專利名稱：漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法，特別涉及漏聲表面波
(leaky surface acoustic wave, LSAW )核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因快速檢測(cè)已成為臨床病原學(xué)早期診斷的 重要手段之一。核酸傳感器由于具有高效、靈敏、特異、結(jié)構(gòu)小巧、經(jīng)濟(jì)實(shí)用 等特點(diǎn)，將在基因快速檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
LSAW核酸傳感器是利用壓電晶體的特殊切向(如Y方向切割36度旋轉(zhuǎn)， X方向傳播LSAW)激勵(lì)出LSAW，當(dāng)LSAW傳播路徑表面的質(zhì)量負(fù)載發(fā)生微 小改變即晶體表面固定的探針與靶序列發(fā)生雜交反應(yīng)時(shí)，晶體表面的邊界條件 將發(fā)生改變，導(dǎo)致LSAW傳播的相位發(fā)生相應(yīng)改變，此時(shí)從傳感器輸出換能器 提取的電信號(hào)的相位變化，即可敏感地檢測(cè)出與晶體表面固定的探針發(fā)生特異 性反應(yīng)的耙序列。
科學(xué)地判定雜交反應(yīng)的起點(diǎn)和終點(diǎn)是LSAW核酸傳感器應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢 測(cè)的基礎(chǔ)。只有在正確判定雜交反應(yīng)起點(diǎn)和終點(diǎn)的前提下，才能得到準(zhǔn)確的檢 測(cè)數(shù)據(jù)，才能準(zhǔn)確反映數(shù)據(jù)本身代表的生物學(xué)意義，進(jìn)而進(jìn)行各種分析統(tǒng)計(jì)。
LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)起始階段的相位變化既包括靶序列和探針雜交 反應(yīng)所引起的相位變化，又包括加樣所引起的相位變化。由于不同操作人員的 加樣力度和手法差異，傳感器相位曲線在雜交反應(yīng)起始階段通常呈多樣性表現(xiàn)， 具體為有加樣沖擊峰或無(wú)加樣沖擊峰，且沒有明顯的標(biāo)志性反應(yīng)起點(diǎn)，這給雜 交反應(yīng)起點(diǎn)的判定造成較大困難。此外，傳統(tǒng)的雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定主要依靠 目測(cè)，往往造成檢測(cè)結(jié)果的人為誤差，從而極大地影響了4企測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和2009 重復(fù)性。
因此，建立一種簡(jiǎn)便快速、實(shí)時(shí)準(zhǔn)確的LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的
判定方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種筒便快速、實(shí)時(shí)準(zhǔn)確的LSAW核酸 傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法，可以避免目測(cè)判定中主觀因素造成的人為誤 差，極大地提高傳感器的檢測(cè)準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈每文度。
為達(dá)到此目的，本發(fā)明的LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法，將 傳感器采集的相位信號(hào)用正交小波基進(jìn)行6尺度小波分解，從第1尺度細(xì)節(jié)信 號(hào)dl中找出小波變換模極大值點(diǎn)，若該模極大值點(diǎn)在其它5尺度細(xì)節(jié)信號(hào)d2 d6 中相似位置均有對(duì)應(yīng)的模極大值點(diǎn)，則判定該點(diǎn)為雜交反應(yīng)起點(diǎn)。
進(jìn)一步，當(dāng)傳感器采集的相位信號(hào)中有加樣沖擊峰時(shí)，采用db5正交小波 基進(jìn)行6尺度小波分解；
