專利名稱：一種螢火蟲熒光素酶及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種螢火蟲熒光素酶及制備方法，具體涉及一種螢火蟲熒光素 酶的氨基酸序列以及編碼該熒光素酶的DNA分子的堿基序列，利用含有該 DNA分子的重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體制備螢火蟲熒光素酶的方法。
背景技術(shù)：
螢火蟲熒光素酶(firefly hiciferase)屬氧化還原酶類，是一種能將化學(xué)能 轉(zhuǎn)化為光能的高效生物催化劑，該螢火蟲熒光素酶在ATP、 Mg^和氧氣存在時， 以熒光素(hiciferin)為底物，進(jìn)行氧化反應(yīng)，發(fā)出光子。ATP是所有生物體都 具有的一種重要的能量化學(xué)物質(zhì)。ATP生物發(fā)光計數(shù)法利用了 ATP與螢火蟲熒 光素-熒光素酶復(fù)合物的特異生化反應(yīng)來測定樣品中ATP的含量當(dāng)熒光素底物 和熒光素酶處于過量飽和的情況下，每一分子ATP釋放出一個光子，因此光的 強(qiáng)度與檢測樣本中ATP的水平成正比；高靈敏的ATP熒光檢測儀能及時讀取釋 放光子的數(shù)量，以相對發(fā)光強(qiáng)度(RLUs)來顯示ATP的含量，因此這種發(fā)光特 性使得螢火蟲熒光素酶能夠在各種各樣測定ATP的研究中廣泛應(yīng)用。
早期螢火蟲熒光素酶的獲得主要通過從螢火蟲發(fā)光器官中提純得到。Dewet J.R.等于1985年首次克隆了北美螢火蟲(P. Pyralis)的熒光素酶基因，并在大 腸桿菌中表達(dá)，得到具有生物活性的熒光素酶。與自然提取得到的熒光素酶相 比，具有同樣的反應(yīng)動力學(xué)特性和發(fā)射波長，在相同反應(yīng)條件下酶穩(wěn)定性也沒 有差異。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有各種重組熒光素酶表達(dá)載體和表達(dá) 產(chǎn)物應(yīng)用于各研究領(lǐng)域，但從已有的報道來看，此類重組熒光素酶暴露在外界 時會迅速失去活性，酶活性穩(wěn)定性低，而且需要各種層析技術(shù)分離純化，導(dǎo)致 現(xiàn)有的螢火蟲熒光素酶的制備方法步驟煩瑣，耗時，操作麻煩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的螢火蟲熒光素酶，該酶比自然提取到 的熒光素酶或者重組的自然熒光素酶具有更高的酶活性穩(wěn)定性，這是通過在自 然的熒光素酶蛋白的N端加了一段氨基酸片斷形成的，形成的融合蛋白稱為 AGG-Luc融合蛋白，這種新的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
本發(fā)明的第二個目的是提供編碼本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶的DNA分子， 這是一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的螢火蟲熒光素酶基因片斷，稱為Luc基因，其核苷 酸序列如序列表中的序列1所示，其編碼的序列是從序列1的5'末端1-1632 位核苷酸。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種重組表達(dá)載體以及將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn) 入宿主細(xì)胞得到的轉(zhuǎn)化體，該重組表達(dá)載體包含編碼螢火蟲熒光素酶的DNA 分子，該DNA分子以能夠表達(dá)本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶的形式存在，這樣該 DNA分子導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)化體后，在加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑的條件下， 在轉(zhuǎn)化體中按照需要表達(dá)蛋白。
作為一種優(yōu)選的實施方式，該重組表達(dá)載體可為在pPLagg-l(蘇州浦隆生物有 限公司)的BamHI和HindIII位點間插入經(jīng)過密碼子優(yōu)化的北美螢火蟲(P. Pyralis)熒光素酶基因(Luc基因)第1-1632位脫氧核糖核苷酸得到 pPLagg-l-Luc。在pPLagg-l-Luc表達(dá)載體中，螢火蟲熒光素酶基因位于高效啟 動子T7和乳糖操縱子下游，在beta-異丙基-巰基半乳糖苷(IPTG)存在時能被 高效誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，并翻譯生成AGG-Luc融合蛋白。