白斑篩選T載體平行進(jìn)行T-A克隆實(shí)驗(yàn)，以比較二者白色 菌落的真陽性率。
實(shí)施方式二無假陽性T載體的前T載體pUC-Xcm I的構(gòu)建和T載體制備
以實(shí)施方式一中構(gòu)建的前T載體pUC-EcoR V為出發(fā)載體按如下步驟和方法實(shí)施 1 、 前T載體pUC-Xcm I的構(gòu)建 1)設(shè)計(jì)一段寡核苷酸序列，該序列必須滿足下述設(shè)計(jì)要求
(1) 該片段包含兩個(gè)有間隔的、串聯(lián)的Xcm I內(nèi)切酶位點(diǎn)。Xcm I的識(shí)別序列為 CCANNNN]^NNNNTGG， N可以是A或T或G或C，下劃線所示第八個(gè)核苷 酸為該酶切位點(diǎn)的切點(diǎn)前的最后一個(gè)核苷酸，其在酶切后成為突出的3'粘性末 端。
(2) 上游XcmI位點(diǎn)序列中的第八個(gè)核苷酸設(shè)計(jì)為T，且在這個(gè)T的上游、盡量接 近這個(gè)T設(shè)計(jì)一個(gè)RBS位點(diǎn)序列AGGA。
(3) 下游Xcm I位點(diǎn)序列中的第八個(gè)核苷酸設(shè)計(jì)為A，且在這個(gè)A的上游、盡量 接近這個(gè)A設(shè)計(jì)一個(gè)RBS位點(diǎn)序列AGGA。
(4) 在這兩個(gè)Xcm I位點(diǎn)序列之間設(shè)計(jì)一段短間隔序列，其中不能含有Xcm I、 EcoRV或EcoRI位點(diǎn)。
(5) 上游Xcm I位點(diǎn)序列的后八個(gè)核苷酸序列是下游Xcm I位點(diǎn)序列的前八個(gè)核苷 酸序列的反向互補(bǔ)序列。
(6) 在下游Xcm I位點(diǎn)序列后間隔1 一2個(gè)核苷酸，然后為pUC-EcoR V中LacZ 基因編碼序列起始密碼子ATG至其后的EcoR I位點(diǎn)的序列(即 ATGACCATGATTACGAATTC)，在EcoRI位點(diǎn)下游(3'端)設(shè)計(jì)數(shù)個(gè)保護(hù)核 苷酸。
(7) 在上游Xcm I位點(diǎn)的上游(5'端)設(shè)計(jì)一個(gè)EcoR V位點(diǎn)及數(shù)個(gè)保護(hù)核苷酸。 滿足上述設(shè)計(jì)要求的寡核苷酸序列模式如
Nn^￡^IgCC4^Ga4|lI￡￡nSgNn￡CiU^4dMVAWrGGNNATGACCATGATTACSA^I￡ Nn3，NnMJMeCC4^^QCmSeNn0^kS^W層rGGNNATGACCATGATTACaMEm
Nn3，
該序列模式中斜體字母序列為兩個(gè)Xcm I位點(diǎn)序列，其中加粗的T和A為這兩個(gè)酶 切位點(diǎn)的切點(diǎn)前最后一個(gè)核苷酸；帶方框的兩段序列為重建的RBS;兩段波浪線所示序
列為反向重復(fù)序列，二者之間的Nn表示可任意設(shè)計(jì)的序列，但長度不宜過長；下畫線所
示序列為EcoR V和EcoR I位點(diǎn)序列，其外側(cè)的Nn為數(shù)目和序列不定的保護(hù)核苷酸(一 般為4個(gè)核苷酸)，這兩個(gè)酶切位點(diǎn)供切開該合成DNA片段并將其定向插入出發(fā)載體 pUC-EcoRV的相應(yīng)位點(diǎn)之間。
2)合成按上述模式設(shè)計(jì)的寡核苷酸單鏈及其互補(bǔ)鏈，兩條合成的寡核苷酸單鏈經(jīng)變性、 退火后即形成雙鏈DNA片段。
3 )用EcoR V和EcoR I雙酶切上述雙鏈DNA片段1 —2 ug，凝膠電泳分離、回收酶切 后的雙鏈片段，并與同樣雙酶切后經(jīng)凝膠電泳回收的pUC-EcoR V載體大片段連接(片 段與載體的摩爾比為10:1)。酶切反應(yīng)、膠回收和連接反應(yīng)均按相應(yīng)產(chǎn)品供應(yīng)商的使用 說明書進(jìn)行。
4)連接反應(yīng)產(chǎn)物按常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，所獲得的質(zhì)粒即為前T載體 pUC-Xcml。
2、 T載體的制備
用Xcm I酶切1 一2 ug pUC-Xcm I質(zhì)粒DNA'凝膠電泳分離、回收酶切后的線性化 T載體片段(大片段)即可制備所述無假陽性T載體。也可以按常規(guī)的酚:氯仿抽提、無 水乙醇沉淀方法回收酶切后的線性化T載體，但這樣制備的T載體與膠回收制備的T載 體相比，使用時(shí)陰性背景克隆比例較高。