進(jìn)一步，當(dāng)傳感器采集的相位信號(hào)中無(wú)加樣沖擊峰時(shí)，采用dbl正交小波 基進(jìn)行6尺度小波分解。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明為L(zhǎng)SAW核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定 提供了一種統(tǒng)一、客觀、科學(xué)的方法，可以避免傳統(tǒng)目測(cè)判定中主觀因素造成 的人為誤差，極大地提高傳感器的檢測(cè)準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度，且具有簡(jiǎn)便、 快速、實(shí)時(shí)的特點(diǎn)，有著重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為后期自動(dòng)判讀軟件的編寫和 傳感器的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖1~圖3為有加樣沖擊峰的情況
圖l顯示加入耙序列后傳感器的相位變化；
圖2顯示加入靶序列瞬間傳感器的相位變化；
圖3顯示傳感器采集的原始相位信號(hào)及小波變換后各子代信號(hào)頻譜。圖4~圖6為無(wú)加樣沖擊峰的情況
圖4顯示加入耙序列后傳感器的相位變化；
圖5顯示加入耙序列瞬間傳感器的相位變化；
圖6顯示傳感器采集的原始相位信號(hào)及小波變換后各子代信號(hào)頻譜。
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā) 明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。 一、實(shí)驗(yàn)材料
1、 LSAW傳感器
在同一塊鉭酸鋰(LiTa03)晶體上制備才企測(cè)和參比兩個(gè)通道，每個(gè)通道由一 個(gè)LSAW諧振器構(gòu)成；LiTa03晶體為Y方向切割36度旋轉(zhuǎn)，X方向傳播LSAW; 金膜和LiTa03晶體之間是金屬鉻；叉指換能器是用真空鍍膜的方法先在基片表 面鍍制一層金屬膜，再利用光刻技術(shù)刻出叉指電極的圖形。
2、 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及相位記錄分析軟件
使用多功能網(wǎng)絡(luò)分析儀(日本ADVANTEST公司R3767CG型)采集實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)；自行研發(fā)的相位記錄分析軟件BSMS 1.0具有實(shí)時(shí)記錄相位變化，自動(dòng)繪 制相位變化趨勢(shì)圖及分析結(jié)果等功能。
3、 主要試劑
人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因雙體肽核酸(bis-PNA )探針序列5'-SH-(CH2)6-(Lys)3-ttttcttcct-(egl)3-tccttctttt-Lys-3， (SH為統(tǒng)u基，Lys為賴氨酸，egl為linker分 子)，由成都川抗派德生物醫(yī)藥科技有限公司合成。
pBR322-HPV18質(zhì)粒購(gòu)自ATCC公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自博大泰克公司； 膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；限制性核酸內(nèi)切酶五coR I購(gòu)自TaKaRa^^司。
PBS緩沖液Na+濃度為20mmol/L, pH為6.6,含有濃度為lmmol/L的乙 二胺四乙酸。piranha液由質(zhì)量百分濃度為30%的過氧化氫和濃&804按體積比為i : 3混合而得。
二、 實(shí)'驗(yàn)方法
1 、 LiTa03晶振金膜表面的預(yù)處理
在LiTa03晶振金膜表面滴加少許piranha液，浸泡10分鐘，超純水反復(fù)清 洗，再依次用濃度為lmol/L的NaOH和濃度為lmol/L的HC1各浸泡10分鐘， 超純水反復(fù)清洗，氮?dú)獯蹈?，備用?br> 2、 LSAW傳感器的穩(wěn)定性檢測(cè)