大腸桿菌BL21 ( DE3 ) (Stratagene公司)是一個合適的宿主，可以將pPLagg-l-Luc重組表達(dá)載體穩(wěn) 定地整合到其染色體組中，并受控于乳糖操縱子，因此大腸桿菌BL21 (DE3) 與pPLagg-l-Luc重組表達(dá)載體相容，在得到重組菌株BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)得到重組AGG-Luc融合蛋白。大腸桿菌BL21 (DE3) -pPLagg-Luc，可在 含有蛋白胨、酵母提取物等的豐富培養(yǎng)基中生長，菌體產(chǎn)量大，蛋白表達(dá)率高。 本發(fā)明的第四個目的是提供一種螢火蟲熒光素酶的制備方法，含有Luc基因 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后，得到含有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體，經(jīng)培養(yǎng)、 誘導(dǎo)和純化后得到重組AGG-Luc融合蛋白。重組表達(dá)的AGG-Luc融合蛋白在 N端含有AGG蛋白，提高了表達(dá)產(chǎn)物的可溶性和穩(wěn)定性，AGG蛋白可在高鹽 條件下沉淀，通過離心即可分離純化重組AGG-Luc融合蛋白，該制備方法操作 簡單，省時，效率高。
本發(fā)明利用大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的螢火蟲熒光素酶基因，構(gòu)建重組表 達(dá)載體pPLagg-l-Luc,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)得到工程菌株，利用高 鹽條件進(jìn)行高效純化，無需任何層析介質(zhì)，制備方法快速高效，制得的螢火蟲 熒光素酶的酶活穩(wěn)定性得到提高?；鹣x熒光素酶的試劑和應(yīng)用該試 劑的測試試劑盒，本發(fā)明還提供了檢測方法，在檢測方法中ATP的檢測是使 用了螢火蟲熒光素酶的試劑，它是本領(lǐng)域已知的，特征在于螢火蟲熒光素酶是 一種本發(fā)明的蛋白，本發(fā)明的酶蛋白與自然提取的螢火蟲熒光素酶或者重組自 然提取的螢火蟲熒光素酶相比，酶活可達(dá)2.2X101C)RLU/ing。本發(fā)明的蛋白、DNA、載體和轉(zhuǎn)化體將通過參照下面的非限制性實施例、 圖、表以及序列表，以示例的方式描述。


圖1為本發(fā)明中的工程菌株BL21 (DE3) -pPLagg-Luc分別在IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下的10%SDS-PAGE電泳圖；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；U:未誘導(dǎo)條件下；I:誘導(dǎo)條件下；圖2為重組螢火蟲熒光素酶純化過程中各步驟產(chǎn)物的10% SDS-PAGE電泳圖；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；S:純化前的上清液；SI:第一次離心后的上 清液；D2:第三次離心后的沉淀；S2第二次離心后的上清液；P:最終純 化產(chǎn)物；圖3為利用本發(fā)明闡述的制備方法得到的重組螢火蟲熒光素酶與野生型 的螢火蟲熒光素酶活測定曲線。
具體實施方式
下面將結(jié)合附圖和序列表來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。1、 編碼螢火蟲熒光素酶的DNA分子的制備 DNA分子的合成采用一種熱動力學(xué)平衡的由內(nèi)向外的PCR基因合成方法(Thermodynamically balanced inside曙out (TBIO) PCR-based gene synthesis), 具體內(nèi)容參見Nucleic Acids Research, 2003， Vol. 31, No. 22，合成的DNA分子的 堿基序列如序列表中的序列l(wèi)所示。2、 重組螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體pPLagg-l-Luc的構(gòu)建 根據(jù)熒光素酶的cDNA全序列和表達(dá)載體pPLagg的多克隆位點序列，設(shè)計一對 特異性PCR引物pPLagg-Luc-S:5， GCGCGAATTCGCAGATAAGAATATTTTATATGGG 3" pPLagg- Luc-AS: 5'AGTCAAGCTTCCCATTGGTGTGTTTTTCTAA 3" 其中pPLagg-Luc-S中含有BamHI識別序列；pPLagg-Luc-AS中含有Hindlll識別序列。