3、 無假陽性性能驗(yàn)證和T-A克隆性能驗(yàn)證方法與實(shí)施方式一中相應(yīng)的方法相同。
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權(quán)利要求
1、一種無假陽性T載體，其是一種兩個(gè)3’端均具有1個(gè)突出的dT的線性化質(zhì)粒載體，所述T載體用于T-A克隆時(shí)，即使T載體自連也不會(huì)因陽性克隆篩選標(biāo)記基因移碼而產(chǎn)生假陽性克??；其特征在于所述T載體供插入3’端突出一個(gè)dA的PCR片段的位點(diǎn)，即線性化T載體的兩個(gè)末端，位于陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子與其上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間。
2、 制備權(quán)利要求1所述無假陽性T載體的方法，其特征在于(1) 在通用克隆載體的陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子與其上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之 間通過定點(diǎn)突變引入一個(gè)單一的平末端酶切位點(diǎn)，即得所述T載體的前T載體；(2) 用相應(yīng)內(nèi)切酶在該位點(diǎn)切開所述前T載體，然后用DNA聚合酶在只有dTTP 為底物的條件下在已線性化的前T載體的兩個(gè)3'端添加一個(gè)突出的dT即可制備所述無假陽性T載體。
3、 制備權(quán)利要求1所述無假陽性T載體的方法，其特征在于(1) 設(shè)計(jì)并人工合成一段DNA片段，該DNA片段的序列具有下述特征a.該序列含 有兩個(gè)有一定間隔的、串聯(lián)的XcmI內(nèi)切酶位點(diǎn)；b.上游的XcmI位點(diǎn)的切點(diǎn)前最后一個(gè)核 苷酸為T，下游的XcmI位點(diǎn)的切點(diǎn)前最后一個(gè)核苷酸為A; c.這兩個(gè)XcmI位點(diǎn)序列內(nèi)切 點(diǎn)前的序列中分別包含一個(gè)相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)；d.上游XcmI位點(diǎn)序列的后八個(gè)核苷酸 序列是下游Xcm I位點(diǎn)序列的前八個(gè)核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列；在通用克隆載體的陽性克 隆篩選標(biāo)記基因的起始密碼子與其上游的啟動(dòng)子之間引入上述合成DNA片段即得所述T載 體的前T載體；(2) 用XcmI在這兩個(gè)位點(diǎn)切開所述前T載體，純化回收線性化的載體大片段即可制備 所述無假陽性T載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于克隆PCR片段的無假陽性T載體及制備，其是一種兩個(gè)3’端均具有1個(gè)突出的dT的線性化質(zhì)粒載體，所述T載體供插入3’端突出一個(gè)dA的PCR片段的位點(diǎn)，即線性化T載體的兩個(gè)末端，位于陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子與其上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間。按本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)建的T載體在用于克隆PCR片段時(shí)，不會(huì)因?yàn)門載體自連導(dǎo)致的陽性克隆篩選標(biāo)記基因移碼而產(chǎn)生假陽性克隆。本T載體克服了現(xiàn)有T載體在應(yīng)用中因載體自連而產(chǎn)生假陽性克隆的技術(shù)機(jī)制弊端。因此，從技術(shù)機(jī)制上說(即排除其它實(shí)驗(yàn)因素的干擾)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的T載體應(yīng)用于T-A克隆時(shí)假陽性克隆率為零。
文檔編號(hào)C12N15/64GK101503698SQ20091010333
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者躍 馬 申請(qǐng)人:西南大學(xué)