將預(yù)處理后的LSAW傳感器以同軸電纜線聯(lián)入多功能網(wǎng)絡(luò)分析儀，室溫下 檢測(cè)兩個(gè)諧振器的插入損耗，將兩個(gè)諧振器的插入損耗調(diào)整至最小。
3 、 LSAW傳感器對(duì)HPV基因的實(shí)時(shí)檢測(cè) (1 ) HPV基因的抽提pBR322-HPV18質(zhì)粒含有HPV基因，用質(zhì)粒抽提 試劑盒抽提pBR322-HPV18質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用￡coR I酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒切膠回收純化HPV基因，具體操作按試劑盒說明 書進(jìn)行。
(2) HPV基因bis-PNA探針的固定將LSAW傳感器在空氣中穩(wěn)定30分 鐘后，檢測(cè)通道和參比通道各加入PBS緩沖液20jxL，穩(wěn)定30分鐘，檢測(cè)通道 再加入終濃度為2j^mol/L的HPV基因bis-PNA探針5(iL,室溫下反應(yīng)1小時(shí)使 探針固定在金膜表面，吸干溶液，去離子水清洗3次，氮?dú)獯蹈?，備用。參?通道不固定任何探針。
(3 ) HPV基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)將固定有HPV基因bis-PNA探針的LSAW傳 感器在空氣中穩(wěn)定至平衡，檢測(cè)通道和參比通道各加入PBS緩沖液20pL,穩(wěn)定 10分鐘，再各加入終濃度為100jig/L的HPV基因25|iL進(jìn)行雜交反應(yīng)，計(jì)算機(jī) 自動(dòng)采集兩個(gè)通道的相位變化數(shù)據(jù)。
三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定
在分析LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)起始階段的信號(hào)變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，傳感器 的相位信號(hào)為典型的非平穩(wěn)信號(hào)，是由許多不同頻率組成的復(fù)雜信號(hào)。該信號(hào)
6在某一段時(shí)間內(nèi)是連續(xù)變化的，這種變化可以分為慢變化(對(duì)應(yīng)低頻部分)和 快變化(對(duì)應(yīng)高頻部分)兩部分，慢變化(低頻)部分包含了信號(hào)的主要信息。 非平穩(wěn)信號(hào)的既往研究結(jié)果顯示，通過小波變換分析信號(hào)奇異點(diǎn)可以準(zhǔn)確判定 信號(hào)起點(diǎn)。
數(shù)學(xué)上稱無(wú)限次可導(dǎo)函數(shù)是光滑的或沒有奇異性，若函數(shù)在某點(diǎn)有間斷或 某階導(dǎo)數(shù)不連續(xù)，則稱函數(shù)在此點(diǎn)有奇異性，該點(diǎn)就是奇異點(diǎn)。因此，奇異點(diǎn) 即信號(hào)中的突變點(diǎn)。
小波變換是時(shí)間-頻率的局部化分析，它通過伸縮平移運(yùn)算對(duì)信號(hào)逐步進(jìn)行 多尺度細(xì)化，最終達(dá)到高頻處時(shí)間細(xì)分，低頻處頻率細(xì)分，從而可聚焦到信號(hào) 的任意細(xì)節(jié)。當(dāng)小波函數(shù)可看作某一平滑函數(shù)的一階導(dǎo)數(shù)時(shí)，信號(hào)小波變換模
的局部極值點(diǎn)對(duì)應(yīng)于信號(hào)的突變點(diǎn)；當(dāng)小波函數(shù)可看作某一平滑函數(shù)的二階導(dǎo) 數(shù)時(shí)，信號(hào)小波變換模的過零點(diǎn)對(duì)應(yīng)于信號(hào)的突變點(diǎn)；因此，采用檢測(cè)小波變 換模的局部極值點(diǎn)或過零點(diǎn)的方法可以檢測(cè)信號(hào)的突變點(diǎn)。比較來(lái)說，用局部 極值點(diǎn)的方法進(jìn)行檢測(cè)更具優(yōu)越性。因此，本發(fā)明采用檢測(cè)小波變換模的局部 極值點(diǎn)的方法判定雜交反應(yīng)的起點(diǎn)。