以熒光素酶的DNA分子為模板，用上述兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Liic 基因片段(編碼螢火蟲熒光素酶的基因)；PCR產(chǎn)物純化后，取2pg加入限制性 內(nèi)切酶BamHI和Hindlll各10U ( Takara公司)，37度完全酶切后進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳，用膠回收試劑盒(Axygen公司)回收約1.6kb的Lnc基因酶切片段； 取3fig pPLagg-l(蘇州浦隆生物有限公司)表達(dá)載體，同樣以BamHI和Hindlll 酶切并回收6.5kb載體DNA片段；按如下反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)lOOng Luc 基因酶切片段，lOng pPLagg-l載體酶切片段，T4DNA連接酶緩沖液ljil， T4 DNA連接酶(NEB公司)ljil， 20度連接反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化克隆宿主大腸桿菌DH5a,將重組菌涂布于含有100pg/ml 氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板，該平板中還含有酵母提取物、蛋白胨、NaCL等， 重組菌在平板中過夜生長后挑取單克隆，用質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen公司)提 取重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和DNA測序鑒定后得到pPLagg-l-Luc重組表達(dá)載體。 測序結(jié)果表明獲得的Luc基因的核苷酸序列是序列表中的序列1，其開放閱讀 框自序列表中序列1的5，端1至1632位脫氧核糖核苷酸，編碼序列表中序列2 的螢火蟲熒光素酶。3、制備重組螢火蟲熒光素酶融合蛋白1) 獲得含重組表達(dá)載體的工程菌株制備大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將pPLagg-l-Luc重組表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，然后將重組菌涂布于含有100ng/ml氨芐青霉素 的LB瓊脂平板，挑取單克隆，并以菌落PCR方法鑒定含有pPLagg-Luc重組 表達(dá)載體的BL21 (DE3)工程菌株，將該工程菌株命名為BL21 ( DE3) -pPLagg-Luc。2) 含表達(dá)載體的工程菌株的培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)接種BL21 (DE3) -pPLagg-Luc工程菌株至10ml含100ng/ml氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中，37度振蕩培養(yǎng)過夜；次日以l: 100接種至1L TB培養(yǎng)液中，37 度振蕩培養(yǎng)3小時，至OD600 (菌體密度)為0.6時，加入終濃度為0.5mM的 IPTG， 30度繼續(xù)震蕩培養(yǎng)5小時，誘導(dǎo)重組熒光素酶融合蛋白的表達(dá)，同時設(shè)立不加入IPTG的樣品作為對照，并進(jìn)行10%SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，誘 導(dǎo)劑IPTG能明顯誘導(dǎo)重組熒光素酶的表達(dá)，顯示為新出現(xiàn)一條約llOkD的特 異條帶，如圖l所示。3)重組熒光素酶融合蛋白的純化按上述步驟二的方法培養(yǎng)并誘導(dǎo)BL21 (DE3) -pPLagg-Luc工程菌株，收集 誘導(dǎo)5小時的培養(yǎng)菌液1L, 8000g室溫離心5分鐘，棄去上清；菌體沉淀用50ml buffer AGG-A (20mM THs-HCl， pH8.0; 2mM EDTA)重懸；懸浮液以8000g 室溫離心5分鐘，棄去上清；沉淀用50ml buffer AGG-B(50mM Tris曙HCl, pH8.0; 50mM NaCl， 5%甘油)重懸，懸浮液進(jìn)行超聲破碎(150W， 2分鐘)，16， OOOg 4度離心20分鐘，棄去沉淀，上清至冰上備用。在50ml超聲后上清液中(純化前的上清液S),加入25ml buffer AGG-C(5M NaCl),充分混勻后置37度5分鐘，15， OOOg室溫離心15分鐘，棄去上清(第 一次離心后的上清液Sl);沉淀用25ml buffer AGG-D ( 1.6 M NaCl)充分重懸 后，15， OOOg室溫離心15分鐘，棄去上清(第二次離心后的上清液S2);沉淀 以20ml buffer AGG-E ( 50mM Tris隱Cl, pH8.0; 50mM NaCl and 10%甘油) 充分重懸(第三次離心后的沉淀D2)， 15, OOOg離心15分鐘，棄去沉淀；收集 上清液(最終純化產(chǎn)物P)，進(jìn)行10%SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示最終純化產(chǎn)物 為一條約llOkD的特異條帶，且沒有其它雜帶，如圖2所示，與預(yù)期結(jié)果相符， 為了顯示高鹽條件下純化的過程，對純化前的上清液S、第一次離心后的上清液 Sl、第二次離心后的上清液S2、第三次離心后的沉淀D2也進(jìn)行10%SDS-PAGE 分析，如圖2所示。 