專利名稱：一種添加脂肪醇聚氧丙烯醚制備l-丙氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種添加脂肪醇聚氧丙烯醚制 備L-丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L一丙氨酸(L-Alanine)亦稱α —氨基丙酸，是生命體內(nèi)與糖代謝密切相關(guān)、需求 量較多的氨基酸之一，已在醫(yī)藥、食品及化工等行業(yè)中得到廣泛應用，如用作制造氨基酸營 養(yǎng)輸液、維生素Β6、合成泛酸鈣、氨基酸纖維和其它有機化合物的原料，還可作為呈鮮劑、調(diào) 味劑、酸味劑、抗氧化劑、誘食劑、除草劑，也是合成低熱營養(yǎng)甜味劑-阿力甜的主要原料。 其生產(chǎn)已成為繼谷氨酸、賴氨酸之后的又一重要的氨基酸產(chǎn)業(yè)。在國外，日本的味之素公司從1978年開始規(guī)模化生產(chǎn)L-丙氨酸，方法也由提取 法，化學合成法，發(fā)展到以L-天冬氨酸(L-Asp)為原料，采用L-天冬氨酸-β-脫羧酶轉(zhuǎn)化 的生物反應法生產(chǎn)。采用化學合成法收率，本高，產(chǎn)品質(zhì)量差，并且存在嚴重的污染性，而 采用生物反應法由于簡潔的工藝流程，較少的設(shè)備投資引起研究和投資者的關(guān)注并逐漸采用。目前普遍使用的整體細胞酶催化L-丙氨酸生產(chǎn)工藝中，制酶技術(shù)水平的高低是 一個關(guān)鍵，它占據(jù)了生產(chǎn)成本的較大比重。由于生產(chǎn)菌種的特性決定了有部分L-天冬氨 酸-β -脫羧酶是存在菌體內(nèi)的。如用諸如超聲波等處理菌體細胞時，細胞壁被破壞，酶釋 放出來，酶活力顯著提高。但現(xiàn)有生產(chǎn)工藝條件限定了不能采用破壁技術(shù)，因此這部份所謂 的胞內(nèi)酶，在生產(chǎn)中是沒有被利用而浪費掉，非常可惜。所以，如何改進制酶工藝，降低制酶 和生產(chǎn)成本是現(xiàn)有生產(chǎn)工藝改進的重點方向。脂肪醇聚氧丙烯醚是一種非離子表面活性劑，淺黃色透明油狀液體，難溶于水，易 溶于丙酮和其他有機溶劑，能顯著降低溶劑表面張力和液_液界面張力，具有親水、親油的 性質(zhì)，能起乳化、分散、增溶、洗滌等一系列作用，是一種良好的乳化劑、組織改良劑和潤滑 劑。在菌種產(chǎn)酶或酶促反應時添加一定量的脂肪醇聚氧丙烯醚，可以顯著提高L-天冬氨 酸-β-脫羧酶胞外酶活力及酶促轉(zhuǎn)化反應的穩(wěn)定性，增加酶的實際使用效率。此技術(shù)呈現(xiàn) 較好的應用前景，它可以在不需要改變原有工藝路線和設(shè)備的情況下，以較低的成本，增加 有效酶的產(chǎn)量，從而提高單批次投料量，縮短反應時間，提高現(xiàn)有設(shè)備利用率和產(chǎn)能，同時 顯著地降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用脂肪醇聚氧丙烯醚改進的L-丙氨酸制備方法，它 能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提高有效酶活力及酶促轉(zhuǎn)化反應的穩(wěn)定性，縮短反應周期，提 高設(shè)備利用率和產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所采用的技術(shù)方案為一種添加脂肪醇聚氧丙烯醚制備L-丙氨酸的方法，包括如下步驟
1)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌種(保藏號20147)，接入pH7. O的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化鈉0. 5g，瓊脂2g， 水 100ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶將所述活化的菌種接入pH 7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到 發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為富馬酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米漿6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 0. 05_2ml，水 1000ml。3)酶促轉(zhuǎn)化在所述酶液中添加0. 05-3ml的脂肪醇聚氧丙烯醚，pH值為4. 5-7. 5，溫度為 25°C-45°C的條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應，生成L一丙氨酸粗品。4)產(chǎn)品提取和精制將所述L一丙氨酸粗品加水3000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加30g活性炭脫色， 過濾，70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L一丙氨酸產(chǎn)品。所述脂肪醇聚氧丙烯醚為分析純試劑。本發(fā)明的有益效果是 1、脂肪醇聚氧丙烯醚用量少，價格便宜，可提高L-天冬氨酸_ β _脫羧酶有效酶活 力和酶促反應穩(wěn)定性，減少制酶成本。2、不需要改變原有工藝路線和設(shè)備，添加方式簡單，易操作，方便現(xiàn)有生產(chǎn)線的挖 潛改造。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述實施例11)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌種(保藏號20147)，接入pH7. 0的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化鈉0. 5g，瓊脂2g， 水 100ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶將所述活化的菌種接入pH 7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到 發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為富馬酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米漿6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 0. 05ml，水 1000ml。3)酶促轉(zhuǎn)化反應將底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚0. 05ml,控制 PH4. 5-7. 5，溫度25°C，攪拌反應6天，生成L一丙氨酸粗品。