LSAW核酸傳感器是通過叉指換能器采集相位信號(hào)。發(fā)明人分析大量數(shù)據(jù)后 發(fā)現(xiàn)，將叉指換能器采集的相位信號(hào)進(jìn)行多尺度小波分解，各尺度細(xì)節(jié)信號(hào)的 波形相似，且信號(hào)奇異點(diǎn)也在相似位置同時(shí)出現(xiàn)，而噪音的產(chǎn)生是雜亂無(wú)章的， 其產(chǎn)生的奇異點(diǎn)不會(huì)在相似位置同時(shí)出現(xiàn)。因此，在多尺度細(xì)節(jié)信號(hào)中相似位 置出現(xiàn)且幅度近似的奇異點(diǎn)就是信號(hào)的突變點(diǎn)。
一4t信號(hào)奇異性分為兩種情況 一種是信號(hào)在某一時(shí)刻其幅值發(fā)生突變， 引起信號(hào)的不連續(xù)，信號(hào)的突變處稱為第一類間斷點(diǎn)；另一種是信號(hào)外觀上很 光滑，幅值沒有發(fā)生突變，但是信號(hào)的一階微分有突變產(chǎn)生且一階不連續(xù)，信 號(hào)的突變處稱為第二類間斷點(diǎn)。分析LSAW核酸傳感器采集的相位信號(hào)，可見有 加樣沖擊峰時(shí)屬于第一種情況，無(wú)加樣沖擊峰時(shí)屬于第二種情況。
利用小波變換檢測(cè)信號(hào)奇異點(diǎn)時(shí)，應(yīng)選擇合適的小波函數(shù)和尺度。如果尺度選擇太小，則受噪聲的影響較大；如果尺度選擇過大，則信號(hào)突變點(diǎn)所對(duì)應(yīng)
的小波變換模極大值的幅度衰減較厲害，將使信號(hào)的突變特征不明顯甚至消失。
基于上述認(rèn)識(shí)，發(fā)明人根據(jù)LSAW核酸傳感器相位信號(hào)響應(yīng)的特點(diǎn)，用 MATLAB 7.0語(yǔ)言編寫程序，利用小波變換和小波奇異性檢測(cè)原理，對(duì)傳感器 采集的相位信號(hào)運(yùn)用正交小波基進(jìn)行多尺度小波分解以檢測(cè)雜交反應(yīng)起點(diǎn)。根 據(jù)小波變換檢測(cè)第一類間斷點(diǎn)的原理，研究發(fā)現(xiàn)，有加樣沖擊峰時(shí)，采用db5 小波基進(jìn)行6尺度小波分解，可以非常清楚地觀察到信號(hào)的突變點(diǎn)。根據(jù)小波 變換檢測(cè)第二類間斷點(diǎn)的原理，研究發(fā)現(xiàn)，采用dbl小波基進(jìn)行6尺度小波分 解，可以非常清楚地觀察到信號(hào)的突變點(diǎn)。具體結(jié)果如下
1、 有加樣沖擊峰的情況
(1) 傳感器采集的相位信號(hào)
圖1顯示了加入耙序列后傳感器的相位變化，圖2顯示了加入耙序列瞬間 傳感器的相位變化，其中，S1 S2段是傳感器在加入耙序列前的液相穩(wěn)定狀態(tài)， 在S2點(diǎn)時(shí)加入耙序列進(jìn)行雜交反應(yīng)，S2 R1段為加樣沖擊峰，Rl-R2段反映雜 交反應(yīng)的全過程；如圖所示，加樣沖擊力使相位陡降至Q點(diǎn)，隨著加樣完成， 沖擊力消失，相位又反彈，由于非特異性吸附的影響，相位不會(huì)反彈至S2的高 度，而是略低于此高度的Rl點(diǎn)；雜交反應(yīng)實(shí)際是在Q-R1段時(shí)間內(nèi)開始，在相 位曲線上雖然有明顯的雜交反應(yīng)起始特征，但沒有精確的標(biāo)志性反應(yīng)起點(diǎn)。
(2) 相位信號(hào)的小波變換
采用db5小波基對(duì)傳感器采集的相位信號(hào)進(jìn)行6尺度小波分解，結(jié)果如圖3所 示，其中a6為原始相位信號(hào)，dl d6為小波變換后的各子帶信號(hào)；從第l尺度細(xì) 節(jié)信號(hào)dl中可以看出，相位信號(hào)在？= 576秒處具有模極大值點(diǎn)，信號(hào)的不連續(xù)性 相當(dāng)明顯，且其余5尺度細(xì)節(jié)信號(hào)d2 d5也在大致相同的位置清晰地顯示出模極 大值點(diǎn)。因此，判定該點(diǎn)為雜交反應(yīng)起點(diǎn)。