4)酶的保存將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋中，在buffer AGG-F(20mM Tris-acetate， pH7.4; lmM DTT; lmM EDTA)透析24h;透析后經(jīng)Amicon離心濃縮管(Millipore 公司)濃縮后，加入甘油至終濃度為50%, -20度避光儲存。5)重組螢火蟲熒光素酶酶活的測定 對最終純化產(chǎn)物進(jìn)行酶活測定，取3次重復(fù)實驗值。酶活測定反應(yīng)條件lug純化產(chǎn)物，1Ommol/L熒光素，15mmol/L MgS04， 1Ommol/L DTT， 30mmol/L Tricine (pH7.8),力卩入不同濃度ATP,在25'C下 反應(yīng)10秒鐘，用Hipro AML-618發(fā)光檢測儀記錄10秒內(nèi)輸出的發(fā)光讀數(shù)即發(fā)光量RLU，以此來表示酶活，結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明的重組螢火蟲熒光素酶(圖中標(biāo)記為pAGG-Luc)的酶活性和穩(wěn)定性比野生型的螢火蟲熒光素酶(圖 中標(biāo)記為wide type Luc)高，酶活可達(dá)2.2 X 101QRLU/mg純化重組蛋白。SEQUENCE LISTING<110> 蘇州浦隆生物有限公司<120> —種螢火蟲熒光素酶及制備方法<160> 2<170>Patentln version 3.3<210> 1<211> 1632<212> DNA<213> 人工序列<400> 1atggcagata agaatatttt atatgggccc gaaccatttt atcccttgga agatgggacg 60gctggagaac agatgtttga cgcattatct cgttatgcag atattccggg ctgcatagca 120ttgacaaatg ctcatacaaa aga^aatgtt ttatatgaag agtttctgaa actgtcgtgt 180cgtttagcgg ssagttttaa aaagtatgga ttaaaacaaa acgacacaat agcggtgtgt 240agcgaaaata gtctgcaatt tttccttcct gtaattgcat cattgtatct tggaataatt 300gtggcacctg ttaacgataa atacattgaa cgtgaattaa tacacagtct tggt已ttgta 360aaaccacgca tagttttttg ctccaagaat acttttxaaa aagtactgaa tgtaaaatct 420犯attaaaat ctattgaaac t已ttattata ttagacttaa atgatgactt aggaggttat 480caatgcctca acaactttat ttctcaaaat tccgatagta atctggacgt aaaaaaattt 540aaaccstatt cttttaatcg agacgatcag gttgcgttga ttatgttttc 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tatctaaacg aacaaatcgt acaagattat 1500gttgccagtc aagtttcaac agccaaatgg ctacgtggtg gggtgatatt tttggatgaa 1560attcccasag gatcaactgg aaaaattgac agaaaagtgt taagacaaat gttagaaaaa 1620cacaccaatg gg 1632<210> 2<211> 544<212> PRT<213> 人工序列<400> 2Met Ala Asp Lys Asn lie Leu Tyr Gly Pro Glu Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp 15 10 15Gly Thr Ala Gly Glu Gin Met Phe Asp Ala Leu Ser Arg Tyr Ala Asp lie Pro 20 25 30 35Gly Cys lie Ala Leu Thr Asn Ala His Thr Lys Glu Asn Val Leu Tyr Glu Glu 40 45 50Phe Leu Lys Leu Ser Cys Arg Leu Ala Glu Ser Phe Lys Lys Tyr Gly Leu Lys 55 60 65 70Gin Asn Asp Thr lie Ala Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gin Phe Phe Leu Pro 75 80 85 90Val lie Ala Ser Leu Tyr Leu Gly lie lie Val Ala Pro Val Asn Asp Lys Tyr 95 100 105lie Glu Arg Glu Leu lie His