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4)產(chǎn)品提取和精制將L一丙氨酸粗品加水3000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加30g活性炭脫色，過濾， 70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L一丙氨酸產(chǎn)品。實施例21)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌種(保藏號20147)，接入pH7. O的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化鈉0. 5g，瓊脂2g， 水 100ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶將所述菌種斜面1支接入pH 7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到 發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為富馬酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米漿6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 0. 2ml，水 1000ml。3)酶促轉(zhuǎn)化反應將底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚0. 3ml，控制 PH4. 5-7. 5，溫度30°C，攪拌反應7天，生成L一丙氨酸粗品。4)產(chǎn)品提取和精制將L一丙氨酸粗品加水3000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加30g活性炭脫色，過濾， 70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L一丙氨酸產(chǎn)品。實施例31)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌種(保藏號20147)，接入pH7. 0的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化鈉0. 5g，瓊脂2g， 水 100ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶將所述活化的菌種接入pH 7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到 發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為富馬酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米漿6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 1ml，水 1000ml。3)酶促轉(zhuǎn)化反應將底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚1. 5ml，控制 PH4. 5-7. 5，溫度35°C，攪拌反應7天，生成L一丙氨酸粗品。4)產(chǎn)品提取和精制將L一丙氨酸粗品加水3000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加30g活性炭脫色，過濾， 70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L一丙氨酸產(chǎn)品。實施例41)菌種培養(yǎng)
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將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌種(保藏號20147)，接入pH7. O的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化鈉0. 5g，瓊脂2g， 水 100ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶將所述活化的菌種接入pH 7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到 發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為富馬酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米漿6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 2ml，水 1000ml。3)酶促轉(zhuǎn)化反應將底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚3ml，控制 PH4. 5-7. 5，溫度45°C，攪拌反應8天，生成L一丙氨酸粗品。4)產(chǎn)品提取和精制將L一丙氨酸粗品加水3000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加30g活性炭脫色，過濾， 70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L一丙氨酸產(chǎn)品。上述實施例中，底物L-天冬氨酸的投入、產(chǎn)物L-丙氨酸的產(chǎn)出、摩爾轉(zhuǎn)化率、提取
收率結(jié)果如下
指標實施例1實施例2實施例3實施例4L-天冬氨酸2820350537054320L-丙氨酸1645207022102520摩爾轉(zhuǎn)化率98%97%97%99%提取收率89%91%92%90%
權(quán)利要求
一種添加脂肪醇聚氧丙烯醚制備L 丙氨酸的方法，包括菌種培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶和酶促轉(zhuǎn)化反應、產(chǎn)品提取和精制步驟，其特征在于，所述發(fā)酵產(chǎn)酶和酶促轉(zhuǎn)化反應的具體條件為發(fā)酵產(chǎn)酶將活化的菌種接入pH 7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為富馬酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8.5g，玉米漿6.5g，KH2PO40.3g，MgSO40.2g，脂肪醇聚氧丙烯醚0.05 2ml，水1000ml，酶促轉(zhuǎn)化在所述酶液中添加0.05 3ml的脂肪醇聚氧丙烯醚，pH值為4.5 7.5，溫度為25℃ 45℃的條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應，生成L 丙氨酸粗品。
全文摘要
一種添加脂肪醇聚氧丙烯醚制備L-丙氨酸的方法，包括菌種培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶和酶促轉(zhuǎn)化反應、產(chǎn)品提取和精制步驟，所述發(fā)酵產(chǎn)酶是將活化的菌種接入添加0.05-2ml的脂肪醇聚氧丙烯醚pH7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液，所述酶促轉(zhuǎn)化反應是在所述酶液中添加0.05-3ml的脂肪醇聚氧丙烯醚，pH值為4.5-7.5，溫度為25℃-45℃的條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應，生成L-丙氨酸粗品。該生產(chǎn)工藝簡單、易于操作，適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P13/06GK101914583SQ20091011467
公開日2010年12月15日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者何鑫平, 吳孔陽, 夏小斌, 康超, 彭康, 曹喜秀, 曹普美, 李湘萍, 李燦明, 李秋蓉, 梁智群, 梁耀星, 汪晟, 白山, 黃時海 申請人:廣西大學