2、 無(wú)加樣沖擊峰的情況 (1)傳感器采集的相位信號(hào)圖4顯示了加入耙序列后傳感器的相位變化，圖5顯示了加入耙序列瞬間 傳感器的相位變化，其中，Sl-S2段是傳感器在加入耙序列前的液相穩(wěn)定狀態(tài)， 在S2點(diǎn)時(shí)加入耙序列進(jìn)行雜交反應(yīng)，與圖2不同的是，圖5在加入靶序列后沒 有出現(xiàn)明顯的加樣沖擊峰，S2-R段較好地反映了雜交反應(yīng)的全過程，但在S2-R 段曲線上沒有出現(xiàn)明顯的標(biāo)志性反應(yīng)起點(diǎn)。 (2)相位信號(hào)的小波變換
釆用dbl小波基對(duì)傳感器采集的相位信號(hào)進(jìn)行6尺度小波分解，結(jié)果如圖6 所示，其中a6為原始相位信號(hào)，dl d6為小波變換后對(duì)應(yīng)的各子帶信號(hào)；從第 1尺度細(xì)節(jié)信號(hào)dl中可以看出，相位信號(hào)在1339秒處具有模極大值點(diǎn)，信 號(hào)的不連續(xù)性相當(dāng)明顯，其余5尺度細(xì)節(jié)信號(hào)d2 d5也在大致相同的位置清晰 地顯示出模極大值點(diǎn)。因此，判定該點(diǎn)為雜交反應(yīng)起點(diǎn)。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管
人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1、漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法，其特征在于將傳感器采集的相位信號(hào)用正交小波基進(jìn)行6尺度小波分解，從第1尺度細(xì)節(jié)信號(hào)d1中找出小波變換模極大值點(diǎn)，若該模極大值點(diǎn)在其它5尺度細(xì)節(jié)信號(hào)d2～d6中相似位置均有對(duì)應(yīng)的模極大值點(diǎn)，則判定該點(diǎn)為雜交反應(yīng)起點(diǎn)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法， 其特征在于當(dāng)傳感器釆集的相位信號(hào)中有加樣沖擊峰時(shí)，采用db5正交小波 基進(jìn)行6尺度小波分解。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法， 其特征在于當(dāng)傳感器采集的相位信號(hào)中無(wú)加樣沖擊峰時(shí)，采用dbl正交小波 基< 進(jìn)行6尺度小波分解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定方法，將傳感器采集的相位信號(hào)用正交小波基進(jìn)行6尺度小波分解，從第1尺度細(xì)節(jié)信號(hào)d1中找出小波變換模極大值點(diǎn)，若該模極大值點(diǎn)在其它5尺度細(xì)節(jié)信號(hào)d2～d6中相似位置均有對(duì)應(yīng)的模極大值點(diǎn)，則判定該點(diǎn)為雜交反應(yīng)起點(diǎn)；本發(fā)明為漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)起點(diǎn)的判定提供了一種統(tǒng)一、客觀、科學(xué)的方法，可以避免傳統(tǒng)目測(cè)判定中主觀因素造成的人為誤差，極大地提高傳感器的檢測(cè)準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度，且具有簡(jiǎn)便、快速、實(shí)時(shí)的特點(diǎn)，有著重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為后期自動(dòng)判讀軟件的編寫和傳感器的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12M1/34GK101633892SQ20091010473
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者府偉靈, 張立群, 玨 王, 王云霞, 鳴 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院