Ser Leu Gly lie Val Lys Pro Arg lie Val Phe 110 115 120 125Cys Ser Lys Asn Thr Phe Gin Lys Val Leu Asn Val Lys Ser Lys Leu Lys Ser 130 135 140lie Glu Thr lie lie lie Leu Asp Leu Asn Asp Asp Leu Gly Gly Tyr Gin Cys 145 150 155 160Leu Asn Asn Phe lie Ser Gin Asn Ser Asp Ser Asn Leu Asp Val Lys Lys Phe 165 170 175 180Lys Pro Tyr Ser Phe Asn Arg Asp Asp Gin Val Ala Leu lie Met Phe Ser Ser 185 190 195Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Leu Thr His Lys Asn lie Val Ala 200 205 210 215Arg Phe Ser lie Ala Lys Asp Pro Thr Phe Gly Asn Ala lie Asn Pro Thr Ser 220 225 230Ala lie Leu Thr Val lie Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Met Thr Thr Leu 235 240 245 250Gly Tyr Phe Thr Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met His Thr Phe Glu Glu Lys 255 260 265 270Leu Phe Leu Gin Ser Leu Gin Asp Tyr Lys Val Glu Ser Thr Leu Leu Val Pro 275 280 285Thr Leu Met Ala Phe Leu Ala Lys Ser Ala Leu Val Glu Lys Tyr Asp Leu Ser 290 295 300 305His Leu Lys Glu lie Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu lie Gly Glu 310 315 320Met Val Lys Lys Arg Phe Lys Leu Asn Phe Val Arg Gin Gly Tyr Gly Leu Thr 325 330 335 340Glu Thr Thr Ser Ala Val Leu lie Thr Pro Lys Gly Asp Ala Lys Pro Gly Ser 345 350 355 360Thr Gly Lys lie Val Pro Phe His Ala Val Lys Val Val A印Pro Thr Thr Gly 365 370 375Lys lie Leu Gly Pro Asn Glu Pro Gly Glu Leu Tyr Phe Lys Gly Pro Met lie 380 385 390 395Met Lys Gly Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asp Asn Asp 400 405 410Gly Trp Leu Arg Ser Gly Asp lie Ala Tyr Tyr Asp Asn Asp Gly His Phe Tyr 415 420 425 430lie Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu lie Lys Tyr Lys Gly Tyr Gin Val Ala Pro 435 440 445 450Ala Glu lie Glu Gly lie Leu Leu Gin His Pro Tyr lie Val Asp Ala Gly Val 455 460 465Thr Gly lie Pro Asp Glu Ala Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Gly Val Val Val 470 475 480 485Gin Thr Gly Lys Tyr Leu Asn Glu Gin lie Val Gin Asp Tyr Val Ala Ser Gin 490 495 500Val Ser Thr Ala Lys Trp Leu Arg Gly Gly Val lie Phe Leu Asp Glu lie Pro 505 510 515 520Lys Gly Ser Thr Gly Lys lie Asp Arg Lys Val Leu Arg Gin Met Leu Glu Lys 525 530 535 540His Thr Asn Gly
權(quán)利要求
1、一種螢火蟲熒光素酶，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
2、 一種編碼權(quán)利要求1所述螢火蟲熒光素酶的DNA分子，其核苷酸序列 如序列表中的序列l(wèi)所示。
3、 包括權(quán)利要求2所述DNA分子的重組表達(dá)載體。
4、 包括權(quán)利要求2所述DNA分子的重組表達(dá)載體pPLagg-1-Luc。
5、 包括權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
6、 包括權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌BL21 (DE3) -pPLagg-Luc。
7、 一種制備如權(quán)利要求1所述螢火蟲熒光素酶的方法，包括將權(quán)利要求3 所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入寄主細(xì)胞，得到如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)轉(zhuǎn) 化體，誘導(dǎo)表達(dá)重組的螢火蟲熒光素酶后，在高鹽條件下沉淀該螢火蟲熒光素 酶，即得純化的螢火蟲熒光素酶。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的寄主細(xì)胞為大腸桿菌 BL21 (DE3),在上述的分離和純化步驟，包括(1) 在菌株裂解得到的粗提物中加入buffer AGG-C,充分混勻后置37度5 分鐘，15, 000g室溫離心15分鐘，棄去上清；(2) 沉淀用buffer AGG-D充分重懸后，15, 000g室溫離心15分鐘，棄去 上清；(3) 沉淀以buffer AGG-E充分重懸，15， 000g離心15分鐘，棄去沉淀； 收集上清液，即得到純化的螢火蟲熒光素酶；上述的buffer AGG-C包括5M NaCI; buffer AGG-D包括1.6 M NaCI; buffer AGG-E包括50mM Tris-Cl， pH8.0, 50mM NaCI ， 10%甘油。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于菌株裂解得到粗提物的步驟， 包括(1) 收集誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)菌液，8000g室溫離心5分鐘，棄去上清；(2) 菌體沉淀用buffer AGG-A重懸，懸浮液以8000g室溫離心5分鐘， 棄去上清；(3) 沉淀用buffer AGG-B重懸，懸浮液進(jìn)行超聲破碎，然后16, OOOg 4 度離心20分鐘，棄去沉淀，上清液至冰上備用，該上清夜即為粗提物；上述的buffer AGG-A包括20mM THs-HCl， pH8.0， 2mM EDTA; buffer AGG-B包括50mM Tris-HCl， pH8.0, 50mM NaCI, 5%甘油。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于在得到純化的螢火蟲熒光素酶后，保存該螢火蟲熒光素酶，在保存步驟中，將該純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋中，在buffer AGG-F中透析24h，透析后經(jīng)離心濃縮管濃縮后，加入甘油至終 濃度為50%， -20度避光儲存，上述的buffer AGG-F包括20mM Tris-acetate, pH7.4， ImMDTT, ImM EDTA。
11、 一種包含有如權(quán)利要求l所述螢火蟲熒光素酶的熒光試劑。
12、 一種通過測量ATP來進(jìn)行檢測的測試試劑盒，其特征在于該試劑盒 中包含如權(quán)利要求IO所述的熒光試劑。
13、 一種檢測方法，是通過測量ATP進(jìn)行的，其中ATP的測量是通過螢火 蟲熒光素和螢火蟲熒光素酶反應(yīng)發(fā)光進(jìn)行的，反應(yīng)產(chǎn)生的光的量與ATP的量有 關(guān)，其特征在于該檢測方法中，螢火蟲熒光素酶為權(quán)利要求1所述的螢火蟲 熒光素酶蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的螢火蟲熒光素酶，該酶是通過在自然的熒光素酶蛋白的N端加了一段氨基酸片斷形成的，這樣該酶比自然提取到的熒光素酶或者重組的自然熒光素酶具有更高的酶活性穩(wěn)定性，本發(fā)明還公開了一種編碼螢火蟲熒光素酶的DNA分子以及該熒光素酶的制備方法，利用熒光素酶DNA分子構(gòu)建重組表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，形成轉(zhuǎn)化體，在轉(zhuǎn)化體中誘導(dǎo)表達(dá)得到重組熒光素酶，然后通過高鹽沉淀進(jìn)行分離純化。在高鹽條件下沉淀出重組熒光素酶后，通過離心即可分離純化出該熒光素酶，則該酶的制備方法操作簡單，省時，效率高。
文檔編號C12N9/02GK101633917SQ20091011594
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者吳一凡, 濱 王 申請人:蘇州浦隆生物有限公司